劉逸塵，何雨欣，張亦陳，孫金生

（天津師范大學生命科學學院，天津 300387）

生物性狀的表達不僅受基因控制，還受環(huán)境的影響.在環(huán)境影響下，生物基因未改變但表型發(fā)生可遺傳變化的現(xiàn)象稱為表觀遺傳，涉及DNA甲基化、組蛋白修飾、染色體重塑、非編碼RNA調(diào)控等過程，其中研究最為廣泛的是DNA甲基化[1].DNA甲基化是DNA的修飾方式之一，常見的修飾方式為DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）催化S-甲硫腺苷（SAM）的1個甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶（C）5號碳原子上，產(chǎn)生5-甲基化胞嘧啶（5mC），這種修飾作用可以影響轉(zhuǎn)錄因子、甲基化結(jié)合蛋白以及染色體結(jié)構(gòu)，從而影響基因表達，參與轉(zhuǎn)座因子沉默、基因組印記和X染色體失活等多種生物學過程.動物中最常見的為CpG二核苷酸位點中的甲基化，但基因組DNA甲基化的實際模式是高度可變的，尤其是在脊椎動物和無脊椎動物之間.無脊椎動物具有與脊椎動物類似的甲基化模式，但大部分的甲基化水平較脊椎動物低，還存在CHG（H代表A/T/C）和CHH序列上的甲基化修飾，例如果蠅（Drosophila melanogaster）中存在的CpA、CpT甲基化修飾以及菜蛾（Plutella xylostella）中存在的5′-CCGG-3′序列甲基化修飾[2].

DNA甲基化是動態(tài)變化的，它的異?？赡軙a(chǎn)生癌癥、基因印記以及精神相關(guān)疾病的風險[3-4].作為DNA甲基化的逆向過程，DNA去甲基化在動物發(fā)育、腦可塑性、基因組印記等過程和由環(huán)境損傷引起的表觀基因調(diào)控中具有高度靈活性[5]，因此正常的DNA去甲基化修飾在維持DNA甲基化調(diào)控的穩(wěn)定性方面具有重要作用.深入了解DNA去甲基化，能夠完善對DNA甲基化動態(tài)調(diào)控的認識，這不但能拓寬人們對表觀遺傳調(diào)控的理解，還對體細胞重編程、再生醫(yī)學以及醫(yī)學治療等具有重要意義.相比脊椎動物，DNA去甲基化在無脊椎動物中研究得較少，其中對節(jié)肢動物的研究大多聚焦在昆蟲當中.本文對DNA去甲基化的機制、功能及其在節(jié)肢動物中的研究現(xiàn)狀進行綜述，以期為甲殼動物DNA去甲基化的研究提供借鑒和參考.

1 DNA去甲基化的方式及其作用機制

DNA去甲基化涉及被動和主動2種方式.被動去甲基化主要發(fā)生在細胞分裂時期，其實質(zhì)是在DNMT被抑制的前提下通過DNA的復制對甲基化進行稀釋，并不能完全去除DNA的甲基化標簽.Leu等[6]研究發(fā)現(xiàn)，小的干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）干擾卵巢癌細胞中的DNMT1和DNMT3b會引起部分基因位點的去甲基化，從而恢復基因表達，這也進一步說明了抑制DNMT的活性可以引起被動去甲基化.而主動去甲基化則不需要依靠DNA復制，早在1986年Razin等[7]就提出分化過程中的DNA去甲基化是通過一種酶反應(yīng)機制實現(xiàn)的，即5mC被C取代.主動去甲基化的途徑如圖1[8-9]所示，共分為4種[10]：①堿基切除修復途徑（base excision repair，BER），堿基切除修復過程中直接切除5mC并啟動DNA糖基化酶來實現(xiàn)主動DNA去甲基化，這種機制多見于植物中；②脫氨基-錯配修復途徑，胞苷脫氨基酶（cytidine deaminase，CDA）可以催化5mC轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏ぃ═），產(chǎn)生的G∶T易突變體激活錯配修復，錯配修復將T修復為C從而達到去甲基化的目的[11]；③TET-糖基化酶-切除修復途徑，這是研究最為廣泛也最公認的去甲基化途徑[10-11]，易位甲基胞嘧啶雙加氧酶（ten-eleven translocation，TET）蛋白是一種依賴α-酮戊二酸（α-KG）和Fe2+的雙加氧酶，TET蛋白能夠?qū)?mC氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5hmC），并進一步將5 hmC氧化成甲酰胞嘧啶（5fC）、羧基胞嘧啶（5caC）[12]，隨后被T-DNA糖苷酶（TDG）或U-DNA糖苷酶（UDG）識別切除產(chǎn)生一個無堿基位點，進而經(jīng)過堿基切除修復途徑被修復為無修飾的胞嘧啶[13-14]；④TET-脫氨基偶聯(lián)途徑，TET將5mC氧化為5hmC，CDA催化5hmC脫氨基產(chǎn)生的5-羥甲基尿嘧啶（5hmU）被TDG識別切除，達到去甲基化的目的[15-16].

圖1 哺乳動物中DNA甲基化以及去甲基化途徑Fig.1 DNA methylation and demethylation pathways in mammals

主動去甲基化與被動去甲基化過程并非完全獨立和相互排斥，甚至存在關(guān)聯(lián).例如，哺乳動物生殖細胞發(fā)育過程中以及受精后均會伴隨全基因組的去甲基化，其中，在合子基因組的去甲基化過程中，母系和父系基因組利用了不同的去甲基機制，父系基因組主動去甲基化，而母系基因組被動去甲基化[17].

2 DNA去甲基化的功能

哺乳動物中存在不同形式的DNA甲基化模式，包括啟動子和非啟動子的甲基化.啟動子上的DNA甲基化通常會抑制基因表達，因此其變化在基因表達中具有開關(guān)的作用，對維持生物正常的細胞功能、遺傳印記和胚胎發(fā)育極其重要.DNA去甲基化作為DNA甲基化修飾動態(tài)變化中的關(guān)鍵過程，與甲基化的作用緊密相關(guān).

2.1 調(diào)控發(fā)育進程

DNA甲基化的動態(tài)調(diào)控對生物胚胎和腦的發(fā)育具有重要作用.在有性生殖中，基因組甲基化共發(fā)生2次動態(tài)變化，如圖2[18]所示.一次發(fā)生在生殖細胞發(fā)育時期：原始生殖細胞需要經(jīng)過被動的全基因組去甲基化以及主動的特異性去甲基化，消除體細胞中的特異甲基化修飾，隨后在生殖細胞形成和配子發(fā)生過程中建立性別和生殖細胞特異性DNA甲基化模式，形成基因組印記，以便完成高度復雜化和專業(yè)化的減數(shù)分裂和受精過程；另一次則發(fā)生在早期胚胎發(fā)育時期：受精后的配子去除了除基因印記區(qū)和轉(zhuǎn)座子以外的大部分甲基化標記，之后又在胚胎著床前重建DNA甲基化模式[18].Inoue等[19]研究發(fā)現(xiàn)，TET1缺失的小鼠胚胎干細胞不僅呈現(xiàn)出形態(tài)學異常，還表現(xiàn)出生長速率的下降.此外，相關(guān)研究表明，DNA去甲基化在神經(jīng)元發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，DNA去甲基化的異常通常伴隨著雷特綜合征、孤獨癥、阿爾茨海默病等疾病的發(fā)生.Szulwach等[20]研究腦發(fā)育時發(fā)現(xiàn)，5 hmC的獲得與激活發(fā)育基因有關(guān).5hmC、5fC和5caC是DNA去甲基化過程中關(guān)鍵的中間體，它們的含量在神經(jīng)元發(fā)育以及神經(jīng)干細胞分化過程中表現(xiàn)出時空差異性，TETs也具有類似的時空特異性表達[21]，這也表明發(fā)育過程中DNA去甲基化可能有助于調(diào)節(jié)基因的正確表達.

圖2 DNA甲基化水平在配子發(fā)育以及早期胚胎發(fā)育時期的變化Fig.2 Changes of DNA methylation level during gametogenesis and embryogenesis

2.2 參與免疫防御過程

腫瘤形成與DNA去甲基化的異常有關(guān).在髓系惡性腫瘤中首次發(fā)現(xiàn)的TET2突變基因使學者們逐漸關(guān)注TET2在免疫調(diào)節(jié)中的作用，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，TET2丟失會使肥大細胞基因表達發(fā)生中斷且基因組甲基化模式發(fā)生改變，從而影響肥大細胞的分化和細胞因子的產(chǎn)生[22].進一步研究發(fā)現(xiàn)，TET2還參與了調(diào)控機體的炎癥反應(yīng)：漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cells，pDCs）在病毒感染初期具有呈遞抗原以及誘發(fā)炎癥反應(yīng)的重要作用，CXXC5（CXXC finger protein 5）招募TET2以促進干擾素調(diào)控因子IRF7的表達，從而參與調(diào)控干擾素IFN-α的表達，其誘導的IFN反應(yīng)被證明與誘導T細胞反應(yīng)密切相關(guān)[23].TET2還能改變mRNA的甲基化模式.巨噬細胞TET2被ADAR1招募于細胞因子信號抑制因子（suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）mRNA的3′端非翻譯區(qū)（3′-UTR）上，引起SOCS3 mRNA的降解從而解除對JAK/STAT3通路的抑制[24].而炎癥消退時，巨噬細胞中TET2結(jié)合組蛋白去乙?；?/2（HDAC1/2）以促進組蛋白脫乙?；⒁种瓢捉樗豂L-6和IL-1β的表達，也表明TET2參與的表觀遺傳調(diào)控是解決炎癥的關(guān)鍵因素[25-26].

除此之外，組織特異性DNA去甲基化近年來也被認為是免疫T細胞和B細胞正常分化和作用所必需的，如圖3所示[26-27].全基因組繪制5hmC圖譜發(fā)現(xiàn)，5hmC富集與基因表達正相關(guān)，5hmC不僅在一些關(guān)鍵的T細胞譜系特異性轉(zhuǎn)錄因子（如Th-POK、T-bet、Foxp3等）基因體中沉積，還在免疫應(yīng)答相關(guān)基因（如IL-4、IFNγ和IL-17）的轉(zhuǎn)錄區(qū)域中富集，促進表達以調(diào)控T細胞的分化和功能[27].TET2的突變會導致CD4-T淋巴細胞異常增殖以破壞T細胞的穩(wěn)定性[28].TET2和TET3 mRNA在B細胞發(fā)育的各個階段都大量表達.與正常小鼠相比，TET2/3缺失的小鼠骨髓中B細胞數(shù)量顯著減少，并且從pro-B發(fā)育到pre-B的過程中出現(xiàn)部分阻滯，TET2/3的缺失還導致干擾素調(diào)控因子IRF4表達降低，損害免疫球蛋白Igκ的轉(zhuǎn)錄和重排[29-30].TET1蛋白可以通過調(diào)控組蛋白H4的乙?；接绊慏NA修復，也表明了DNA去甲基化在免疫調(diào)控、腫瘤抑制以及DNA修復中有著重要作用[31-32].

圖3 TETs介導的DNA去甲基化在免疫相關(guān)應(yīng)答中的調(diào)控Fig.3 Regulation of TETs-mediated DNA demethylation in immune-related responses

2.3 影響代謝通路

機體正常的新陳代謝與DNA甲基化的動態(tài)調(diào)節(jié)有著密切關(guān)聯(lián)：一方面，DNA甲基化的動態(tài)修飾離不開機體代謝，其中用于修飾DNA的甲基來源于甲硫氨酸循環(huán)的中間產(chǎn)物S-腺苷甲硫氨酸，而參與去甲基化過程的TET雙加氧酶活性也受到三羧酸循環(huán)中αKG的影響（圖1）；另一方面，在二型糖尿病患者中發(fā)現(xiàn)基因甲基化異常導致胰島素和胰高血糖素分泌紊亂，這也表明了DNA甲基化對代謝的影響[9].高糖飲食會引發(fā)轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor β1，TGFβ1）基因的去甲基化和表達，這在糖尿病和腎病的發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用[33].另外，TET2可調(diào)控脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）的表達，對甘油三酸酯的代謝有重要作用，TET2過度表達會顯著抑制動脈粥樣硬化病變的形成，這也給代謝紊亂引發(fā)的疾病提供了一個潛在的新治療靶點[34].

2.4 潛在調(diào)控物種進化

基于DNA甲基化的動態(tài)調(diào)控作用，人們逐步開始探究DNA甲基化動態(tài)修飾在物種進化上的作用，DNA去甲基化引起的DNA甲基化水平改變可能會導致物種特異性適應(yīng)以及表型變異.人類和黑猩猩的基因組具有95%的同源性，但逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子SVA的甲基化在人類和黑猩猩精子中顯示出明顯的物種特異性差異，SVA在人類精子中表現(xiàn)出低水平的甲基化而在黑猩猩精子中顯示出高水平的甲基化，這種變化暗示了DNA去甲基化在進化中的調(diào)控作用[35].在脊椎動物中，DNA甲基化常發(fā)生在CpG二核苷酸序列上，CpG含量的變化也為甲基化水平的變化提供了一種機制，CpG含量降低可由甲基化胞嘧啶引起的快速脫氨基引起，使CpG轉(zhuǎn)化為TpG[36].Gokhman等[37]在此基礎(chǔ)上推斷了尼安德特人和杰尼索萬人的DNA甲基化模式，并觀察到現(xiàn)代人中HOXD9啟動子和HOXD10基因體的甲基化水平低于古人類中的甲基化水平，HOXD是調(diào)控肢體發(fā)育的關(guān)鍵蛋白，它在進化中發(fā)生的去甲基化可能解釋了古人類與現(xiàn)代人類之間的一些解剖學差異[37-38].

3 節(jié)肢動物DNA去甲基化的研究現(xiàn)狀

3.1 節(jié)肢動物去甲基化的機制

對節(jié)肢動物的全基因組進行甲基化檢測，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化存在于肢口綱（美洲鱟）、唇足綱（蜈蚣）、蛛形綱（腹蛛）、甲殼綱（大型溞）以及昆蟲綱中，DNA甲基化的水平因物種而異，節(jié)肢動物DNA甲基化的機制以及分布如圖4和表1[39-40]所示.在昆蟲綱中，除雙翅目外，DNA甲基化廣泛存在于幾個當前研究比較廣泛的目中，如蜚蠊目、半翅目、膜翅目、鞘翅目、鱗翅目等.結(jié)合DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶檢測發(fā)現(xiàn)，這些昆蟲的DNA甲基化水平與DNMT1有相關(guān)性，與DNMT3之間則缺乏相關(guān)性[41].DNMT1和DNMT3在哺乳動物中分別具有催化半甲基化為全甲基化和對DNA進行從頭甲基化的功能，但目前沒有直接證據(jù)證明節(jié)肢動物中DNA從頭甲基化由DNMT3介導.缺乏DNA甲基化的雙翅目昆蟲中只發(fā)現(xiàn)了DNMT2，這也與DNMT2催化tRNA甲基化的發(fā)現(xiàn)相符[40-42].基于DNMT重要的甲基化作用，其活性受到抑制以及表達受到干擾會使節(jié)肢動物產(chǎn)生被動的去甲基化.Zhang等[43]研究發(fā)現(xiàn)，利用RNA干擾技術(shù)敲降黃蜂（Nasonia vitripennis）的DNMT1基因能夠顯著降低全基因組甲基化水平，表明具有甲基化修飾的節(jié)肢動物存在DNA被動去甲基化修飾.

圖4 節(jié)肢動物中DNMT和TET介導的DNA甲基化和去甲基化途徑Fig.4 DNA methylation and demethylation mediated by DNMT and TET in arthropods

表1 節(jié)肢動物中DNMT和TET的分布Tab.1 Distribution of DNMA and TET in arthropods

節(jié)肢動物表現(xiàn)出與哺乳動物不同的甲基化模式.節(jié)肢動物DNA的甲基化往往以鑲嵌模式稀疏地分布，甲基化多發(fā)生于基因的編碼區(qū)且高度富集于編碼保守蛋白的基因中，而在基因之間以及轉(zhuǎn)錄因子中的甲基化較少，啟動子更缺少甲基化[39]；相比于哺乳動物，部分節(jié)肢動物在CpG島的甲基化水平較低，但存在CpT和CpA位點上的甲基化.常發(fā)生在細菌基因組中的腺嘌呤甲基化修飾（6mA）也存在于雙翅目的果蠅中，并且在果蠅胚胎發(fā)育過程中具有潛在的調(diào)控作用[43].

哺乳動物中TET1/2/3蛋白在介導DNA主動去甲基化過程中有重要作用，在含有5hmC的節(jié)肢動物中也檢測到了參與DNA主動去甲基化的關(guān)鍵酶類TETs，包括蚜蟲（Diuraphis noxia）[44]、黃蜂[45]和蜜蜂（Apis mellifera）[46]等.不同于哺乳動物中常見的TET1/2/3蛋白，部分節(jié)肢動物中含有一個TET同系蛋白，即DNA甲基腺嘌呤脫甲基酶（DNA N6-Methyladenine demethylase，DMAD）.Engelhardt等[40]研究發(fā)現(xiàn)，敲降果蠅的DMAD可導致6mA積累，經(jīng)體外實驗證明DMAD可介導6mA去甲基化.載脂蛋白B催化編輯蛋白家族（apolipoprotein B editing complex proteins，APOBECs）是常見于哺乳動物中的另一種去甲基化酶，雖然發(fā)現(xiàn)在無脊椎動物海膽中也存在該種酶[47]，但對于節(jié)肢動物中APOBECs催化5mC脫氨基的研究尚未開展.雖然已經(jīng)證明節(jié)肢動物中存在TET介導的DNA去甲基化修飾，但TET蛋白修飾后產(chǎn)生的5hmC是否經(jīng)切除修復還原成未甲基化的胞嘧啶，仍需要進一步探討.

3.2 節(jié)肢動物中DNA去甲基化功能的研究現(xiàn)狀

哺乳動物中存在的啟動子甲基化模式一般具有抑制效應(yīng).在昆蟲中高度甲基化的基因通常具有管家基因功能，可以進行高效表達；而低水平甲基化的基因則可能與復雜的基因表達調(diào)控有關(guān)[48]，其中可能涉及調(diào)控組蛋白修飾和選擇性剪接.多項研究發(fā)現(xiàn)，DNA去甲基化對于節(jié)肢動物的發(fā)育、免疫防御、代謝以及進化具有重要影響，具體如表2所示.

表2 DNA去甲基化在節(jié)肢動物的發(fā)育、免疫防御、代謝以及進化中的調(diào)控作用Tab.2 Regulation of DNA demethylation in the development，immune defense，metabolism and evolution of arthropods

在發(fā)育方面，Kucharski等[49]首次在蜜蜂中得到啟發(fā)，即昆蟲的等級分化與表觀遺傳修飾密切相關(guān)，DNMT3基因的沉默會使西方蜜蜂幼蟲發(fā)育成具有成熟卵巢的蜂皇.保幼激素（juvenile hormone，JH）是昆蟲等級發(fā)育的關(guān)鍵因子，Cardoso-Júnior等[50]研究發(fā)現(xiàn)，無刺蜜蜂中低DNA甲基化水平能夠上調(diào)保幼激素的表達，DNA甲基化和組蛋白磷酸化協(xié)同修飾，增加幼蟲發(fā)育成蜂皇的可能.除此之外，F(xiàn)eliciello等[57]在赤擬谷盜（Tribolium castaneum）中也發(fā)現(xiàn)DNA甲基化參與調(diào)控胚胎發(fā)育成蟲.Pegoraro等[45]研究發(fā)現(xiàn)，RNAi敲降黃蜂的Dnmt1a基因后在長日照條件下滯育發(fā)生率異常增加，表明甲基化對黃蜂正常光周期反應(yīng)具有調(diào)控作用.Sp-CFSH（甲殼類雌性激素基因）是擬穴青蟹（Scylla paramamosain）性別分化的關(guān)鍵基因，該基因5′端的轉(zhuǎn)錄起始位點含有1個CpG島，Jiang等[51]研究發(fā)現(xiàn)，定點突變與轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合相關(guān)的CpG位點降低了啟動子活性，表明甲基化可能通過阻斷轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合從而抑制Sp-CFSH表達.

在免疫防御方面，無脊椎動物不同于脊椎動物，僅具有天然免疫而不具有適應(yīng)性免疫.DNA甲基化調(diào)控可能通過改變抗病和免疫相關(guān)基因的表達進而影響生物的免疫能力.家蠶（Bombyx mori）感染BmNPV病毒后會發(fā)生轉(zhuǎn)錄譜的變化，與正常家蠶相比有多個差異甲基化基因，其中包含參與JAK/STAT通路以及抗凋亡過程的相關(guān)基因，Huang等[53]研究發(fā)現(xiàn)，DNMT活性降低可以引起這些相關(guān)基因下調(diào)，促進感染細胞的凋亡，推測DNA去甲基化在抑制BmNPV病毒增殖方面有重要作用.Li-Byarlay等[54]對感染了IAPV的蜜蜂進行甲基化分析和轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化的快速變化先于并可能觸發(fā)更廣泛的轉(zhuǎn)錄組變化.Kumar等[55]用甲基化抑制劑處理小菜蛾（Plutella xylostella）時也發(fā)現(xiàn)基因組的5mC水平降低與免疫抑制有關(guān)，DNMT的表達和基因組的甲基化水平在被寄生蜂寄生后第3天發(fā)生顯著降低；此外，他們還發(fā)現(xiàn)小菜蛾的5mC水平在被寄生的第2天顯著升高，推測有可能是由于PxTET下調(diào)減少了5mC去甲基化代謝從而暫時增加了宿主防御能力.

在代謝方面，節(jié)肢動物具有與脊椎動物類似的現(xiàn)象，即某一特定基因的去甲基化能夠影響相關(guān)的代謝調(diào)控.Foret等[56]將蜂王和工蜂幼蟲的全基因組甲基化特征與基因表達和激素調(diào)節(jié)聯(lián)系起來發(fā)現(xiàn)，幾個高度保守的代謝和信號通路中富含甲基化基因，其中一個為差異甲基化區(qū)域編碼間變性淋巴瘤激酶（ALK），ALK是新陳代謝重要的調(diào)控因子，這表明DNA甲基化表觀遺傳機制影響代謝通量和信號轉(zhuǎn)導.

在進化方面，DNA去甲基化對節(jié)肢動物表型調(diào)控以及社會性分工具有調(diào)控作用.SAM蚜蟲是從親本SA1發(fā)展而來的一類更具毒性的生物型蚜蟲，SAM比其親本SA1具有更高的DNA甲基化調(diào)控活性，這可能是SAM能克服植物抗性的基礎(chǔ)[44].社會性膜翅目昆蟲表現(xiàn)出一定的DNA甲基化相似性和特異性，具有較高CpG含量的同時也存在DNA甲基化的基因調(diào)控[58]，如具有社會性分工的蜜蜂，它們不同于果蠅，前者具有較高的CpG含量，且甲基化基因與脊椎動物的更相似[59].

目前有關(guān)于節(jié)肢動物DNA甲基化調(diào)控的研究給予了研究者許多啟發(fā)，提出了進一步的思考：節(jié)肢動物是否具有與哺乳動物類似的主動去甲基化模式？環(huán)境變化是通過怎樣的信號通路激活和調(diào)控相應(yīng)的DNA甲基化調(diào)控通路？節(jié)肢動物中DNA甲基化是如何調(diào)控基因表達的？這種表達調(diào)控如何影響生物表型的變化？DNA甲基化調(diào)控如何與其他的表觀遺傳網(wǎng)路協(xié)調(diào)合作以調(diào)控生物表型的變化？

4 結(jié)論和展望

作為重要的表觀遺傳修飾之一，DNA甲基化動態(tài)調(diào)控已在哺乳動物中得到廣泛研究，DNA去甲基化是機體維持正常DNA甲基化水平所必須的.哺乳動物的被動去甲基化和主動去甲基化協(xié)調(diào)合作，使生物機體維持穩(wěn)定的DNA甲基化水平從而維系正常的生理活動，亦或改變機體的甲基化水平以應(yīng)答環(huán)境變化.DNA去甲基化會引起哺乳動物生理功能的變化，其原因在于相關(guān)基因的甲基化水平發(fā)生改變，從而影響了它的表達水平.因此，甲基化與基因表達之間的相關(guān)性成為探究節(jié)肢動物DNA去甲基化功能和機制的關(guān)鍵問題之一.首先DNA甲基化作為保守的表觀修飾之一，已在節(jié)肢動物中得到印證；其次，節(jié)肢動物中觀察到的甲基化模式以及生理功能變化時發(fā)生的差異甲基化，暗示了DNA去甲基化與基因表達間的潛在關(guān)系，但節(jié)肢動物DNA去甲基化與基因表達是否有直接關(guān)系還未可知.節(jié)肢動物的甲基化常發(fā)生在基因體中，這種修飾常被認為調(diào)控轉(zhuǎn)錄本的選擇性剪接和組蛋白修飾，該調(diào)控方式最近在蜜蜂[60]和家蠶[61]中得到驗證，蜜蜂和家蠶提供了DNA甲基化調(diào)控基因表達的直接證據(jù)，也為推動節(jié)肢動物中DNA去甲基化的功能和機制研究奠定了基礎(chǔ).

DNA去甲基化是DNA甲基化動態(tài)調(diào)控不可缺少的一部分，要了解節(jié)肢動物DNA去甲基化如何響應(yīng)環(huán)境變化，首先要對節(jié)肢動物的DNA甲基化和去甲基化機制有更完整的認知.DNA甲基轉(zhuǎn)移酶是合成和維持DNA甲基化的關(guān)鍵因子，對DNA甲基化的動態(tài)調(diào)節(jié)至關(guān)重要.在昆蟲體內(nèi)，DNMT1存在率高且與DNA甲基化相關(guān)，而DNMT3的缺失率最高且與DNA甲基化缺少相關(guān)性，因此節(jié)肢動物在DNA甲基化的合成上還有待探究：是通過非DNMT蛋白所觸發(fā)？還是DNA甲基化不再重新編程而直接由DNMT1維持穩(wěn)定？為了穩(wěn)定DNA甲基化修飾，一方面，可以通過DNA復制稀釋來降低甲基化水平；另一方面，近年來對5hmC和TETs的探究也初步證明節(jié)肢動物可以通過TETs將5mC氧化為5hmC從而降低DNA甲基化水平.然而，TETs是否在節(jié)肢動物中介導了與哺乳動物類似的主動去甲基化尚未明確，這還需要對節(jié)肢動物中TETs的氧化產(chǎn)物（5fC和5caC）進行檢測，并且對TETs與DNA糖苷酶的協(xié)同作用進行驗證.

另外，DNA甲基化調(diào)控對生物生理功能的作用還有待進一步探究.將研究方向從整個組織轉(zhuǎn)向發(fā)生顯著變化的細胞或基因中，或許能提供更多DNA甲基化調(diào)控的線索.通過改變DNA甲基化的水平并分析其導致的相應(yīng)后果，可以獲得DNA甲基化特定作用的直接證據(jù).RNA干擾技術(shù)和抑制劑（如DNA甲基化抑制劑5-azacytidine、DNA去甲基化抑制劑DMOG以及zebularine等）常被用于探究DNA甲基化調(diào)控功能的實驗中，但這兩種方法在作用程度以及特異性上仍存在限制.CRISPR技術(shù)也常被用于特定基因的功能分析且具有更好的準確性，近年來開發(fā)的一種基于CRISPR-Cas9的特異性DNA甲基化工具[62]為深入了解特定基因中甲基化的功能提供了技術(shù)支持，如利用dCas9-Tet1或-Dnmt3a融合蛋白靶向特定基因啟動子區(qū)的去甲基化或甲基化，以觀察該基因表達的變化[63].

DNA去甲基化在節(jié)肢動物中的研究已經(jīng)取得了一定的進展，但依然存在許多疑問，而這些疑問也為未來更好地研究DNA甲基化以及去甲基化的作用提供了方向和線索.