陳 飛,羅惠民,謝 瑜,呂 琴,沈 穎

(云南省第一人民醫(yī)院，昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科,云南 昆明 650032)

腎間質(zhì)纖維化(RIF,renal interstitial fibrosis)不僅是慢性腎臟疾病發(fā)展進(jìn)程中的重要因素之一,也是其終末期的最終結(jié)果。臨床研究調(diào)查表明,目前全球有10%～15%的人口患有慢性腎臟疾病[1]。腎間質(zhì)纖維化的主要病理學(xué)特征為細(xì)胞外基質(zhì)成分沉積、腎小管細(xì)胞丟失以及成纖維細(xì)胞積累和腎小管周圍微血管減少[2]。雖然目前治療腎間質(zhì)纖維化的手段較多(如免疫抑制劑等),但由于腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機制較為復(fù)雜,目前仍然沒有特異性治療方法,因此尋找一種有效且副作用較小的治療手段具有重要意義[3]。姜黃素是一種二酮類化合物,其由姜科植物中分離得到且具有抗纖維化、抗增殖等活性,研究表明姜黃素可通過抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化抗炎作用治療腎間質(zhì)纖維化[4-5]。microRNA(miRNA)是由20～24個核苷酸組成的小RNA,主要調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等[6]。近年來研究表明miRNA也參與腎間質(zhì)纖維化的病程,例如miRNA-29-3p(miR-29-3p)在腎間質(zhì)纖維化的過程中發(fā)揮重要作用[7]。研究旨在探討姜黃素對腎間質(zhì)纖維化以及miR-29-3p的影響,并進(jìn)一步探究姜黃素在抗腎纖維化作用中的分子機制。

1 實驗方法

1.1 藥物制備

姜黃素(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)溶解于二甲基亞砜(DMSO,dimethyl sulfoxide)(終濃度為50 mmol/L)儲存?zhèn)溆茫⒃O(shè)置DMSO對照組,且實驗過程中DMSO的體積分?jǐn)?shù)不超過0.1%。

1.2 MTT法

將人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)接種于96孔板培養(yǎng)24 h(1×105個/孔,37 ℃,體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2),結(jié)束培養(yǎng)后在細(xì)胞培養(yǎng)孔中分別加入濃度為0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L的姜黃素以及DMSO,并在加入姜黃素或DMSO的同時加入轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)(質(zhì)量濃度為10 ng/mL),孵育48 h后每孔加入MTT溶液(100 μL),培養(yǎng)4 h后加入DMSO溶液(150 μL),在570 nm波長下檢測其吸光度值。

1.3 Elisa法

HK-2細(xì)胞的分組情況同1.2,選擇最佳姜黃素濃度作為姜黃素組細(xì)胞的給藥濃度,在加入TGF-β1的同時加入姜黃素,并培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)液并根據(jù)試劑商(上海酶聯(lián)生物科技公司)說明書檢測細(xì)胞上清液中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的濃度。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將HK-2細(xì)胞接種于6孔板中培養(yǎng)24 h后,分別將miR-29-3p mimic (50 nmol/L)和miR-NC mimic(50 nmol/L)(廣州市銳博生物科技有限公司)加入轉(zhuǎn)染組和陰性對照組中,在培養(yǎng)箱(37 ℃,體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2)中孵育8 h后,加入TGF-β1(質(zhì)量濃度為10 ng/mL)培養(yǎng)24 h(除空白對照組外)。

1.5 Western blot法檢測

收集各組細(xì)胞,用放射線免疫沉淀裂解緩沖液(RIPA,radio immunoprecipitation lysis buffer)從HK-2細(xì)胞中提取蛋白。蛋白質(zhì)(20 μg)經(jīng)過10% SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)PVDF膜,在脫脂牛奶(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%)中封閉2 h后,與α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)(V抗體∶V脫脂牛奶=1∶500)、Ⅰ型膠原(COL Ⅰ)(V抗體∶V脫脂牛奶=1∶500)、IκBα(V抗體∶V脫脂牛奶=1∶500)、p-IκBα(V抗體∶V脫脂牛奶=1∶500)、Ⅲ型膠原(COL Ⅲ)(V抗體∶V脫脂牛奶=1∶500)、p-P65(V抗體∶V脫脂牛奶=1∶1 000)、Toll樣受體(TLR4)(V抗體∶V脫脂牛奶=1∶500)、NF-κB P65(V抗體∶V脫脂牛奶=1∶1 000)一抗孵育過夜,然后PBS清洗3次后與HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(V抗體∶V脫脂牛奶=1∶5 000)在4 ℃下孵育2 h,加入化學(xué)發(fā)光液顯影,其灰度值用Image J軟件進(jìn)行量化處理。

1.6 RT-PCR法

HK-2細(xì)胞中的總RNA分離使用TRIzol法,光密度值(D260/D280)使用Nanodrop紫外分管光度計進(jìn)行測定,然后根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成和PCR的擴增。反應(yīng)條件為95 ℃,10 min;95 ℃,15 s;60 ℃,60 s,45個循環(huán)后結(jié)束。GAPDH作為miR-29-3p的內(nèi)參基因,利用2-ΔΔCt法估算樣品miR-29-3p、Ⅰ型膠原蛋白α1鏈(COL1A1)、Ⅲ型膠原蛋白α1鏈(COL3A1)的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 姜黃素抑制腎間質(zhì)纖維化細(xì)胞模型的過度增殖

為探究姜黃素對TGF-β1誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化細(xì)胞模型活力的影響,對其增值能力和凋亡率進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖1所示。由圖1(a)可知,模型組細(xì)胞經(jīng)TGF-β1處理后活力約為150.2%,空白對照組細(xì)胞活力約為98.9%,模型組細(xì)胞活力顯著增加(P<0.05);當(dāng)姜黃素濃度達(dá)到10～25 μmol/L時,細(xì)胞增殖活力分別降低至132.1%、120.3%、109.9%、104.8%,與模型組相比顯著下降(姜黃素濃度10 μmol/L:P<0.05,姜黃素濃度15～25 μmol/L:P<0.01);由圖1(b)和(c)可知,空白對照組細(xì)胞凋亡率約為19.9%,而模型組細(xì)胞僅為5.7%左右;與模型組相比,當(dāng)姜黃素濃度達(dá)到10～25 μmol/L時,細(xì)胞凋亡率顯著降低至19.3%、30.3%、43.2%、51.1%,因此選擇姜黃素濃度為10 μmol/L用于后續(xù)實驗。以上結(jié)果表明姜黃素對TGF-β1引起的細(xì)胞過度增殖有顯著的抑制作用。

注:##表示與空白對照組相比,P<0.01;*表示與模型組相比,P<0.05;**表示與模型組相比,P<0.01。

2.2 姜黃素抑制纖維化因子的表達(dá)

姜黃素對α-SMA、COL Ⅰ、COL Ⅲ表達(dá)的影響如圖2所示。由圖2可知,與空白對照組相比,模型組的HK-2細(xì)胞中α-SMA、COL Ⅰ、COL Ⅲ的相對表達(dá)量均顯著增加(α-SMA與COL Ⅰ:P<0.01,COL Ⅲ:P<0.05);經(jīng)姜黃素處理后,HK-2細(xì)胞的上述蛋白相對表達(dá)量顯著低于模型組(α-SMA與COL Ⅲ:P<0.05,COL Ⅰ:P<0.01)。結(jié)果表明姜黃素可顯著降低HK-2細(xì)胞中的纖維化因子α-SMA、COL Ⅰ、COL Ⅲ的表達(dá)量。

注:#表示與空白對照組相比,P<0.05;##表示與空白對照組相比,P<0.01;*表示與模型組相比,P<0.05;**表示與模型組相比,P<0.01。

2.3 姜黃素抑制炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生

姜黃素對炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α質(zhì)量濃度的影響如圖3所示。由圖3可知,模型組細(xì)胞經(jīng)TGF-β1處理后,細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的質(zhì)量濃度相比空白對照組顯著增加(P<0.01),但是姜黃素處理后細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量急劇增加(P<0.01)。結(jié)果提示姜黃素對TGF-β1誘導(dǎo)的腎纖維化細(xì)胞模型具有抗炎作用。

注:##表示與空白對照組相比,P<0.01;**表示與模型組相比,P<0.01。

2.4 姜黃素對TLR4/NF-κB信號通路的調(diào)控作用

為探究姜黃素是否通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用,對TLR4、p-P65/p65、p-IκBα/IκBα進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,與空白模型組相比,TGF-β1誘導(dǎo)顯著增加了模型組的HK-2細(xì)胞中TLR4、p-P65/p65、p-IκBα/IκBα蛋白的相對表達(dá)量(P<0.01);姜黃素顯著下調(diào)了由于TGF-β1刺激而表達(dá)增加的上述蛋白的相對表達(dá)量(TLR4、p-P65/p65:P<0.05;p-IκBα/IκBα:P<0.01)。上述結(jié)果表明姜黃素可能通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用。

注:#表示與空白對照組相比,P<0.05;##表示與空白對照組相比,P<0.01;*表示與模型組相比,P<0.05;**表示與模型組相比,P<0.01。

2.5 姜黃素促進(jìn)miR-29-3p的表達(dá)

姜黃素對miR-29-3p表達(dá)的影響如圖5所示。由圖5可知,與空白對照組相比,模型組細(xì)胞在TGF-β1的誘導(dǎo)下miR-29-3p表達(dá)顯著降低(P<0.01);與模型組相比,姜黃素顯著上調(diào)miR-29-3p的表達(dá)(P<0.01)。結(jié)果表明姜黃素可顯著促進(jìn)由于TGF-β1誘導(dǎo)而表達(dá)顯著降低的miR-29-3p。

注:##表示與空白對照組相比,P<0.01;**表示與模型組相比,P<0.01。

2.6 miR-29-3p對相關(guān)膠原蛋白基因及纖維化因子表達(dá)的影響

為明確miR-29-3p對腎間質(zhì)纖維化的影響,細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29-3p mimic后檢測COL3A1、COL1A1的mRNA和α-SMA、COL Ⅲ、COL Ⅰ蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果如圖6所示。由圖6可知,與空白對照組相比,模型組的COL1A1和COL3A1的mRNA以及α-SMA、COL Ⅲ、COL Ⅰ的表達(dá)顯著增高(P<0.01);與模型組相比,細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29-3p mimic后COL1A1和COL3A1的mRNA以及α-SMA、COL Ⅰ、COL Ⅲ的表達(dá)顯著降低(P<0.01)。上述結(jié)果說明miR-29-3p可顯著抑制其下游靶點COL1A1、COL3A1以及纖維化因子α-SMA、COL Ⅰ、COL Ⅲ的表達(dá)。

注:#表示與空白對照組相比,P<0.05;##表示與空白對照組相比,P<0.01;*表示與模型組相比,P<0.05;**表示與模型組相比,P<0.01。

2.7 miR-29-3p抑制炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生

細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29-3p mimic后,檢測HK-2細(xì)胞上清液中的炎癥因子,結(jié)果如圖7所示。由圖7可知,模型組HK-2細(xì)胞上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α的質(zhì)量濃度由于TGF-β1的刺激,比空白對照組顯著增加(P<0.01),但是miR-29-3p mimic轉(zhuǎn)染后,顯著降低由于TGF-β1引起的IL-1β、IL-6和TNF-α的急劇增加(P<0.01)。結(jié)果提示miR-29-3p mimic對TGF-β1誘導(dǎo)的腎纖維化細(xì)胞模型具有抗炎作用。

注:##表示與空白對照組相比,P<0.01;**表示與模型組相比,P<0.01。

2.8 miR-29-3p對TLR4/NF-κB信號通路的調(diào)控作用

通過檢測TLR4、p-IκBα/IκBα、p-P65/p65蛋白的表達(dá)情況,進(jìn)一步探究miR-29-3p對TLR4/NF-κB信號通路的調(diào)控作用,結(jié)果如圖8所示。由圖8可知,在TGF-β1誘導(dǎo)的作用下模型組的HK-2細(xì)胞中p-IκBα/IκBα、TLR4、p-P65/p65蛋白的相對表達(dá)量相比空白對照組顯著增加(P<0.01);與模型組相比,轉(zhuǎn)染miR-29-3p mimic后顯著下調(diào)了上述蛋白的相對表達(dá)量(P<0.01)。結(jié)果表明miR-29-3p可能通過調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路發(fā)揮抗炎作用。

注: ##表示與空白對照組相比,P<0.01;**表示與模型組相比,P<0.01。

3 討論

近年來，研究發(fā)現(xiàn)姜黃素在肝纖維化、腎纖維化等器官纖維化疾病中具有較大的治療潛能[8-9]。本次實驗中亦表明姜黃素可顯著抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維細(xì)胞活力和COL Ⅰ、COL Ⅲ及α-SMA的生成。(肌)成纖維細(xì)胞的增殖和活化以及細(xì)胞外基質(zhì)的過量產(chǎn)生是許多器官中纖維化的常見機制,成纖維細(xì)胞也是主要產(chǎn)生COL Ⅰ和COL Ⅲ等間質(zhì)基質(zhì)成分的細(xì)胞之一[10-11]。另外,在腎間質(zhì)纖維化的過程中TGF-β1可誘導(dǎo)腎臟固有細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化,使得肌成纖維細(xì)胞受損激活并且α-SMA陽性表達(dá)升高,這標(biāo)志著腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)一步發(fā)展[12-13]。Li等[1]的實驗結(jié)果也證明通過降低細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生(COL Ⅰ)和α-SMA的產(chǎn)生可抑制腎纖維化的發(fā)生。因此依據(jù)實驗推測,姜黃素可通過抑制COL Ⅰ和COL Ⅲ等膠原蛋白和α-SMA的生成,在TGF-β1誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維的過程中發(fā)揮抗纖維化作用。

腎臟的纖維化病灶通常在腎血管周圍的組織中被激發(fā)和定位,而炎癥微環(huán)境中促細(xì)胞纖維化因子的增加會導(dǎo)致產(chǎn)生基質(zhì)的細(xì)胞生成,因此炎癥與腎纖維化的程度有密切的關(guān)系[10]。研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β和TLR4、NF-κB蛋白在TGF-β1誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維細(xì)胞中顯著升高,而姜黃素處理后可抑制其生成。已有文獻(xiàn)報道了TNF-α、IL-6和IL-1β等炎癥因子的濃度增加會產(chǎn)生炎癥細(xì)胞的浸潤從而促進(jìn)腎纖維化的進(jìn)一步發(fā)展,因此抑制炎癥的發(fā)展是解決纖維化疾病的關(guān)鍵因素之一[14]。TLR4是腎臟炎癥的重要介質(zhì)之一,并且作為炎癥相關(guān)通路的啟動子可激活NF-κB,進(jìn)而促成纖維細(xì)胞激活和腎纖維化[15]。許多體內(nèi)外實驗也證明了通過抑制NF-κB的活化可顯著改善腎臟炎癥以及腎纖維化[16-17]，如Han等[18]證明了通過調(diào)控TLR4和NF-κB可改善腎間質(zhì)纖維化程度。因此結(jié)合本次實驗結(jié)果,推測認(rèn)為姜黃素發(fā)揮了抗炎及抗纖維化作用,可能與調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路有關(guān)。

miR-29-3p是腎特異性表達(dá)的miRNAs之一,近年來在腎纖維化形成中的作用受到了廣泛的關(guān)注[19-20]。實驗中觀察到:miR-29-3p mimic轉(zhuǎn)染后COL Ⅰ、COL Ⅲ、α-SMA的生成被明顯抑制,炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β顯著降低,并且TLR4、p-IκBα/IκBα、p-P65/p65蛋白也明顯下調(diào)。miR-29-3p在腎臟器官中一般處于高表達(dá)狀態(tài),但是在腎纖維化的動物模型或者人類樣本中表達(dá)均減少,表明其具有良好的抗纖維化作用[21]。COL1A1、COL3A1是細(xì)胞外間質(zhì)中重要的膠原蛋白的鏈蛋白編碼基因,可與miR-29-3p結(jié)合從而抑制膠原蛋白的表達(dá)以達(dá)到抗纖維化的作用[22-23]。還有研究表明上調(diào)miR-29-3p的表達(dá)可進(jìn)一步抑制COL Ⅰ等細(xì)胞外間質(zhì)以及α-SMA的產(chǎn)生,從而逆轉(zhuǎn)腎纖維化病情的發(fā)展[24]。此外,更值得注意的是,本次實驗也發(fā)現(xiàn)姜黃素可顯著促進(jìn)miR-29-3p的表達(dá),由此證實了姜黃素可通過上調(diào)miR-29-3p的表達(dá)以及調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路抑制膠原蛋白、纖維化因子以及炎癥因子的生成,延緩抗腎間質(zhì)纖維化的病程發(fā)展。

綜上所述,研究采用TGF-β1誘導(dǎo)的體外腎間質(zhì)纖維化細(xì)胞模型，證明了姜黃素可通過抑制纖維化因子COL Ⅰ、COL Ⅲ、α-SMA的表達(dá)和炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的產(chǎn)生，發(fā)揮了抗炎及抗纖維化作用,其分子機制可能與促進(jìn)miR-29-3p的表達(dá)及調(diào)控TLR4/NF-κB信號通路有關(guān)。研究挖掘了姜黃素在腎間質(zhì)纖維化的治療中具有的應(yīng)用潛能,并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了姜黃素對miR-29-3p以及TLR4/NF-κB信號通路的調(diào)控作用,這對姜黃素在臨床上治療腎間質(zhì)纖維化提供了一定的理論基礎(chǔ)。但本次研究只在體外實驗證明了姜黃素的抗纖維化作用,后續(xù)研究應(yīng)建立體內(nèi)抗纖維化動物模型，以便更好地闡明姜黃素對腎間質(zhì)纖維化的治療作用以及相關(guān)分子作用機制。