宋敬茹 武超 曹紅燕 謝咚 王錚 劉璐 王丹 孫明瑜 邊艷琴

二甲基亞硝胺(Dimethylnitrosamine，DMN)誘發(fā)的肝纖維化大鼠模型已成為研究肝纖維化及肝硬化的經(jīng)典動(dòng)物模型[1,2]。研究證實(shí)，肝星狀細(xì)胞活化后轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞外膠原沉積增多[3]。前期研究采用全基因芯片結(jié)合生物信息學(xué)分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)脂肪酸代謝異常是DMN誘導(dǎo)肝纖維化發(fā)生的另一重要原因[2]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，對(duì)生物信息分析結(jié)果深入挖掘，以期闡明脂肪酸代謝異常引起大鼠肝纖維化發(fā)生的重要機(jī)制。

資料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與材料

(一)動(dòng)物 Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量(200±15)g，清潔級(jí)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物合格證：SCXK(滬)2008-0003。于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行飼養(yǎng)、造模及觀察，自由飲食。

(二)試劑及儀器 甲醛、甲醇、中性樹(shù)膠、二甲苯、無(wú)水乙醇等均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DMN購(gòu)自和光純藥工業(yè)株式會(huì)社；石蠟購(gòu)自德國(guó)Leica公司；天狼猩紅購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；基因檢測(cè)及分析所需試劑及儀器設(shè)備均由上海生物芯片公司提供。

二、實(shí)驗(yàn)方法

(一)造模方法 參照Ala-Kokko方法造模[4]。模型組大鼠以10 mg/kg劑量于每周前3天連續(xù)腹腔注射0.5% 的DMN溶液(以0.9% NaCl稀釋)，持續(xù)共4周，對(duì)照組大鼠腹腔注射等量的0.9% NaCl。分別在造模2周末、4周末殺鼠取材評(píng)估組織病理變化。

(二)樣品的采集與處理 在實(shí)驗(yàn)2周末和4周末，采用3%戊巴比妥鈉，以2 ml/kg劑量腹腔注射麻醉后，打開(kāi)腹腔，經(jīng)下腔靜脈采血。待血液抽凈后，摘取肝臟，然后選取肝臟最厚一葉作為目標(biāo)組織，切取1.0 cm×1.0 cm肝組織2塊，4%甲醛固定，剩余肝組織EP管中-80℃保存?zhèn)溆?。組織標(biāo)本經(jīng)過(guò)脫水、包埋、切片處理后，進(jìn)行HE和天狼猩紅染色[5]，觀察組織病理學(xué)變化。采集血液4℃靜置3 h后, 以3000 r/min離心15 min，分離血清，-80℃保存?zhèn)溆?。ALT、AST、TC和FFA檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

(三)肝組織基因芯片雜交實(shí)驗(yàn) 采用Trizol試劑盒提取總RNA→純化→合成cDNA→純化，參照BioArray(TM)HighYield(TM)RNA轉(zhuǎn)錄標(biāo)記試劑盒方法合成cRNA→將cRNA片段雜交于Afymetrix Rat2302.0芯片→洗脫→染色→掃描芯片?；蛐酒篈fymetrix Rat2302.0基因表達(dá)譜芯片，共載基因探針31099個(gè)。

(四)基因芯片的數(shù)據(jù)處理、差異基因篩選和生物信息分析 基因芯片的數(shù)據(jù)處理、差異基因篩選和生物信息分析參照文獻(xiàn)[6]。利用R語(yǔ)言進(jìn)行通路富集分析，利用 Cytoscape 3. 8. 0繪制差異基因參與的脂代謝信號(hào)網(wǎng)絡(luò)圖。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、各組大鼠肝組織病理變化

HE染色結(jié)果提示，與對(duì)照組比較，造模2周時(shí)，肝組織內(nèi)可見(jiàn)大量炎細(xì)胞彌漫分布于肝竇內(nèi)，肝臟結(jié)構(gòu)開(kāi)始出現(xiàn)紊亂；隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，肝組織開(kāi)始出現(xiàn)廣泛的肝細(xì)胞壞死、肝小葉結(jié)構(gòu)消失。膠原沉積在中央靜脈和門脈區(qū)并開(kāi)始向肝竇蔓延是肝纖維化形成的標(biāo)志。天狼猩紅染色結(jié)果示，相較于對(duì)照組，造模2周組位于中央靜脈及門脈區(qū)域的結(jié)締組織明顯增多，并向肝竇持續(xù)蔓延，形成不完全間隔，提示肝纖維化形成；造模4周時(shí)膠原纖維明顯較2周時(shí)增多、增厚、變粗，相鄰的纖維間隔之間彼此連接、并包繞肝小葉形成假小葉，肝臟結(jié)構(gòu)被改變，膠原沉積明顯增多，提示肝纖維化已向肝硬化轉(zhuǎn)變，造模成功。見(jiàn)圖1。

A、B、C：HE染色×200；D、E、F：天狼猩紅染色×100

二、各組大鼠肝功能與血脂變化

隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠血清ALT、AST呈現(xiàn)遞增性上升，TG先升高后降低，F(xiàn)FA含量先降低后升高。如表1所示，與對(duì)照組比較，4WDMN組大鼠血清ALT、AST酶活性明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；2WDMN組大鼠血清TG升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(考慮是樣本離散度太大)；2WDMN組大鼠血清FFA明顯降低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；4WDMN組大鼠血清TG與FFA含量與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

三、差異基因分析

選取差異表達(dá)大于2倍的基因，并比對(duì)其中共同存在的差異基因。2WDMN組與對(duì)照組比較顯著差異基因數(shù)目共有133個(gè)，4WDMN組與對(duì)照組比較顯著差異基因共有98個(gè)，兩組共同的差異基因共有55個(gè)。55個(gè)共同差異基因中，上調(diào)的基因有40個(gè)，下調(diào)的基因有15個(gè)。在上調(diào)基因中，UGT2B28、FABP5為變化最為顯著基因，在2WDMN中變化差異倍數(shù)均大于5倍，UGT2B28同時(shí)在4WDMN組中變化差異倍數(shù)也大于5倍；在下調(diào)的基因中，CYP2C9、STAC3、MLC1為變化最為顯著基因，在2WDMN、4WDMN中變化差異倍數(shù)均大于4倍。

四、共同差異基因參與生物學(xué)功能及信號(hào)通路

分析55個(gè)共同差異基因參與調(diào)控的生物學(xué)功能及信號(hào)通路，對(duì)共享基因功能富集，根據(jù)Pvalue值從高到低排列，結(jié)果顯示共享基因參與的前10條通路，其功能主要涉及蛋白酶結(jié)合、細(xì)胞外基質(zhì)合成、脂肪酸代謝等方面，見(jiàn)圖2。其中，參與脂肪酸代謝功能的通路共有5條， CYP2C9、FABP5、UGT2B28參與了脂代謝所有信號(hào)通路，見(jiàn)圖3，提示這些基因在DMN誘導(dǎo)脂代謝形成中發(fā)揮重要作用。

圖2 共享差異基因功能富集分析

圖3 差異基因參與的脂代謝信號(hào)網(wǎng)絡(luò)圖

討 論

脂質(zhì)代謝紊亂與肝星狀細(xì)胞激活相關(guān)，可促進(jìn)肝纖維的發(fā)生發(fā)展[7,8]。本研究采用全基因芯片技術(shù)，發(fā)現(xiàn)差異基因主要參與脂代謝、炎癥、免疫和血管新生的調(diào)控，可能參與了肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。DNA 的損傷修復(fù)貫穿于肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，脂肪酸的代謝紊亂在肝纖維化向肝硬化動(dòng)態(tài)演變的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。以脂肪酸合成增加為主的脂代謝紊亂，早于肝臟炎癥反應(yīng)，是肝纖維形成的機(jī)制之一[9]。

表1 各組大鼠血清肝功能及血脂變化(±s)

全基因芯片深入挖掘后，3個(gè)基因調(diào)控明顯。在下調(diào)基因中，隨著肝纖維化的加重，CYP2C9逐漸下調(diào)。CYP2C9是細(xì)胞色素P450家族2亞家族的C型成員之一，與藥物代謝以及類固醇、脂肪酸的合成相關(guān)[10,11]。CYP2C9的表達(dá)水平可以反映肝臟的功能，其在慢性肝病患者中較正常人下調(diào)[12]。在肝硬化進(jìn)展之前，CYPS活性被選擇性地改變，肝臟疾病會(huì)不同程度地影響CYP亞型的活性[13]。CYP2C9蛋白在肝硬化、肝癌患者中表達(dá)均降低，CYP2C9高表達(dá)的肝癌患者生存率較高[14]。CYP2C9的下調(diào)提示肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，肝功能的受損程度加重。研究提示在DMN誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型中，花生四烯酸代謝紊亂可能促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[5]。

在上調(diào)基因中，共享差異基因FABP5在2周、4周模型組中明顯上調(diào)大于5倍。FABP5是細(xì)胞內(nèi)脂肪酸結(jié)合蛋白家族之一，與硬脂酸和亞油酸可以高度親和，參與FAA的攝取、結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝 ，參與炎癥反應(yīng)和能量代謝[15]。同時(shí)與腫瘤的發(fā)生相關(guān)，在HCC、肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌等顯著上調(diào)[16,17]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP5在LPS誘導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用[18]。FABP5在巨噬細(xì)胞中高表達(dá)，F(xiàn)ABP5的沉默對(duì)LPS誘導(dǎo)的肝損傷具有保護(hù)作用，并有利于抗炎反應(yīng)，F(xiàn)ABP5-PPARγ信號(hào)通路可能促進(jìn)HSC激活[19]。肝纖維的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，脂肪酸代謝紊亂發(fā)生在炎癥之前，并可能加重炎癥的發(fā)展。FAPB5在肝纖維發(fā)生的前期主要參與脂肪代謝紊亂，后期主要參與炎癥反應(yīng)。

在上調(diào)基因中，共享差異基因UGT2B28在2周、4周上調(diào)均大于5倍。UGT2B28是UGT2B亞家族一員，負(fù)責(zé)膽汁酸和性激素的代謝[20]。UGT2B28基因變異與肝癌的發(fā)病年齡、復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和死亡有關(guān)[21]。本研究發(fā)現(xiàn)UGT2B28在肝纖維化形成和發(fā)展的過(guò)程中上調(diào)，提示UGT2B28可能是肝纖維化加劇的預(yù)測(cè)因子之一。

綜上，肝纖維發(fā)生的早期存在明顯的脂肪代謝紊亂，以基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)整的脂肪酸紊亂，可能是逆轉(zhuǎn)肝纖維化向肝硬化轉(zhuǎn)化的策略，可以為進(jìn)一步評(píng)估肝纖維化的療效奠定基礎(chǔ)。