孫 琦 王麗霞 呂繼連

牙周炎是因牙周組織受到慢性破壞所致的口腔疾病[1]，可損傷牙骨質(zhì)、牙周膜、牙槽骨及周圍支持組織，引起牙槽骨喪失，導致牙齒脫落，為后續(xù)牙齒修復帶來了很大困難[2]。骨損傷傳統(tǒng)修復方法是同種異體和自體移植，但由于免疫反應和供區(qū)并發(fā)癥，修復效果尚不理想[3]。因此，尋找有效的骨損傷修復方案，對臨床治療牙周炎具有重要意義。

骨髓間充質(zhì)干細胞(bone mesenchymal stem cells，RMSCs)常用做組織工程學工具細胞，已有研究證實其在軟骨損傷治療中的效果[4-5]。然而，目前關于RMSCs 對大鼠牙槽骨缺損部分的再生修復及對破骨細胞的影響研究尚少。本研究通過建立大鼠牙槽骨缺損模型，研究RMSCs 移植對其缺損部分的再生修復的影響，并探討相關機制，為臨床RMSCs 的應用提供實驗依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物、細胞株 25 只SPF 級SD大鼠，雄性，6 周齡，體質(zhì)量(200-250)g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司[生產(chǎn)許可SCXK(滬)2018-0004]。大鼠RMSCs 細胞株，購自上海撫生實業(yè)有限公司。

1.1.2 主要試劑、儀器 兔抗大鼠CD29、CD3、CD44、CD45 單克隆抗體，α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco 公司)，HE 染色試劑盒(上海威奧生物科技有限公司)，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，RCA)試劑盒(上海澤葉生物科技有限公司)，兔抗大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶(Yartrate-resistant acid phosphatase，YRAP)一抗(美國Abcam 公司)、山羊抗兔IgG 二抗(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)。

Navios 流式細胞儀(美國Reckman Coulter 公司)，Micro-CY(德國siemems 公司)，熒光倒置顯微鏡(日本Nikon 公司)，YY-80R 電泳儀(南京普陽科學儀器研究所)，WD-9413D 型一體式凝膠成像系統(tǒng)(北京六一生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 RMSCs 鑒定 取P3 代RMSCs，0.25%胰蛋白酶消化、離心，棄去上層液體，PRS 漂洗后重懸細胞，制成單細胞懸液(5×105個/ mL)。取無菌EP 管，加入單細胞懸液100μL，再加入CD29、CD34、CD45、CD44 對應抗體(各2μL)，根據(jù)相關儀器及試劑盒要求安排實驗步驟，4℃孵育20min，用流式細胞儀分析CD29、CD34、CD45、CD44表達情況。

1.2.2 制備并鑒定RMSCs 膜片 取P3 代RMSCs，0.25%胰蛋白酶消化5 min，1200r/ min離心8min，置于含10%胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基內(nèi)重懸細胞，調(diào)整細胞密度為5×105個/ mL，重新接種至6 孔板，培養(yǎng)24h 后，更換為膜誘導液培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，50mg/ L 抗壞血酸的α-MEM 培養(yǎng)基)。每隔2 天換液1 次，連續(xù)培養(yǎng)14 天，在培養(yǎng)皿底部形成一層透明狀、未分化的RMSCs 膜片。經(jīng)倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

1.2.3 建立牙槽骨缺損模型 建立大鼠牙槽骨缺損模型，全部大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉進行麻醉，棉線提拉切牙暴露大鼠上頜牙列，手術刀切開第一磨牙牙齦，翻開黏骨膜，暴露牙槽骨骨面，口腔手機磨出約4mm×3mm×3mm 大小的孔洞，棉球止血。建模成功21 只，失敗4 只，將建模成功的21 只大鼠按隨機數(shù)字表法隨機分為模型組(10只)、RMSCs 組(11 只)。

1.2.4 干預方式 確認建模成功后，RMSCs組牙槽骨缺損處植入RMSCs 膜片。麻醉大鼠后，行牙周翻瓣手術，將RMSCs 膜片折疊為小團塊，植入后縫合黏骨膜，防止膜片脫落。模型組不植入膜片直接縫合。

1.2.5 Micro-CY 活體掃描 干預后第3、6 周對大鼠缺損處進行Mirco-CY 活體掃描。掃描前以2%戊巴比妥鈉50mg/ kg 腹腔注射麻醉，心電監(jiān)護下行活體掃描，掃描精度30μm，建立感興趣區(qū)。采用Inveon Research Wofkplace 軟件定量分析獲取的三維圖像信息，計算樣本骨體積分數(shù)(bone volume/ total volume，RV/ YV)、骨 密 度(bone mineral density，RMD)、骨小梁分離度(trabecular separation/ spacing，Yb.sp)。

1.2.6 組織取材 干預后第3、6 周活體掃描后注射過量麻藥，脫頸處死大鼠(兩個時間點各5只)，以牙槽骨缺損處為中心，上下各取5mm×5mm 的骨組織標本，分成兩份，一份置于4%多聚甲醛固定24h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，切片機切取4mm 切片；一份置于液氮中保存用于蛋白檢測。

1.2.7 HE 染色觀察骨和血管新生情況 取牙槽骨組織切片二甲苯脫蠟，無水乙醇水洗，自來水沖洗30s，加入蘇木精液染色5min，自來水漂洗，鹽酸酒精分化，自來水沖洗反藍，伊紅液染色2min，各級乙醇梯度脫水、透明，中性樹膠封片，置于光鏡下拍照。采用Image ProPlus Software 6.0 IPP 軟件測定新生骨面積和血管面積，視野內(nèi)隨機選取10 個不相鄰視野，求出每個視野平均值。

1.2.8 Western blot 法檢測牙槽骨組織中破骨細胞分化標志物YRAP 蛋白表達 取液氮保存的100mg 牙槽骨組織標本，加入RIPA 裂解液，研磨后勻漿，移至離心管，置于冰上，8000rpm 離心25min，取上清液，采用RCA 法測定蛋白含量。取80μg 蛋白樣本按比例與上樣緩沖液混合，100℃金屬浴5min，離心取上清液，電壓80V 電泳，電壓110V 濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，搖床清洗，封閉液封閉2h，加入兔抗大鼠YRAP 一抗(1∶1000)4℃搖床孵育過夜，YRSY 洗滌，加入山羊抗兔IgG 二抗(1∶2 000)，室溫搖床孵育2h，YRSY 洗滌后加入發(fā)光液，置于暗室內(nèi)顯影，使用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析灰度值，以目的條帶/ 內(nèi)參β-actin 條帶灰度值表示目的蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學檢驗 數(shù)據(jù)資料的分析、處理采用統(tǒng)計學軟件SPSS 22.0，以均數(shù)±標準差()表示計量資料，以單因素方差分析比較多樣本資料，兩兩樣本資料比較采用LSD-t 檢驗。P＜0.05 差異有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 RMSCs 形態(tài)觀察 經(jīng)倒置顯微鏡觀察，P2 代RMSCs 呈短梭形、多角形、星形，分散貼壁生長。P3 代RMSCs 細胞形態(tài)一致，胞漿豐富，排列緊密，部分成團，梭形貼壁生長。見圖1。

圖1 鏡下觀察RMSCs 形態(tài)(×100，標尺100μm)

2.2 RMSCs 表面特異性標志物鑒定 經(jīng)檢測，RMSCs 表面陽性表達CD29、CD44，表達率均＞95%，陰性表達CD34、CD45，表達率均＜1.5%。見圖2。

圖2 RMSCs 表面特異性標志物鑒定

2.3 RMSCs 膜片鑒定 細胞重懸第2 天，RMSCs 大部分貼壁生長，換為膜誘導液培養(yǎng)基培養(yǎng)14d 后，經(jīng)倒置相差顯微鏡觀察，可看緊密排列的致密細胞，細胞形態(tài)一致，胞漿豐富，規(guī)則排列。見圖3。

圖3 鏡下觀察細胞膜片

2.4 各組活體Micro-CY 結果比較 與模型組比較，RMSCs 組干預后第3、6 周RV/ YV、RMD增加，Yb.sp 減少(P＜0.05)；與干預后第3 周比較，模型組、RMSCs 組干預后第6 周RV/ YV、RMD 增加，Yb.sp 減少(P＜0.05)。見表1。

表1 干預后第3、6 周各組RV/ YV值、RMD含量、Yb.sp 寬度比較()

表1 干預后第3、6 周各組RV/ YV值、RMD含量、Yb.sp 寬度比較()

注：與第3 周比較，aP＜0.05。

圖4 干預后第3、6 周各組活體Micro-CY 結果

2.5 HE 染色 HE 染色結果顯示，RMSCs 組存在大量成熟成骨細胞及明顯新生血管，骨組織完整性較好，模型組只有少量血管和成骨細胞形成。隨著時間的延長，RMSCs 組、模型組成骨細胞及新生血管均有所增加。見圖5。

2.6 新生骨與血管面積 與模型組比較，RMSCs組干預后第3、6 周新生骨面積、新生血管面積占比增加(P＜0.05)；與干預后第3 周比較，模型組、RMSCs 組干預后第6 周新生骨面積、新生血管面積占比增加(P＜0.05)。見表2。

表2 各組新生骨面積、新生血管面積比較()

表2 各組新生骨面積、新生血管面積比較()

注：與第3 周比較，aP＜0.05。

2.7 牙槽骨組織中破骨細胞分化標志物YRAP蛋白表達 與模型組比較，RMSCs 組第3、6 周YRAP 蛋白表達降低(P＜0.05)；與第3 周比較，模型組、RMSCs 組第6 周YRAP 蛋白表達降低(P＜0.05)。見表3、圖7。

圖6 干預后第3、6 周各組新生骨面積、新生血管面積

表3 干預后3、6 周各組YRAP 蛋白表達比較()

表3 干預后3、6 周各組YRAP 蛋白表達比較()

注：與第3 周比較，aP＜0.05。

圖7 干預后第3、6 周各組牙槽骨組織中YRAP 蛋白表達

3.討論

牙周炎是由菌斑生物膜引起的感染性疾病，國內(nèi)發(fā)病率高達70%，且35 歲后逐年上升[6]。吸煙、不正確的刷牙方式、缺乏口腔保健知識、口腔檢查次數(shù)少是其主要危險因素[7]。牙周炎的治療目標在于恢復被破壞牙周組織的正常結構及功能，促進組織修復再生，誘導牙周新附著[8]。由于牙周炎早期無明顯癥狀，出現(xiàn)癥狀時已經(jīng)進入中晚期，直接導致患者牙齒喪失。現(xiàn)階段基礎治療僅能抑制牙周支持組織破壞的發(fā)展，無法對牙槽骨缺損、牙根暴露等問題進行修復。隨著組織工程技術的進步，利用細胞膜片技術，植入RMSCs 膜片促進牙周組織再生成為牙周炎治療研究的熱點[9]。

牙周膜干細胞在牙周組織修復再生過程中起到關鍵作用，其血管旁定位暗示骨髓可能是牙周膜干細胞的重要來源[10]。RMSCs 是具有多向分化潛能的多功能干細胞，在不同的誘導條件下可分化為脂肪細胞、神經(jīng)細胞、軟骨細胞及骨細胞，因其來源于骨髓，取材方便，易于分離培養(yǎng)，更適合骨組織工程[11]。RMSCs 又可分泌血管內(nèi)皮生長因子及多種活性大分子，可加速骨損時微環(huán)境的修復構建[12]。Lu 等[13]研究認為，局部注射RMSCs 溶液可抑制牙周炎組織炎癥反應，促進牙周組織再生，從而對牙周炎產(chǎn)生治療效果。此外，有研究發(fā)現(xiàn)[14]，RMSCs 特異性適體功能化的外泌體在靶向骨骼以及骨骼再生方面具有優(yōu)勢，為促進骨新生提供了一種新穎的、有前途的方法。本研究結果顯示，與模型組比較，RMSCs 組第3、6 周RV/ YV、RMD、新生骨面積、新生血管面積占比增加，Yb.sp 減少，提示RMSCs 可增加新生骨量、促進血管新生，加快骨質(zhì)修復再生。

牙槽骨缺損部分的再生修復是缺損處組織反復進行吸收與形成的過程，其中破骨細胞主導骨吸收，成骨細胞主導骨形成，二者相互抑制形成動態(tài)平衡。破骨細胞來源于造血干細胞，具有高度分化性，由外周血單核細胞及破骨前體細胞融合而成，是機體中唯一參與骨吸收的細胞，其數(shù)量與功能異常將導致過度骨吸收，由于牙槽骨缺損炎癥反應的存在，成骨-破骨平衡狀態(tài)被打破，破骨細胞優(yōu)勢明顯，成骨功能降低，牙槽骨缺損修復進程減緩[15]。YRAP 是一種酸性磷酸酶，存在于破骨細胞微粒體中，作為破骨細胞的標志酶，其在骨基質(zhì)磷灰石底物降解過程中發(fā)揮重要作用，其活性高低與破骨細胞的骨吸收能力大小正相關[16]。有動物實驗表明[17-18]，促進破骨細胞分化可加速牙周炎小鼠牙槽骨吸收。因此，抑制破骨細胞分化是促進牙槽骨缺損修復的有效方式。本研究結果顯示，與模型組比較，RMSCs 組第3、6 周YRAP 蛋白表達降低，提示RMSCs 對大鼠牙槽骨缺損部分再生修復的促進作用，可能與下調(diào)YRAP 蛋白表達、抑制破骨細胞活性有關。

綜上所述，RMSCs 可促進大鼠牙槽骨缺損部分的再生修復，推測其作用機制與下調(diào)YRAP 蛋白表達從而抑制破骨細胞活性有關，為其應用于臨床提供實驗依據(jù)。關于RMSCs 治療牙槽骨缺損是否存在其他作用機制仍需繼續(xù)探討。