劉 峰，朱民強(qiáng)，劉文亞＊＊

（1.安徽省滁州市第二人民醫(yī)院 滁州 239000；2.南京理工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院 南京 210094）

藏藥波棱瓜子殼是葫蘆科植物波棱瓜（Herpetospermum caudigerumWall.）的干燥成熟果殼，《迪慶藏藥》記載波棱瓜果殼味極苦，其功效同波棱瓜子[1]。臨床上波棱瓜子常用來(lái)治療多種肝炎、膽囊炎疾病[2]，其主要成分總木脂素具有對(duì)抗多種化學(xué)性肝損傷的作用[3-5]。然而，對(duì)于波棱瓜子殼是否有抗肝損傷效果尚未報(bào)道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，波棱瓜子殼中幾乎不含木脂素類，而含有豐富的總甾醇（Total Sterols fromHerpetospermum caudigerumWall.Shell，HCSTS）。因此，本研究探究了HCSTS對(duì)肝損傷的保護(hù)作用。

近年來(lái)，研究表明植物甾醇具有明顯的抗炎、抗腫瘤作用[6-9]，如α-菠甾醇不依賴于腎上腺垂體系統(tǒng)能明顯抑制小鼠熱燙腫[10]，β-谷甾醇有抗炎和解熱活性[11]，豆甾三烯醇通過(guò)抑制NF-κB能減緩受損肝細(xì)胞向肝纖維化和肝癌方向發(fā)展[12]。此外，顏寧等[13]利用冷凍電鏡技術(shù)揭示了甾醇類化合物在SREBP途徑中的傳感機(jī)制，而SREBP參與抗炎脂肪酸的生物合成又與TLR4配體激活相關(guān)[14]。這些研究表明，不同的甾醇發(fā)揮抗炎的機(jī)制不同。因此，定量分析HCSTS中的主要成分，對(duì)于揭示抗肝損傷機(jī)制顯得尤為重要。然而，甾醇類極性小、種類多，且紫外吸收較弱，對(duì)定性和定量分析都造成了巨大挑戰(zhàn)。文獻(xiàn)上多記載用GC-MS[15]或柱前衍生[16]的方法進(jìn)行分析，鮮有用HPLC結(jié)合PDA檢測(cè)器在C18柱上直接定量分析。并且，值得注意的是，由于植物樣品復(fù)雜的基質(zhì)干擾，需對(duì)所開發(fā)方法的專屬性進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，才能使定量更加準(zhǔn)確。

因此，本研究首次對(duì)HCSTS抗四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)小鼠肝損傷作用進(jìn)行了探究，結(jié)合病理切片、生化分析、炎癥相關(guān)指標(biāo)轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)等，初步探討了其作用機(jī)制。然后，對(duì)于HCSTS中的主要甾醇，開發(fā)一種無(wú)衍生、無(wú)皂化、方便快捷的HPLC分析方法，結(jié)合靈敏度更高的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（Ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass，UHPLC-MS/MS）進(jìn)一步驗(yàn)證了色譜方法的專屬性。此方法重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)，為HCSTS進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只SPF級(jí)雄性ICR小鼠（體質(zhì)量20±2 g）購(gòu)自南京市青龍山繁育場(chǎng)，生產(chǎn)許可證編號(hào)SCXK（浙）2019-0002，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：No.410000000000001134。將小鼠飼養(yǎng)于不銹鋼籠盒中,飼養(yǎng)室環(huán)境保持良好通風(fēng)，室溫為25±2℃，相對(duì)濕度為50±10%，12 h光照和12 h黑暗循環(huán)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均按照南京理工大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)（ACUC-NJUST-20180409）提供的指南進(jìn)行。

1.2 儀器與試藥

高效液相色譜儀CTO-20AT，配有一個(gè)InertSustain C18色譜柱（4.6×250 mm,5 μm）均購(gòu)于日本島津公司；Triple TOF 5600+質(zhì)譜系統(tǒng)（AB SCIEX,USA）配備一個(gè)ExionLC（AB SCIEX,USA）超高效液相色 譜 儀 （Ultra High Performance Liquid Chromatography，UPLC）用于HCSTS一級(jí)（TOF MS）和二級(jí)（TOF MS/MS）質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集。電子天平（精度為0.0001 g）型號(hào)為AR224CN（奧豪斯儀器）；NIKON ECLIPSE Ti2倒置顯微鏡購(gòu)于日本尼康公司；7,22,25-豆甾三烯醇和α-菠甾醇為實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)核磁氫譜、碳譜、高分辨質(zhì)譜以及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對(duì)鑒定。HCSTS為實(shí)驗(yàn)室自制，其植物來(lái)源—波棱瓜子殼采自西藏自治區(qū)林芝地區(qū)。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine transaminase，ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Aspartate transaminase，AST）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；組織固定液（中性，500 mL）購(gòu)于武漢賽維爾生物科技有限公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitativereal time-reverse transcription，qRT-PCR）型號(hào)為ABI 7300 Real Time PCR System，相關(guān)引物序列信息如下：β-actin上游引物5-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3’，下游引物5’-GCCGGACTCATCGTACTCC-3’；IL-1β上游引物5’-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3’，下 游 引 物5’-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3’；IL-6上游引物5’-CTGCAAGAGACTTCCATCCAG-3’，下 游 引 物5’-AGTGGTATAGACAGGTCTGTTGG-3’；IL-10上游引物5’-CTTACTGACTGGCATGAGGATCA-3’，下游引物5’-GCAGCTCTAGGAGCATGTGG-3’；COX-2上游引物5’-TACCCTCCTCACATCCCTGA-3’，下游引物5’-CCTGCTTGAGTATGTCGCAC-3’,引物由南京擎科生物科技有限公司協(xié)助合成。Trizol試劑購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)于加拿大abm公司，KAPA SYBR?快速熒光QPCR試劑盒購(gòu)于Kapa Biosystems Pty(Ltd)，RNase Free ddH2O購(gòu)于北京索萊寶公司。高效液相色譜用甲醇為色譜級(jí)，CCl4購(gòu)于天津科密歐，水飛薊素(Silymarin,SIL，貨號(hào)S25549-25g)購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司，無(wú)水乙醚購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)，藥用級(jí)橄欖油購(gòu)于上海阿拉丁生物科技股份有限公司，其余試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組、給藥與CCl4誘導(dǎo)肝損傷模型的建立

在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中適應(yīng)馴養(yǎng)一周后，60只雄性ICR小鼠被隨機(jī)分為6組，每組10只。分別是空白組（CON）、肝損傷模型組（MODEL）、水飛薊素陽(yáng)性藥組（SIL,50 mg·kg-1，bw），HCSTS低劑量組（LD,10 mg·kg-1，bw）、中劑量組（MD,20 mg·kg-1，bw）和高劑量組（HD,50 mg·kg-1，bw），其中SIL組劑量參考文獻(xiàn)[17]設(shè)置，HCSTS的低、中、高劑量參考文獻(xiàn)中α-菠甾醇的量[18]設(shè)置。SIL和HCSTS混懸于0.5%的CMC-Na溶液中，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，所有小鼠均喂食相同的飼料和滅菌飲用水。各組小鼠于每天早上10點(diǎn)連續(xù)灌胃給 藥7天（灌 胃 體 積 為0.1 mL/10g，bw），CON和MODEL組則在相同的時(shí)間點(diǎn)灌以不含藥物的CMCNa溶液。第7天給藥2 h后，除CON組外的其他組均腹腔注射（10 mL·kg-1，bw）0.3% CCl4-橄欖油（v/v）溶液[19]，誘導(dǎo)急性肝損傷，CON組給以等體積的橄欖油。

2.2 血液收集生化分析

造模后，禁止飲食，讓其自由飲水。24 h后，用脫脂棉蘸取適量乙醚在封閉的玻璃缸中實(shí)施麻醉，麻醉后，以摘眼球取血方式采集每只小鼠約0.5 mL全血于干凈的EP管中。將全血于4℃靜置2 h后，3000 r·min-1離心20 min，取血清，按照試劑盒中的指導(dǎo)方法，測(cè)定血清中ALT和AST的活力水平。

2.3 肝組織采集及病理檢查

各組小鼠取完血后，脫頸處死。隨機(jī)挑選每組3只小鼠，取肝臟小葉部分同一位置，用生理鹽水沖洗表面血液。置于組織固定液中24 h，常規(guī)石蠟包埋、切片，經(jīng)蘇木精-伊紅（H&E）染色后，置于顯微鏡下觀察，采集圖像并分析。

2.4 qRT-PCR測(cè)定IL-1β、IL-6、IL-10和COX-2轉(zhuǎn)錄水平

2.4.1 各組肝組織總RNA提取以及mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA

根據(jù)Trizol試劑盒指導(dǎo)方法提取各組肝組織總RNA，用微量紫外分光光度計(jì)對(duì)其濃度（OD260）和純度（OD260和OD280的比值）進(jìn)行測(cè)定。然后對(duì)各個(gè)樣品的RNA（1μg·μL-1）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)反應(yīng)。具體步驟為：加入逆轉(zhuǎn)錄酶2 μL，RNase Free ddH2O 8 μL。逆轉(zhuǎn)錄程序：25℃,10 min；42℃,15 min；85℃,5 min；將得到的cDNA置于-20℃保存，以備qRT-PCR用。

2.4.2 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

取KAPA SYBR?快速熒光QPCR試劑5 μL，上游引物和下游引物各1 μL，模板（cDNA溶液）2 μL，RNase Free ddH2O 1 μL，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性3 s，60℃退火及延伸30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)中所用引物序列信息見“1.2”項(xiàng)。每個(gè)樣品三個(gè)重復(fù)，2-ΔΔCT(Livak)法用于計(jì)算被測(cè)cDNA的相對(duì)表達(dá)水平[20]，每個(gè)目標(biāo)基因（IL-1β、IL-6、IL-10和COX-2）的相對(duì)表達(dá)水平是以β-actin為內(nèi)參來(lái)計(jì)算。

2.5 甾醇混合對(duì)照品與HCSTS溶液的制備

分別精密稱取干燥至恒重的7,22,25-豆甾三烯醇和α-菠甾醇各5 mg，適量甲醇溶解后，定容至10 mL，配制成濃度均為0.5 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。精密稱取干燥至恒重的HCSTS兩份各5 mg，分別置于10 mL和100 mL容量瓶中，加色譜甲醇，制成含HCSTS為0.5 mg·mL-1和0.05 mg·mL-1的供試品溶液分別供HPLC和UPLC-MS/MS檢測(cè)。

2.6 HPLC色譜條件

色譜柱采用InertSustain C18柱（4.6×250 mm，5μm），洗脫方式為100%甲醇等度洗脫，流速為1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)205 nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為10μL，色譜分離和色譜圖采集時(shí)間均為30 min。

2.7 專屬性考察

2.7.1 HPLC專屬性考察

自動(dòng)進(jìn)樣器精確地吸取“2.5”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液和供試溶液各10μL，按照“2.6”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，并采集色譜圖。

2.7.2 UPLC-MS/MS考察色譜方法專屬性

在ExionLC系統(tǒng)上進(jìn)行供試樣品（0.05 mg·mL-1的HCSTS）色譜分離，柱子為Phenomenex Kinetex?C18（2.1×100 mm,2.6μm），洗脫方式為100%甲醇等度洗脫，進(jìn)樣量為2μL，流速為0.4 mL·min-1，柱溫為40℃。SCIEX TRIPLE TOF 5600+質(zhì)譜系統(tǒng)用于一級(jí)（TOF MS）和二級(jí)（TOF MS/MS）質(zhì)譜數(shù)據(jù)的采集，離子源為DuoSprayTM，電離方式為大氣壓化學(xué)電離（Atmospheric Pressure Chemical ionization,APCI）正離子模式。對(duì)質(zhì)譜參數(shù)[21]進(jìn)行了優(yōu)化如下：離子源霧化氣（Ion Source Gas1,Gas1）60 psi，離子源輔助氣（Ion Source Gas2,Gas2）60 psi,簾氣（Curtain gas,CUR）40 psi，離子源溫度（source temperature）500℃，離 子 噴 霧 電 壓（IonSapary Voltage Floating，ISVF）5500 V；一級(jí)母離子m/z范圍：100-1000 Da，二級(jí)子離子質(zhì)荷比范圍：50-1000 Da，一級(jí)質(zhì)譜采集時(shí)間為每張譜圖100 ms，二級(jí)質(zhì)譜采集時(shí)間為每張譜圖50 ms。二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)為數(shù)據(jù)依賴性采集（information dependent acquisition，IDA）獲得，且采用high sensitivity模式，去簇電壓（Declustering potential，DP）：140 V，碰撞能（Collision Energy，CE）：45±15 V。數(shù)據(jù)采集軟件為Analyst TF（SCIEX，版本1.8.1），SCIEX OS軟件用于數(shù)據(jù)處理。

圖1 HCSTS不同劑量組對(duì)肝損傷小鼠血清中ALT和AST活力的影響（xˉ±s,n=8）

2.8 線性關(guān)系、精密度與穩(wěn)定性考察

2.8.1 線性關(guān)系考察

為了評(píng)估方法的線性是否良好，將“2.5”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液加色譜甲醇稀釋至一系列濃度（0.5、0.4、0.3、0.2和0.1 mg·mL-1），按“2.6”項(xiàng)的色譜條件精確吸取10μL，分別采集色譜圖，并記錄峰面積。分別以7,22,25-豆甾三烯醇和α-菠甾醇的峰面積（Area）為縱坐標(biāo)（Y），濃度（mg·mL-1）為橫坐標(biāo)（X），繪制線性回歸方程。

2.8.2 精密度與穩(wěn)定性考察

按“2.6”項(xiàng)下的色譜條件精確吸取“2.5”項(xiàng)混合對(duì)照品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，并記錄7,22,25-豆甾三烯醇和α-菠甾醇的峰面積。精密吸取“2.5”項(xiàng)下HCSTS的供試品溶液（0.5 mg·mL-1）10 μL，于0、2、4、8、16、24 h分別進(jìn)樣，記錄每個(gè)時(shí)間點(diǎn)7,22,25-豆甾三烯醇和α-菠甾醇的峰面積。

2.9 重復(fù)性與加樣回收率試驗(yàn)

取“2.5”項(xiàng)HCSTS（0.5 mg·mL-1）供試品溶液共6份，并按“2.6”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣量均為10μL，記錄峰面積。取同一供試品溶液，每份1 mL，共取6份，精確加入混合對(duì)照品溶液0.8 mL，按“2.6”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算7,22,25-豆甾三烯醇和α-菠甾醇的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD。

2.10 樣品的含量測(cè)定

取3份“2.5”項(xiàng)中所述的HCSTS溶液（0.5 mg·mL-1），按“2.6”項(xiàng)的色譜條件精密吸取10μL。并采用外標(biāo)法（external standard）進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，根據(jù)工作曲線計(jì)算HCSTS中7,22,25-豆甾三烯醇和α-菠甾醇的含量。

2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

數(shù)據(jù)處理采用軟件Graphpad 8.0.1版本，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）”表示。肝組織HE染色圖中的壞死面積定量采用ImageJ軟件（版本為1.53k）。使用單因素方差分析（one-way ANOVA）和t檢驗(yàn)（Ttest）進(jìn)行組間數(shù)據(jù)比較。以P＜0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，P＜0.01表示統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 小鼠血清中ALT和AST活力測(cè)定結(jié)果

肝細(xì)胞受損后，血清中AST和ALT的升高非常敏感（圖1A、圖1B），尤其以ALT的升高最為明顯。CON組中，ALT和AST的活力約為20 IU·L-1，MODEL組中ALT顯著增加，其活力達(dá)到了140 IU·L-1。同時(shí)，AST活力也升高到了約55 IU·L-1，說(shuō)明急性肝損傷造模成功。SIL組能顯著降低ALT和AST的活力，且對(duì)AST活力的降低更為明顯。HCSTS給藥后，LD組可能由于較低的給藥劑量(10 mg·kg-1bw)，與MODEL組沒(méi)有顯著差異；MD組中ALT和AST活力分別下降了20 IU·L-1（P＜0.01）和15 IU·L-1（P＜0.05）；與MODEL組 相比，HD組的ALT和AST活力均顯著下降，其中ALT下降 了40 IU·L-1（P＜0.01），AST下 降 了20 IU·L-1（P＜0.01）。HD組中ALT活力和AST活力與SIL組均無(wú)顯著性差異，表明HCSTS在50 mg·kg-1bw的劑量下顯示出了與SIL相當(dāng)?shù)目垢螕p傷效果。

3.2 組織病理學(xué)分析

肝組織病理切片相比于血清生化，可以從表觀上反映出肝細(xì)胞形態(tài)改變以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理狀態(tài)。組織切片顯示，在空白組中，肝小葉結(jié)構(gòu)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)正常（圖2A）。MODEL組的肝組織切片中有明顯的肝細(xì)胞灶性壞死，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)喪失，出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，且以中央靜脈周圍最為嚴(yán)重（MODEL組箭頭所指）。炎性細(xì)胞浸潤(rùn)多發(fā)生于匯管區(qū)，表現(xiàn)在細(xì)胞核體積縮小，細(xì)胞結(jié)構(gòu)喪失，或細(xì)胞形態(tài)不正常。SIL組中，肝細(xì)胞形態(tài)和炎性浸潤(rùn)均有一定程度的改善。LD組中，血管周圍的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較MODEL組有所減少。隨著HCSTS的劑量增加（如MD和HD組），炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞形態(tài)有了明顯的改善（圖2B）。對(duì)肝組織壞死面積定量分析結(jié)果顯示，HCSTS劑量依賴性地減少肝組織壞死面積，與血清生化結(jié)果相吻合。其中，HD組相比于MODEL組顯著減少了約75%肝組織壞死面積（P＜0.01）（圖2C）。組織病理切片表明，HCSTS在LD、MD和HD劑量下均能減少細(xì)胞壞死和炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，其中，HD組（50 mg·kg-1bw）的改善效果最為明顯，表現(xiàn)出了顯著的抗肝損傷效果。

圖2 各組肝臟組織切片HE染色圖（A）（HE×200），各組肝臟組織切片HE染色原圖的RGB分離圖（B），對(duì)HE染色圖中的壞死面積進(jìn)行定量（C）（xˉ±s,n=3）

3.3 炎癥相關(guān)指標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄水平測(cè)定

從血清生化水平和組織切片探究了HCSTS抗肝損傷的效果之后，又從炎癥相關(guān)指標(biāo)的基因表達(dá)進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示：與CON組相比，MODEL組中IL-1β，IL-6以及COX-2的基因表達(dá)水平均顯著升高，表明造模成功（P＜0.05或P＜0.01）。與MODEL比較，HCSTS的HD組均能顯著降低促炎細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6）以及炎癥通路相關(guān)酶COX-2的基因表達(dá)（P＜0.05），并且，HD能顯著升高抑炎細(xì)胞因子IL-10的基因表達(dá)（P＜0.05）（圖3）。

圖3 肝組織中炎癥指標(biāo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平（xˉ±s,n=3）

3.4 色譜條件的專屬性

HCSTS在組織病理和血清生化水平上能改善CCl4誘導(dǎo)的肝損傷，其主要成分為7,22,25-豆甾三烯醇和α-菠甾醇，對(duì)于這兩種甾醇進(jìn)行含量測(cè)定，有助于揭示HCSTS中抗肝損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究采用供試品溶液和混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的色譜圖，根據(jù)其分離度和保留時(shí)間評(píng)估色譜條件的專屬性。結(jié)果顯示:供試品溶液色譜圖4B中的1、2號(hào)峰與混合對(duì)照品溶液色譜圖4A中的1、2號(hào)峰保留時(shí)間相同，且與其他雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離，表明色譜條件專屬性良好。

圖4 混合對(duì)照品（A）和供試品（B）溶液的HPLC圖

由于本色譜條件為100%甲醇洗脫，洗脫能力較強(qiáng)，為排除甾醇類是否與其他成分（色素、脂肪酸等）“共流出”而影響定量，本研究利用靈敏度更高的UPLC MS/MS檢測(cè)了HCSTS樣品，根據(jù)其總離子流圖（圖5A、圖6A），發(fā)現(xiàn)1和2號(hào)峰均與其他峰完全分離，根據(jù)質(zhì)荷比（1,2號(hào)峰分別為393.3543和395.3560，兩者均為[M+H-H2O]+），提取1和2號(hào)峰的離子流圖（XIC，如圖5B和圖6B中的紅色峰），發(fā)現(xiàn)HCSTS中兩者的XIC圖也能與其臨近峰達(dá)到基線分離，兩個(gè)峰的一級(jí)質(zhì)譜圖顯示單一的質(zhì)譜峰，幾乎沒(méi)有其他物質(zhì)的干擾(如圖5C和6C)。對(duì)1和2峰的二級(jí)質(zhì)譜進(jìn)行碎片離子解析（圖5D、圖6D），進(jìn)一步證明了兩者結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性和此洗脫方法在不同類型色譜柱的適用性，主要特征離子碎片見表1。相比于HPLC通過(guò)基線是否分離驗(yàn)證專屬性，UPLC-MS/MS進(jìn)一步證明了7,22,25-豆甾三烯醇和α-菠甾醇在100%甲醇等度洗脫的條件下，幾乎沒(méi)有“共流出”峰，說(shuō)明此洗脫方法對(duì)兩者分離度好、專屬性強(qiáng)。

表1 7,22,25-豆甾三烯醇和α-菠甾醇的主要特征離子碎片

圖5 UPLC-MS/MS對(duì)7,22,25-豆甾三烯醇專屬性考察

圖6 UPLC-MS/MS對(duì)α-菠甾醇的專屬性考察

3.5 線性關(guān)系、精密度和穩(wěn)定性

在線性關(guān)系考察中，7,22,25-豆甾三烯醇和α-菠甾醇的線性回歸方程分別為Y1=11280457X1+74950（R2=0.9991）；Y2=7597146X2+19443（R2=0.9998）。兩者分別在1.33-500和2.54-500 μg·mL-1范圍內(nèi)，濃度與峰面積之間線性關(guān)系良好；重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)行精密度實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，計(jì)算得7,22,25-豆甾三烯醇和α-菠甾醇峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.16%（n=6）和0.43%（n=6），表明該方法的精密度良好。在穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)考察中，根據(jù)兩者的峰面積，計(jì)算得7,22,25-豆甾三烯醇和α-菠甾醇峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為0.59%（n=3）和0.66%（n=3），表明供試品溶液在24 h內(nèi)較為穩(wěn)定。

3.6 重復(fù)性和加樣回收率

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，計(jì)算得7,22,25-豆甾三烯醇和α-菠甾醇的平均含量為0.1022和0.2711 mg·mL-1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為1.97%（n=6）和1.62%（n=6），均小于2%，表明該方法重復(fù)性良好。加樣回收率實(shí)驗(yàn)中，7,22,25-豆甾三烯醇和α-菠甾醇的加樣回收率結(jié)果見表2。

表2 7,22,25-豆甾三烯醇和α-菠甾醇的加樣回收率（mg·mL-1，n=6）

3.7 HCSTS中兩個(gè)主要成分的含量測(cè)定

由表3可知，波棱瓜子殼總甾醇（HCSTS）中，α-菠甾醇含量最高，為HCSTS中的主要成分，占54.22%，其次是7,22,25-豆甾三烯醇，含量為20.44%，兩者約占HCSTS的75%。

表3 兩個(gè)主要甾醇樣品的含量測(cè)定（xˉ±s,n=3）

4 討論

植物甾醇（phytosterols）是一類具有抗炎、抗癌、降低血清膽固醇等多種生理功能的天然化合物，它們顯示出對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠腹膜炎的抗炎作用以及抗結(jié)直腸癌活性[22]。這些作用主要是由于它們對(duì)STAT3、IKK/NF-κB和PI3K-Akt信號(hào)通路相關(guān)的酶如環(huán)氧輔酶2（COX-2）的抑制而發(fā)揮抗炎[23]作用。

本研究中，對(duì)HCSTS以LD、MD、HD三個(gè)劑量組別進(jìn)行了抗CCl4誘導(dǎo)的肝損傷試驗(yàn)，并以水飛薊素作為陽(yáng)性對(duì)照，水飛薊素作為一種臨床上常用的保肝藥物，其可以通過(guò)抑制STAT3信號(hào)通路發(fā)揮抗炎作用[24]。本研究結(jié)果表明：在肝組織病理切片、肝酶水平，HCSTS呈劑量依賴性地減輕CCl4誘導(dǎo)的肝損傷，HD組能顯著的改善肝損傷后的生化指標(biāo)和組織形態(tài)，并能顯著降低促炎因子IL-1β,IL-6的基因表達(dá)，而IL-6是STAT3的激活因子[25]，推測(cè)HCSTS能通過(guò)抑制STAT3信號(hào)通路發(fā)揮抗肝損傷作用，與文獻(xiàn)[26]相吻合。HD組使STAT3和IKK/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)酶COX-2基因表達(dá)水平降低，并能使抑炎因子IL-10顯著升高，共同作用減輕CCl4誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[27]。HCSTS中不同結(jié)構(gòu)的甾醇在抗炎作用方面存在巨大差異[28]，因此，對(duì)兩個(gè)主要甾醇進(jìn)行含量測(cè)定，對(duì)于后續(xù)的“構(gòu)-效”關(guān)系研究尤為重要。

然而，植物甾醇不僅極性小、而且極性也很接近[29]，且紫外吸收較弱，分析較為困難，文獻(xiàn)多采用衍生后再進(jìn)行含量測(cè)定[30]。柱前衍生法前處理較為復(fù)雜，不適合高通量分析。本研究選擇了在35℃下用100%甲醇以1 mL·min-1的流速等度洗脫。經(jīng)優(yōu)化的HPLC法含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)HCSTS中主要是7,22,25-豆甾三烯醇（20.4%）和α-菠甾醇（54.2%）。本研究曾嘗試乙腈、乙腈-水作為HPLC流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)分離效果不理想。可能是由于乙腈極性大，對(duì)甾醇溶解度較低。而甲醇-水（95%、98%甲醇）作為流動(dòng)相，雖能洗脫下來(lái)，但保留時(shí)間太長(zhǎng)。最終，確定100%甲醇作為流動(dòng)相。然而，甾醇類與其他類植物成分（如脂肪酸類）都在近紫外端有較弱的紫外吸收，且100%甲醇洗脫系統(tǒng)有著很強(qiáng)的洗脫能力，相應(yīng)地，選擇性就會(huì)變?nèi)?。為?yàn)證甾醇與其他類物質(zhì)是否“共流出”，本研究采用UPLC-MS/MS考察其專屬性。UPLC-MS/MS以其高靈敏度和定性鑒定能力，進(jìn)一步證明了100%甲醇洗脫系統(tǒng)對(duì)HCSTS中兩個(gè)主峰分離的專屬性。本課題組前期對(duì)流速和溫度進(jìn)行了考察[31]，隨著流速的增大，相應(yīng)的甾醇保留時(shí)間越短，但是甾醇的分離度變差，柱壓也隨著升高。隨著溫度的升高，保留時(shí)間逐漸縮短，然而，對(duì)分離度幾乎沒(méi)有影響，考慮到溫度過(guò)高對(duì)柱子的壽命和儀器使用的安全性風(fēng)險(xiǎn)加大，將柱溫設(shè)置為35℃。

本研究以CCl4誘導(dǎo)的肝損傷為模型，通過(guò)組織病理學(xué)和血清生化、炎癥相關(guān)指標(biāo)等方面考察了HCSTS的抗肝損傷作用，其作用機(jī)制可能是：降低IL-1β,IL-6等促炎細(xì)胞因子和COX-2的表達(dá)，并升高抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)，從而減輕CCl4誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。結(jié)合RP-HPLC對(duì)活性成分的含量測(cè)定，揭示了HCSTS中7,22,25-豆甾三烯醇和α-菠甾醇可能是波棱瓜子殼抗肝損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)。兩個(gè)植物甾醇的差別在于側(cè)鏈所含的雙鍵個(gè)數(shù)，而這種差異也是甾醇類不同生理活性的先決條件，兩者是否協(xié)同發(fā)揮抗肝損傷作用有待于進(jìn)一步研究。