劉原園 李璐 吳托雅 魯潔

2020年全球約有結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染者990萬(wàn)例，我國(guó)結(jié)核病患者數(shù)占全球總數(shù)的8.5%，位居世界第二[1]。結(jié)核病治愈率較低，死亡率較高，對(duì)公眾健康構(gòu)成巨大威脅[2-3]。MTB是一種胞內(nèi)病原菌，在代謝和復(fù)制活躍的階段侵入宿主巨噬細(xì)胞后可進(jìn)入長(zhǎng)期休眠，以此來(lái)逃避宿主的免疫防御。一旦宿主的免疫壓力減弱，MTB即乘機(jī)復(fù)蘇，恢復(fù)到代謝和復(fù)制活躍的階段[4]。MTB中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞入侵(mammalian cell entry，Mce)蛋白家族由mce操縱子所編碼，在侵襲宿主巨噬細(xì)胞和促進(jìn)MTB存活過(guò)程中的作用逐漸被重視。其中Mce4系統(tǒng)具有調(diào)控宿主免疫和轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的作用[5-6]，筆者就mce4操縱子及其編碼蛋白功能的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、mce4操縱子組成及功能

1.mce操縱子組成：對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組的完整序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其有4個(gè)mce操縱子，分別為mce1～mce4(圖1)[7]。每個(gè)操縱子主要由2個(gè)yrbE基因、6個(gè)mce基因組成[8]。此外，還包括mce1操縱子下游的4個(gè)基因(mas1A～1D)及mce3、mce4操縱子下游的2個(gè)基因(分別為mas3A和mas3B、mas4A和mas4B)。

圖1 結(jié)核分枝桿菌H37Rv mce(1～4)操縱子示意圖

2.mce4操縱子及編碼蛋白：mce4操縱子具有8個(gè)基因[8]，其中yrbE4A(Rv3501c)和yrbE4B(Rv3500c)既是mce4操縱子的一部分，也是YrbE家族的成員，編碼YrbE4A和YrbE4B蛋白，注釋為“假想保守整合膜蛋白”，預(yù)測(cè)可能是ATP結(jié)合盒(ATP-binding cassette, ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)體，與脂代謝相關(guān)[9-10]。而mce4A～4F(Rv3499c～Rv3494c)分別編碼Mce4A～4F 蛋白，都被預(yù)測(cè)與入侵宿主細(xì)胞或脂代謝相關(guān)[9-10]。操縱子多態(tài)性程度分析中發(fā)現(xiàn)，mce4操縱子的多態(tài)性明顯高于mce1操縱子，yrbE4A和Rv3495c在mce4操縱子中多態(tài)性最高[11]。

3.mce4操縱子的表達(dá)調(diào)節(jié)：細(xì)胞內(nèi)環(huán)境使結(jié)核分枝桿菌暴露于多種應(yīng)激因素，包括缺氧、營(yíng)養(yǎng)限制、氧化和酸性條件[12-13]。為了適應(yīng)不利條件并持久存活，結(jié)核分枝桿菌對(duì)其基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)整，以便在惡劣的環(huán)境中生存[14]。研究發(fā)現(xiàn)，在存在表面應(yīng)激和細(xì)胞內(nèi)氧氣缺乏的情況下，恥垢分枝桿菌mce4操縱子啟動(dòng)子活性被上調(diào)了1.5倍[15]。Rathor等[14-15]研究也證實(shí)，在表面應(yīng)力、缺氧以及在膽固醇的存在時(shí)，結(jié)核分枝桿菌mce4操縱子的啟動(dòng)子被誘導(dǎo)，且其所有基因都比在有氧培養(yǎng)條件下表達(dá)升高。此外，mce4操縱子啟動(dòng)子區(qū)域顯示出對(duì)肽基脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶A(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A，PPIase A)的親和力[15]，而PPIase A是結(jié)核分枝桿菌在膽固醇作為唯一碳源的情況下生存所必需的[16]。以上研究證明了缺氧和膽固醇是影響結(jié)核分枝桿菌mce4操縱子表達(dá)的重要因素。

4.Mce4系統(tǒng)在膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用：Mce4系統(tǒng)被認(rèn)為是重要的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。Casali和Riley[7]認(rèn)為放線菌是mce位點(diǎn)編碼的一種新型的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。隨后Mohn等[17]在約氏紅球菌(rhodococcusjostii，RHA1)轉(zhuǎn)錄分析中發(fā)現(xiàn)，在膽固醇和丙酮酸的作用下，mce4操縱子的表達(dá)上調(diào)了4.0倍；且生物信息學(xué)分析表明，測(cè)序基因組中的所有mce4位點(diǎn)均與類固醇代謝基因連鎖，而膽固醇是類固醇的一種。Van der Geize等[18]發(fā)現(xiàn)，mce4和yrbE突變體在有膽固醇培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力都嚴(yán)重受損，證明了Mce4和yrbEA及yrbEB參與了約氏紅球菌中膽固醇的攝取，也表明了約氏紅球菌的mce4基因座可編碼類固醇攝取系統(tǒng)。Pandey和Sassetti[5]也證明，mce4可編碼一個(gè)膽固醇輸入系統(tǒng)，使結(jié)核分枝桿菌能夠攝取和利用宿主膜的膽固醇以獲得碳和能量。2012年，Klepp等[19]發(fā)現(xiàn)了mce4操縱子的缺失也會(huì)損害恥垢分枝桿菌的膽固醇攝取，這一發(fā)現(xiàn)更加明確了Mce4蛋白也參與了恥垢分枝桿菌對(duì)膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)。2017年，García-Fernández等[20]研究發(fā)現(xiàn)了攜帶mce4操縱子上任一基因突變體的恥垢分枝桿菌在含膽固醇的培養(yǎng)基中無(wú)生長(zhǎng)，且缺失的mce4基因均不能被恥垢分枝桿菌其他mce操縱子中的同源基因所取代，推測(cè)Mce4系統(tǒng)可能是恥垢分枝桿菌中唯一的膽固醇主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。2020年，有研究通過(guò)依折麥布(ezetimibe)藥物來(lái)降低斑馬魚體內(nèi)游離膽固醇和中性脂，繼而有效抑制了海洋分枝桿菌的生長(zhǎng)，而這一過(guò)程依賴于mce4操縱子[21]，可見該操縱子是脂類利用的關(guān)鍵決定因素。同年Alonso等[22]發(fā)現(xiàn)鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種中mce4操縱子的缺失誘導(dǎo)了甘油三酯的積累，也導(dǎo)致了菌落形態(tài)的改變，提示mce4操縱子可能與脂質(zhì)利用以及細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)相關(guān)。

二、Mce4蛋白功能研究進(jìn)展

Mce4蛋白家族有8個(gè)蛋白，分別是YrbE4A、YrbE4B、Mce4A～4F，都具有Mce家族特征性的Mce結(jié)構(gòu)域。此外，Mce4A和Mce4D還具有膽固醇攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域[23]，提示與膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)功能相關(guān)。已有的相關(guān)研究報(bào)道多集中在Mce4A、Mce4C～4F這5個(gè)蛋白，現(xiàn)對(duì)其功能的最新研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

(一) Mce4A蛋白

MTB H37Rv菌株Mce4A蛋白由400個(gè)氨基酸組成[24]。蛋白穩(wěn)定性研究證明十二烷基硫酸鈉與Mce4A有較強(qiáng)的結(jié)合力，具有穩(wěn)定Mce4A的作用[25]。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)表明，Mce4A蛋白不僅是膜蛋白，而且含有18個(gè)B細(xì)胞抗原表位和23個(gè)T細(xì)胞抗原表位[26]，屬于免疫優(yōu)勢(shì)抗原，推測(cè)容易被免疫系統(tǒng)識(shí)別而產(chǎn)生相應(yīng)的免疫應(yīng)答。相互作用蛋白預(yù)測(cè)顯示Mce4A蛋白主要與 Mce4B、Mce4E、YrbE4B、Mce4A、Mce4D 蛋白協(xié)同發(fā)揮作用[26]，作用機(jī)制尚不清楚。配體結(jié)合研究表明25-羥基膽固醇作為配體與Mce4A有較強(qiáng)的結(jié)合親和力，有助于設(shè)計(jì)Mce4A的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑[27]。此外， IP-MS確定恥垢分枝桿菌Mce4A免疫沉淀富集了Mce4B～4F, 且通過(guò)免疫共沉淀證實(shí)Mce4A和Mce4E存在相互作用，提示Mce4A～4F可能形成高度穩(wěn)定的復(fù)合體或作為多蛋白Mce4轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體發(fā)揮作用[28]。

1.Mce4A蛋白的侵襲力和毒力：有研究表明，結(jié)核分枝桿菌Mce4A蛋白定位于菌體細(xì)胞壁部分，在非致病性大腸桿菌中表達(dá)的Mce4A蛋白使其能夠進(jìn)入并存活于HeLa細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)[29]。這驗(yàn)證了Mce4A蛋白在細(xì)胞侵襲以及在巨噬細(xì)胞中存活的作用與Mce1A相似。Sinha等[30]發(fā)現(xiàn)Mce4A蛋白過(guò)表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌感染后，小鼠體內(nèi)的細(xì)菌載量升高近兩倍，并具有早期疾病狀況和肺部廣泛的組織破壞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變。也有研究發(fā)現(xiàn)Mce4A在H37Rv中過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致與結(jié)核分枝桿菌致病性相關(guān)的炎性脂鄰苯二酚二霉菌酸酯(phthiocerol dimycocerates，PDIM)和硫脂(sulfolipid，SL1)增加[31]。這些都提示Mce4A蛋白對(duì)結(jié)核分枝桿菌的致病能力有一定影響。

2.Mce4A蛋白對(duì)宿主免疫的調(diào)控：有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，重組牛分枝桿菌Mce4A蛋白可上調(diào)肺泡巨噬細(xì)胞腫瘤壞死因子α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的表達(dá)[32]。He等[33]研究也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果，表達(dá)感染的重組牛分枝桿菌Mce4A蛋白顯著上調(diào)了巨噬細(xì)胞IL-1β、iNOS和TNF-a的mRNA水平。這提示Mce4A蛋白可能通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子從而影響機(jī)體對(duì)病原體的免疫反應(yīng)。其中iNOS能生成高反應(yīng)性自由基一氧化氮(NO)，NO的產(chǎn)生會(huì)抑制呼吸并誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌的休眠[34]。推測(cè)Mce4A蛋白可能通過(guò)NO使結(jié)核分枝桿菌在宿主體內(nèi)持久存活。最近的研究表明，結(jié)核分枝桿菌Mce4A蛋白可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α或γ-干擾素(interferon-γ,IFN-γ)等促炎細(xì)胞因子[6]。其中TNF-α能正向調(diào)節(jié)半胱氨酸蛋白酶的激活和NO的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)DNA損傷導(dǎo)致巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡[6,35]。因此，一方面，NO的呼吸抑制誘導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌休眠，有利于結(jié)核分枝桿菌在宿主體內(nèi)的持久存活；另一方面，Mce4A蛋白以TNF-α依賴的方式誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡。這表明Mce4A蛋白誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，與結(jié)核分枝桿菌保護(hù)性免疫反應(yīng)的發(fā)展有關(guān)[35-36]。最近有研究設(shè)計(jì)了一種能針對(duì)Mce4A的反義封閉核酸間隔體(Mce4A-ASO)，能顯著降低結(jié)核分枝桿菌感染的成骨細(xì)胞的細(xì)菌載量以及IL-6的分泌，提示可作為脊柱結(jié)核治療的研發(fā)方向[37]。

3.Mce4A蛋白介導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌攝取利用膽固醇：等溫滴定熱法首次證實(shí)Mce4A蛋白與膽固醇在體外結(jié)合，為Mce4A在結(jié)核分枝桿菌發(fā)病機(jī)理中攝取利用膽固醇的可能作用提供了直接證據(jù)[38]。在膽固醇存在下，過(guò)表達(dá)Mce4A的結(jié)核分枝桿菌菌株的生長(zhǎng)速度是其他菌株的2倍，證明Mce4A能更有效地利用膽固醇[30]。電鏡觀察到過(guò)表達(dá)Mce4A的結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁增厚，其原因可能是延長(zhǎng)的游離脂質(zhì)如PDIM轉(zhuǎn)移積累到細(xì)胞壁導(dǎo)致的，而PDIM的合成途徑是由Mce4A蛋白中類似甲基接受趨化蛋白(methyla-ccepting chemotaxis protein,MCP)的特定結(jié)構(gòu)域調(diào)控[30-31]，提示Mce4A是結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁PDIM積累所需代謝途徑的調(diào)節(jié)因子。而PDIM已經(jīng)被證實(shí)是致病性分枝桿菌具有的細(xì)胞壁毒力相關(guān)脂質(zhì)[39-40]，這是Mce4A蛋白參與結(jié)核分枝桿菌致病過(guò)程的可能證據(jù)。以上證據(jù)表明，Mce4A在介導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌攝取膽固醇的同時(shí)，在增強(qiáng)胞內(nèi)存活期間的細(xì)胞壁強(qiáng)度和毒力中也具有令人信服的作用。

(二)Mce4C蛋白

結(jié)核分枝桿菌的Mce4C蛋白由357個(gè)氨基酸組成[24]，但相關(guān)研究很少。有研究預(yù)測(cè)了Mce4C蛋白MHC Ⅰ類表位—SLAGNSAKV，認(rèn)為是抗結(jié)核疫苗研發(fā)的候選表位[41]。

(三)Mce4D蛋白

結(jié)核分枝桿菌的Mce4D蛋白由451個(gè)氨基酸組成[24]。在牛分枝桿菌弱毒株和超強(qiáng)毒株的差異轉(zhuǎn)錄組圖譜分析中，證實(shí)mce4D在強(qiáng)毒株中表達(dá)上調(diào)[42]。Mce4D蛋白功能預(yù)測(cè)也是與脂質(zhì)代謝相關(guān)，但還有待研究。此外，也預(yù)測(cè)了Mce4D蛋白的MHCⅡ類表位—PNLVAARFIQLTPVY被認(rèn)為是另一個(gè)抗結(jié)核疫苗研發(fā)的候選表位[41]。

(四)Mce4E蛋白

結(jié)核分枝桿菌的Mce4E蛋白又稱為L(zhǎng)prN蛋白，由384個(gè)氨基酸組成[24]。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)Mce4E蛋白為一種脂蛋白[9-10]。脂蛋白具有高效的免疫原性，影響先天和獲得性免疫反應(yīng)[43]。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，牛分枝桿菌Mce4E蛋白能夠抑制牛肺泡巨噬細(xì)胞的活性，同時(shí)促使炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)上調(diào),抑制iNOs mRNA的表達(dá)[44]，由此可推測(cè)Mce4E蛋白通過(guò)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子從而影響機(jī)體對(duì)病原體的免疫反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)證明，在大腸桿菌中表達(dá)的重組Mce4E蛋白在小鼠體內(nèi)引發(fā)了細(xì)胞免疫應(yīng)答，表現(xiàn)為明顯提高T細(xì)胞增殖和增加TNF-a和IFN-γ細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而誘導(dǎo)小鼠Th-1型保護(hù)性免疫應(yīng)答；同時(shí)，組織病理學(xué)檢查顯示組織破壞增加[45]，表明Mce4E蛋白具有增強(qiáng)細(xì)菌毒力的免疫原性潛力。由于mce4E基因是在結(jié)核分枝桿菌感染后期表達(dá)的操縱子的一部分[15]，因此認(rèn)為Mce4E蛋白可能通過(guò)調(diào)節(jié)其免疫應(yīng)答而在動(dòng)物的疾病維持中發(fā)揮作用。還有研究提示，Mce4E蛋白可能比Mce4A更能促進(jìn)細(xì)菌在巨噬細(xì)胞中的持久性，從而導(dǎo)致其在被巨噬細(xì)胞吞噬后能夠更好地存活[33]，但更有力的證據(jù)還有待進(jìn)一步研究。此外，Mce4E蛋白也被證明是恥垢分枝桿菌吸收膽固醇所必需的[28]。

(五)Mce4F蛋白

結(jié)核分枝桿菌的Mce4F蛋白由564個(gè)氨基酸組成，被預(yù)測(cè)在細(xì)菌脂質(zhì)分解代謝中發(fā)揮著重要作用[18]。Mce4F蛋白被認(rèn)為是可能的外膜蛋白之一，它分泌在菌體外膜上，具有與分枝桿菌致病相關(guān)的重要功能[46]。免疫電鏡證實(shí)了其存在于分枝桿菌表面，并用125I 結(jié)合試驗(yàn)鑒定了Mce4F蛋白的高活性結(jié)合肽(high-activity binding peptides,HABP)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有的HABP均有抑制分枝桿菌進(jìn)入肺泡上皮細(xì)胞A549和單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞U937的作用[47]。以上結(jié)果提示，Mce4F蛋白可能在分枝桿菌的毒力和感染適應(yīng)中發(fā)揮了負(fù)性作用，其抑制侵襲宿主細(xì)胞的機(jī)制及意義有待進(jìn)一步研究。此外，Mce4F蛋白也被證明是恥垢分枝桿菌吸收膽固醇所必需的[28]。

三、展望

在MTB感染宿主過(guò)程中，越來(lái)越多的細(xì)菌蛋白被報(bào)道能夠調(diào)控宿主細(xì)胞信號(hào)或利用宿主促進(jìn)自身存活，例如MTB的Rv1579c(probable PhiRv1 phage protein,EST-12)能夠通過(guò)活化C激酶1受體誘導(dǎo)NLRP3炎癥體活化，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡[48]；MTB的Rv0859能夠靶向宿主脂肪酸代謝從而抑制炎癥，促進(jìn)細(xì)菌存活[49]。目前，研究認(rèn)為MTB的Mce4蛋白家族也主要在參與調(diào)控宿主免疫、入侵宿主細(xì)胞、介導(dǎo)膽固醇攝取中起著重要作用。尤其是攝取膽固醇并從中獲得碳和能量對(duì)于結(jié)核分枝桿菌在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期存活是必不可少的。

結(jié)核分枝桿菌維持慢性感染的能力與其從宿主獲取膽固醇的能力密切相關(guān)，但仍缺乏mce4操縱子上的mce4B和mce4C等相關(guān)的研究。同時(shí)，mce4操縱子及編碼蛋白在膽固醇攝取以及發(fā)病機(jī)制方面是否存在更復(fù)雜或多重的功能仍未可知，對(duì)Mce4蛋白功能更整體全面的理解還有待進(jìn)一步研究。目前研究認(rèn)為，mce4操縱子編碼一種類似的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的膽固醇攝取系統(tǒng)，但還不清楚為什么Mce系統(tǒng)比經(jīng)典的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白需要這么多的蛋白質(zhì)。有人認(rèn)為這是由于Mce4蛋白形成了一個(gè)復(fù)合體，在經(jīng)典ABC攝取轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中發(fā)揮底物結(jié)合蛋白的作用[20]。另外，Mce4F對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)入細(xì)胞的抑制作用也需要進(jìn)一步研究，這有望成為治療結(jié)核感染的新方向。

以往對(duì)于Mce系統(tǒng)的研究局限于單一蛋白的功能研究，而不是以復(fù)合物形式表達(dá)的整個(gè)操縱子。若是對(duì)Mce4蛋白系統(tǒng)整體的生物學(xué)功能及其系統(tǒng)中各個(gè)蛋白的相互作用機(jī)制進(jìn)行研究，則可能為理解Mce4蛋白在結(jié)核分枝桿菌發(fā)病機(jī)制中的作用提供新的視角，也可能為結(jié)核病的治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)劉原園：文章撰寫；李璐和吳托雅：文獻(xiàn)檢索和篩選，文章校對(duì)；魯潔：文章校對(duì)及修改，經(jīng)費(fèi)支持