張明昊，薛鵬坤，趙盈盈，高一盈，董文霞，

馬偉洋1，王 珍1，張 超3＊＊

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院 鄭州 450046；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450046；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 鄭州 450046）

濕疹（atopic dermatitis,AD）是一種常見的炎癥性皮膚病，臨床上具有皮損對(duì)稱分布、劇烈瘙癢、反復(fù)發(fā)作等特點(diǎn)[1]，發(fā)病率逐年升高。濕疹病因復(fù)雜，目前多認(rèn)為是在機(jī)體內(nèi)部因素如免疫功能異常、神經(jīng)與精神功能障礙等基礎(chǔ)上，綜合外部因素共同作用的結(jié)果[2]。目前西醫(yī)常以糖皮質(zhì)激素類藥物外用行局部治療，或使用H1受體拮抗藥行全身治療，較為嚴(yán)重者還需要使用糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑來進(jìn)行免疫治療。這些藥物雖能在短期內(nèi)緩解癥狀，但難以有效治愈濕疹，且易出現(xiàn)停藥后“反跳”現(xiàn)象及不良反應(yīng)，比如H1受體拮抗藥可以抑制Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，但對(duì)于濕疹這種遲發(fā)型超敏反應(yīng)也只能是起到緩解瘙癢的作用；糖皮質(zhì)激素雖能抑制遲發(fā)型超敏反應(yīng)，但長(zhǎng)期使用時(shí)無論是局部還是全身用藥都會(huì)出現(xiàn)明顯的副作用[3-4]。

鑒于H1受體拮抗藥和糖皮質(zhì)激素在臨床上的使用局限性，本課題組從中醫(yī)中藥角度出發(fā)來研究濕疹的治療方法和藥物。濕疹屬“浸淫瘡”范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為其主要病機(jī)是稟賦不耐，濕熱內(nèi)蘊(yùn)，外感風(fēng)邪等致風(fēng)、濕、熱邪相搏，浸淫肌膚而發(fā)[5]，在中醫(yī)辨證上多屬風(fēng)熱型，以清肝膽、利濕熱為主要治療思路。龍膽瀉肝湯能清瀉肝膽實(shí)火、清利肝膽濕熱[6]，具有調(diào)節(jié)免疫、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗過敏、抗病毒及病原微生物和抗氧化等多種藥理作用，故用其治療濕疹符合中醫(yī)治療理念。本課題組曾對(duì)龍膽瀉肝湯在濕疹的臨床治療方面進(jìn)行了調(diào)研，發(fā)現(xiàn)該方療效較好，但缺乏實(shí)驗(yàn)室研究數(shù)據(jù)和相應(yīng)機(jī)制的探討。

考慮到止癢和抗炎是治療濕疹的兩個(gè)基本思路，且中藥具有多功效、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，因此本課題組將在龍膽瀉肝湯對(duì)大鼠濕疹模型干預(yù)效果的基礎(chǔ)上，從組胺受體H1（Histamine H1 receptor,H1R）/瞬時(shí)感受器電位受體1（Transient receptor potential cation channel subfamily vanilloid receptor 1,TRPV1）、蛋白酶激活受體2（Proteinase activated receptor 2，PAR2）/瞬時(shí)感受器電位受體1（Transient receptor potential cation channel subfamily vanilloid receptor 1,TRPV1）和絲裂原活化蛋白激酶P38MAPK（P38 mitogen activated protein kinase）三條信號(hào)通路的角度探究龍膽瀉肝湯對(duì)大鼠濕疹模型的干預(yù)機(jī)制，對(duì)中醫(yī)藥治療濕疹具有一定的啟示意義。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谔骄魁埬憺a肝湯通過抑制H1R/TRPV1、PAR-2/TRPV1和P38MAPK通路對(duì)濕疹大鼠的干預(yù)機(jī)制，為中醫(yī)藥防治濕疹提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并為濕疹的臨床治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

龍膽瀉肝湯（由龍膽草15 g，黃芩10 g，梔子15 g，澤瀉15 g，車前子15 g，當(dāng)歸10 g，地黃15 g，柴胡10 g，牡丹皮15 g，夏枯草20 g組成）購(gòu)自鄭州真心大藥房有限公司，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院董誠(chéng)明教授鑒定為正品，以上藥物常規(guī)煎煮，濃縮為1.26 g·mL-1的藥液。氯雷他定片（Loratadine）購(gòu)自上海海尼藥業(yè)有限公司（規(guī)格：10 mg/片，批號(hào)：2003014）。

1.2 動(dòng)物

健康8周齡SD大鼠60只，雄性，體質(zhì)量200±20 g，購(gòu)于鄭州市惠濟(jì)區(qū)華興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（豫）2019-0002，所有大鼠飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證號(hào)：SYXK（豫）2020-0004，環(huán)境溫度為20-22℃，相對(duì)濕度為55%-60%，正常光照，大鼠自由飲水采食。本實(shí)驗(yàn)得到了河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：DWLL20200017）。

1.3 試劑

2,4-二硝基氯苯（DNCB）（上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)：C10261168）；丙酮、二甲苯、甲醛、無水乙醇（煙臺(tái)市雙雙化工有限公司，批號(hào)：20140816、20191201、20170201、20200101）；蘇木素染色液、伊紅染色液（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：R20572、R24045）；兔鏈霉卵白素-生物素檢測(cè)（SP）試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺法（DAB）顯色試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：SP-9001、ZLI-9018）；組胺受體H1（H1R）抗體、蛋白酶激活受體2（PAR-2）抗體、瞬時(shí)感受器電位受體1（TRPV1）抗體、絲裂原活化蛋白激酶（P38 MAPK）抗體、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶（phospho-P38 MAPK）抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公 司，批 號(hào)：bs-6663R、bs-1178R、bs-23926R、bs-0637R、bs-0637R）；β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體、RIPA裂解液（RIPA Lysis Buffer）、磷酸化蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒、聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、顯影定影試劑、ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔二抗（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號(hào)：GB12001、G2002、G2007、G2026、G2003、G2019、G2014、GB23303）。

1.4 儀器

Secura124-1CN型電子天平（德國(guó)公司Sartorius公司）；DNM-9606型酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)有限公司）；RM2235石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；C1650R-230V型高速冷凍離心機(jī)（萊普特科學(xué)儀器（北京）有限公司）；YD-6D型組織包埋機(jī)、YD-A型組織攤片機(jī)、YD-B型組織烤片機(jī)（金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；CX23光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；BV-2型垂直電泳儀、BT-2型轉(zhuǎn)印電泳儀、MX-F型渦旋混合器（武漢賽維爾生物科技有限公司）；iBright凝膠成像系統(tǒng)（賽默飛世爾科技公司）。

1.5 方法

1.5.1 濕疹大鼠模型的建立與分組

取60只大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組、氯雷他定組和龍膽瀉肝湯低、中、高劑量組，每組10只。正常組常規(guī)飼養(yǎng)，其余各組大鼠選取腹部及背部2 cm×2 cm皮膚面積，脫毛裸露，用微量移液器吸取DNCB-丙酮橄欖油溶液（4:1）100μL于大鼠腹部脫毛區(qū)均勻涂抹致敏，1次/天，連續(xù)2天。5天后再以0.5%DNCB-丙酮橄欖油溶液100μL于大鼠腹部脫毛區(qū)均勻涂抹激發(fā)；同時(shí)以1% DNCB-丙酮橄欖油溶液5μL于大鼠右耳內(nèi)外側(cè)耳面均勻涂抹激發(fā)，1次/3天，持續(xù)15天。氯雷他定組和龍膽瀉肝湯低、中、高劑量組大鼠于實(shí)驗(yàn)第3天即干預(yù)給藥。根據(jù)人鼠換算公式S大鼠/200g=0.018×S人/70kg，得龍膽瀉肝湯劑量為2.52 g/200 g/大鼠（140 g/70 kg/人），即12.6 g·kg-1。故龍膽瀉肝湯中劑量組大鼠按12.6 g·kg-1灌胃龍膽瀉肝湯水煎液；龍膽瀉肝湯低、高劑量組大鼠分別按6.3 g·kg-1（中劑量的0.5倍）、25.2 g·kg-1（中劑量的2倍）灌胃龍膽瀉肝湯水煎液；氯雷他定組大鼠按1 mg·kg-1（相當(dāng)于成人臨床劑量的10倍）灌胃氯雷他定溶液；正常組和模型組均灌胃等量蒸餾水，1次/天，連續(xù)15天。末次給藥24 h后，觀察各組大鼠背部皮膚外觀情況，然后頸椎脫臼處死，用手術(shù)剪沿耳基線剪下左右雙耳，于左右耳中部同一位置打孔并取圓形耳片；然后解剖取背部脫毛區(qū)皮膚組織，生理鹽水沖洗后將組織一分為二，其中一份放置于4%中性甲醛固定；另一份用液氮速凍后置于-80℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 一般情況觀察與濕疹嚴(yán)重度評(píng)分

觀察各組大鼠背部皮膚外觀情況并采集圖像。大鼠背部皮膚濕疹嚴(yán)重度評(píng)分依據(jù)趙辨報(bào)道的“濕疹面積及嚴(yán)重度指數(shù)”（Eczema area and severity index，EASI）評(píng)分法[7]，略作改動(dòng)，僅以干預(yù)前后出現(xiàn)的紅斑、水腫癥狀變化來判斷藥物干預(yù)情況，合計(jì)總分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下，紅斑：無0分，輕微1分，中度2分，中重度3分，重度4分；紅腫：無0分，輕度1分，中度2分，中重度3分，重度4分。綜合評(píng)分為紅斑、水腫評(píng)分綜合。

1.5.3 耳腫脹度和耳腫脹抑制率測(cè)定

將圓形耳片置于電子天平上精確稱重，并按下列公式計(jì)算耳腫脹度和耳腫脹抑制率。

1.5.4 皮膚組織病理學(xué)觀察

取1.5.1項(xiàng)下固定的皮膚組織，經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、5μm切片等過程制作病理切片，切片經(jīng)二甲苯脫蠟、蘇木素-伊紅（Hematoxylin-Eosin,HE）染色，鹽酸乙醇分化，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后，光學(xué)顯微鏡下觀察皮膚組織病理學(xué)變化并于400倍鏡下采集圖像。大鼠背部皮膚病變程度以Fukuda等提出的組織病理學(xué)評(píng)分方法為依據(jù)[8]，略作改動(dòng)，僅以表皮損傷、增厚、過度角化、真皮水腫及炎癥等5個(gè)程度進(jìn)行評(píng)分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下，表皮損傷程度：相對(duì)正常0，輕度1，中度2，中度到顯著3，顯著4；角化過度：相對(duì)正常0，輕度1，中度2，中度到顯著3，顯著4：表皮厚度：相對(duì)正常0，輕度1，中度2，中度到顯著3，顯著4；真皮水腫：相對(duì)正常0，輕度1，中度2，中度到顯著3，顯著4；炎癥程度：相對(duì)正常0，輕度1，中度2，中度到顯著3，顯著4。綜合評(píng)分為表皮損傷、增厚、過度角化、真皮水腫及炎癥程度評(píng)分的總和。

1.5.5 免疫組化（Immunohistochemistry,IHC）法檢測(cè)皮膚組織H1R、PAR-2和TRPV1蛋白水平

取1.5.4項(xiàng)下制作的皮膚組織切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、水化后，用檸檬酸鹽緩沖液熱修復(fù)8min，待溫度降至室溫后切片依次用H2O2孵育10 min，PBS浸洗，山羊血清孵育30min，然后分別滴加H1R（1:100）、PAR-2（1:100）、TRPV1（1:100）抗體，4℃孵育過夜，次日切片復(fù)溫至37℃后滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育20 min，PBS浸洗，DAB顯色10min，自來水沖洗終止。然后蘇木素復(fù)染3 min，鹽酸乙醇分化，自來水再次沖洗，切片經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后鏡檢。每只大鼠皮膚組織切片在400倍鏡下隨機(jī)選取1個(gè)視野，以棕黃色為陽(yáng)性染色，采用Image-Pro Plus 6.0測(cè)定每個(gè)視野中平均光密度值（Average optical density value,AOD）值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5.6 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting,WB）法檢測(cè)皮膚組織P38 MAPK、phospho-P38 MAPK（p-P38MAPK）蛋白水平

取1.5.1項(xiàng)下凍存的皮膚組織，勻漿后提取總蛋白，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)模，P38MAPK（1:1000），p-P38MAPK（1:1000）抗體4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，每次5 min；二抗稀釋后室溫孵育30 min，TBST漂洗3次，每次5min。以β-actin為內(nèi)參，ECL試劑盒顯影成像，采用Image J軟件測(cè)定條帶灰度值，通過比較目標(biāo)條帶p-P38MAPK/P38MAPK灰度值比值來分析P38MAPK磷酸化水平。

1.5.7 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD）檢驗(yàn)，方差不齊者采用Dennett’s檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用百分率表示，采用卡方檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)流程圖見圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖

2 結(jié)果

2.1 龍膽瀉肝湯對(duì)大鼠耳腫脹度的影響

與正常組比較，模型組大鼠耳腫脹度顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，氯雷他定組和龍膽瀉肝湯低、中、高劑量組大鼠耳腫脹度顯著減少（P＜0.05），耳腫脹抑制率顯著增加（P＜0.05）；與氯雷他定組比較，龍膽瀉肝湯低劑量組大鼠耳腫脹度顯著增加（P＜0.05），耳腫脹抑制率顯著減?。≒＜0.05）；與龍膽瀉肝湯低劑量組比較，龍膽瀉肝湯中、高劑量組大鼠耳腫脹度顯著減少（P＜0.05），耳腫脹抑制率顯著增加（P＜0.05）（表1）。

表1 龍膽瀉肝湯對(duì)大鼠耳腫脹度的影響（xˉ±s，n=10）

2.2 龍膽瀉肝湯對(duì)大鼠背部皮膚外觀及組織形態(tài)學(xué)的影響

正常組大鼠存活狀況較好，皮膚平滑、完好，未見任何異常；模型組大鼠背部造模區(qū)皮膚出現(xiàn)紅腫、丘疹和水皰，與皮膚潰爛、滲出等濕疹表現(xiàn)一致；龍膽瀉肝湯低、中、高劑量組和氯雷他定組大鼠背部造模區(qū)皮膚腫脹，其表面潰爛和滲透情況均有所減輕，丘疹和水皰不同程度消失，皮膚較模型組更平滑。與正常組比較，模型組大鼠皮膚EASI評(píng)分顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，氯雷他定組和龍膽瀉肝湯低、中、高劑量組大鼠皮膚EASI評(píng)分顯著減?。≒＜0.05）；與氯雷他定組比較，龍膽瀉肝湯低劑量組大鼠皮膚EASI評(píng)分顯著增加（P＜0.05）；與龍膽瀉肝湯低劑量組比較，龍膽瀉肝湯中、高劑量組大鼠皮膚EASI評(píng)分顯著減小（P＜0.05）。HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠背部皮膚表皮厚度較正常組顯著增加，并呈現(xiàn)網(wǎng)狀及海綿樣水腫，毛囊口處亦可見有角栓；真皮層血管輕度擴(kuò)張，充血；氯雷他定組大鼠背部皮膚表皮有輕度增厚，未出現(xiàn)泡沫狀水腫和空泡；龍膽瀉肝湯低、中、高劑量組大鼠背部皮膚表皮輕度增厚，并伴有輕度海綿樣腫脹。與正常組比較，模型組大鼠皮膚組織病理評(píng)分顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，氯雷他定組和龍膽瀉肝湯低、中、高劑量組大鼠皮膚組織病理評(píng)分顯著減小（P＜0.05）；與氯雷他定組比較，龍膽瀉肝湯低、中劑量組大鼠皮膚組織病理評(píng)分顯著增加（P＜0.05）；與龍膽瀉肝湯低劑量組比較，龍膽瀉肝湯中、高劑量組大鼠皮膚組織病理評(píng)分顯著減?。≒＜0.05）（圖2-圖3、表2）。

圖2 龍膽瀉肝湯對(duì)大鼠背部皮膚外觀的影響

圖3 龍膽瀉肝湯對(duì)大鼠背部皮膚組織形態(tài)學(xué)的影響（HE,×400）

表2 龍膽瀉肝湯對(duì)大鼠背部皮膚EASI及病理評(píng)分的影響（xˉ±s，n=10）

2.4 龍膽瀉肝湯對(duì)大鼠皮膚組織H1R、PAR-2、TRPV1蛋白水平的影響

免疫組化結(jié)果顯示，正常組皮膚組織中有少量H1R、PAR-2、TRPV1表達(dá)。與正常組比較，模型組皮膚組織中有大量H1R、PAR-2、TRPV1表達(dá)，AOD值均顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，氯他雷定組和龍膽瀉肝湯低、中、高劑量組皮膚組織有少量H1R、PAR-2、TRPV1表達(dá)，AOD值均顯著減?。≒＜0.05）；與氯他雷定組比較，龍膽瀉肝湯低、中劑量組皮膚組織有大量H1R、PAR-2、TRPV1表達(dá)，AOD值均顯著增加（P＜0.05）；與龍膽瀉肝湯低劑量組比較，龍膽瀉肝湯高劑量組皮膚組織有少量H1R、PAR-2、TRPV1表達(dá)，AOD值均顯著減小（P＜0.05）（圖4、表3）。

表3 龍膽瀉肝湯對(duì)大鼠皮膚組織H1R、PAR-2、TRPV1蛋白免疫組化AOD值的影響（xˉ±s，n=10）

圖4 龍膽瀉肝湯對(duì)大鼠皮膚組織H1R、PAR-2、TRPV1蛋白水平的影響（免疫組化，×400）

2.5 龍膽瀉肝湯對(duì)大鼠皮膚組織P38MAPK、p-P38MAPK蛋白水平的影響

WB結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組皮膚組織p-P38MAPK/P38MAPK比值顯著增加（P＜0.05），氯雷他定組和龍膽瀉肝湯低、中、高劑量組皮膚組織p-P38MAPK/P38MAPK比值顯著減?。≒＜0.05）；與模型組比較，氯雷他定組和龍膽瀉肝湯低、中、高劑量組皮膚組織p-P38MAPK/P38MAPK比值顯著減?。≒＜0.05）。與氯雷他定組比較，龍膽瀉肝湯中、高劑量組皮膚組織p-P38MAPK/P38MAPK比值顯著減?。≒＜0.05）。與龍膽瀉肝湯低劑量組比較，龍膽瀉肝湯中、高劑量組皮膚組織p-P38MAPK/P38MAPK比值顯著減?。≒＜0.05）（圖5、表4）。

圖5 龍膽瀉肝湯對(duì)大鼠皮膚組織P38MAPK、p-P38MAPK蛋白水平的影響（WB）

表4 龍膽瀉肝湯對(duì)大鼠皮膚組織p-P38MAPK/P38MAPK比值的影響（xˉ±s，n=10）

3 討論

濕疹是一種慢性過敏性皮膚病[9]，以紅腫、瘙癢、剝皮、皮膚增厚等為主要特征。本研究應(yīng)用高濃度DNCB涂抹腹部致敏，低濃度DNCB涂抹背部、耳部激發(fā)的方式復(fù)制了大鼠濕疹模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)濕疹大鼠耳部腫脹，皮膚表皮增厚、角化，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)于皮膚真皮層，表明造模成功。該模型背部及耳廓局部病理特征與人類濕疹相似，是一種評(píng)價(jià)藥物療效的理想動(dòng)物模型。

龍膽瀉肝湯是臨床上清肝膽實(shí)火，降肝膽濕熱的常用方劑，方中龍膽草、黃芩、梔子性涼，可清濕熱，瀉實(shí)火；澤瀉、木通、車前子利濕解毒；生地清熱涼血；當(dāng)歸滋養(yǎng)陰血以柔肝；柴胡疏之；甘草性味甘、平，清熱解毒，可調(diào)和諸藥，益氣和中[10]。氯雷他定屬抗組胺類藥品，被機(jī)體快速吸收后可以阻止組胺與H1受體結(jié)合，抑制機(jī)體內(nèi)炎癥介質(zhì)的釋放，以達(dá)到緩解病狀的作用[11]。因氯雷他定為當(dāng)前臨床治療濕疹的常用藥物之一，故本研究以此藥為陽(yáng)性對(duì)照來考察龍膽瀉肝湯對(duì)濕疹大鼠的干預(yù)作用，結(jié)果顯示龍膽瀉肝湯和氯雷他定均能降低濕疹大鼠耳腫脹度，并不同程度地減輕皮膚組織海綿樣水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度，且12.6 g·kg-1和25.2 g·kg-1劑量的龍膽瀉肝湯的干預(yù)程度與氯雷他定相當(dāng)，表明了龍膽瀉肝湯對(duì)濕疹大鼠具有較好地干預(yù)作用。

機(jī)體癢覺的出現(xiàn)由組胺依賴和非組胺依賴的兩條癢信號(hào)通路共同參與，其中組胺依賴的癢信號(hào)通路由機(jī)械刺激不敏感的無髓鞘C-纖維（Mechanicallyinsensitive C-fibers，CMi）介導(dǎo)；非組胺依賴的癢信號(hào)通路由機(jī)械熱敏感的C-纖維（Mechano-heat-sensitive C fibers，CMHs）介導(dǎo)[12]。在組胺激活的癢信號(hào)通路中，H1R發(fā)揮重要作用，H1R通過激活磷脂酶C（Phospholipase C,PLC）和磷脂酶A2（Phospholipase A2,PLA2），進(jìn)一步激活下游TRPV1通道[13]。二?；视停―iacylglycerol，DAG）作為PLC的水解產(chǎn)物還可結(jié)合TRPV1的辣椒素位點(diǎn)，從而將TRPV1通道激活[14-15]。非組胺依賴的癢信號(hào)通路中PAR2是最先鑒定和激活的受體分子，然后PAR2依次激活PLC和下游的蛋白激酶C，從而使TRPV1介導(dǎo)的離子內(nèi)流增加；PAR2還可以通過激活蛋白激酶A來增加TRPV1活性[16]，而激活的TRPV1可以激活細(xì)胞因子，參與癢覺調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果顯示濕疹大鼠背部皮膚組織中H1R、PAR-2、TRPV1蛋白表達(dá)水平升高，提示濕疹瘙癢的產(chǎn)生與H1R、PAR-2/TRPV1信號(hào)通路的上調(diào)有關(guān)，而龍膽瀉肝湯和氯雷他定均可以抑制H1R、PAR-2、TRPV1蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮抗瘙癢的作用，且25.2 g·kg-1劑量的龍膽瀉肝湯對(duì)H1R、PAR-2/TRPV1信號(hào)通路的抑制作用與氯雷他定相當(dāng)。

P38MAPK信號(hào)通路是一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該信號(hào)通路在真核生物的進(jìn)化中相對(duì)保守，參與細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡及炎癥等進(jìn)程[17-18]。該通路由典型的三級(jí)由促分裂原活化的蛋白激酶激酶（Mitogenactivated protein kinase kinase,MAPKK）、促分裂原活化的蛋白激酶激酶激酶（Mitogen-activated protein kinase kinase kinase,MAPKKK）及P38MAPK組 成。MAPKKK首先磷酸化激活MAPKK，活化的MAPKK接著磷酸化激活P38MAPK，活化的P38MAPK激活下游因子[19-20]。P38MAPK在去磷酸化狀態(tài)下無生物學(xué)活性，只有在磷酸化狀態(tài)（p-P38MAPK）才能與底物結(jié)合，從而引起一系列病理變化[21-24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示濕疹發(fā)生時(shí)p-P38MAPK/P38MAPK比值增加，表明P38MAPK磷酸化水平升高，而龍膽瀉肝湯則可以降低P38MAPK磷酸化水平，下調(diào)P38MAPK信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗炎作用，且12.6 g·kg-1和25.2 g·kg-1劑量的龍膽瀉肝湯對(duì)P38MAPK信號(hào)通路的抑制作用均強(qiáng)于氯雷他定。

本實(shí)驗(yàn)小結(jié)如下：①龍膽瀉肝湯能夠降低濕疹大鼠耳腫脹程度，減輕皮膚組織海綿樣水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度，表明了龍膽瀉肝湯對(duì)濕疹大鼠具有較好地治療作用。②濕疹大鼠背部皮膚組織中H1R、PAR-2、TRPV1蛋白表達(dá)水平升高，提示濕疹瘙癢的產(chǎn)生與H1R、PAR-2/TRPV1信號(hào)通路的上調(diào)有關(guān)，而龍膽瀉肝湯可以抑制H1R、PAR-2、TRPV1蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮抗瘙癢的作用。③濕疹的發(fā)生與P38MAPK的磷酸化水平相關(guān)，而龍膽瀉肝湯則可以降低P38MAPK磷酸化水平，下調(diào)P38MAPK信號(hào)通路，從而發(fā)揮抗炎作用。④6.3g·kg-1劑量的龍膽瀉肝湯對(duì)濕疹的干預(yù)作用弱于氯雷他定，12.6 g·kg-1和25.2 g·kg-1劑量的龍膽瀉肝湯對(duì)濕疹的干預(yù)作用與氯雷他定相仿。以上觀點(diǎn)為龍膽瀉肝湯在濕疹治療領(lǐng)域的深入開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

辨證論治是中醫(yī)精髓所在，濕疹臨床治療也要審證求因，做到藥證相對(duì)。與H1受體拮抗藥和糖皮質(zhì)激素比較，龍膽瀉肝湯可針對(duì)濕疹病癥辨證調(diào)體，除濕去熱，對(duì)濕疹的治療效果顯著，且在止癢、抗炎兩個(gè)層面均優(yōu)于傳統(tǒng)西藥，但由于方藥組成復(fù)雜，難以明確其止癢和抗炎的有效成分，亦或是多種成分共同作用，故為防治濕疹尋找更精準(zhǔn)有效的中醫(yī)藥療法將是本課題組以后的研究方向。