李玉嶺，張?jiān)獛洠瓙?ài)輝，劉翠蘭，董元夫，付茵茵，毛秀紅★

（1.山東省林業(yè)科學(xué)研究院，山東 濟(jì)南 250014；2.費(fèi)縣國(guó)有大青山林場(chǎng)，山東 費(fèi)縣 273400；3.山東綠美生態(tài)環(huán)境工程集團(tuán)有限公司，山東 濰坊 261300）

七葉樹(shù)（Aesculus chinensis）又名娑羅樹(shù)、猴板栗、開(kāi)心果，屬七葉樹(shù)科（Hippocastanaceae）七葉樹(shù)屬（Aesculus）。落葉喬木，樹(shù)干高大，樹(shù)皮深褐色或灰褐色，小葉5~7片，長(zhǎng)圓狀披針形或長(zhǎng)圓狀倒披針形，花序軸被微柔毛，小花序具5~10花，種子近球形。其產(chǎn)于河南北部，河北、山西、陜西的南部，僅陜西秦嶺有野生分布[1]。七葉樹(shù)為世界著名四大行道樹(shù)之一，具有重要的觀賞、經(jīng)濟(jì)及藥用價(jià)值，如七葉樹(shù)是制作家具、各種雕刻工藝品的優(yōu)質(zhì)木材，葉芽可代茶飲，皮、根可制肥皂，葉和花可做染料，種子可堿水煮后食用、提取淀粉和榨油[2]。其種子含有七葉皂苷[3]，具有廣泛的藥理活性，包括抗炎、抑制胃酸分泌，抗水腫，清除活性氧，抗肝損傷[4]等，臨床上主要應(yīng)用于慢性靜脈功能不全、腦水腫、四肢創(chuàng)傷及其手術(shù)后腫脹的治療，抗腫瘤[5-7]。自然狀態(tài)下七葉樹(shù)多與樟科（Lauraceae）、山毛櫸科（Fagaceae）、山茶科（Theaceae）等植物混生，常被當(dāng)做一般雜木砍伐利用，如天然分布地在四川省境內(nèi)的七葉樹(shù)受到嚴(yán)重破壞，資源蘊(yùn)藏量逐年減少[8]。

林木種質(zhì)資源在森林資源中占據(jù)核心地位，是維持生物多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性的重要保障，是實(shí)現(xiàn)種質(zhì)創(chuàng)新的重要基礎(chǔ)材料。從廣義上講，它是林木遺傳資源或基因資源，狹義上指的是林木品種選育和種苗生產(chǎn)的遺傳資源，是育種和種苗生產(chǎn)的重要來(lái)源[9]。而七葉樹(shù)古樹(shù)，具有極高的觀賞和文化價(jià)值，是非常珍貴的種質(zhì)資源。目前七葉樹(shù)的研究主要在生殖生物學(xué)[10-11]、引種試驗(yàn)[12-13]、栽培繁育[14-15]、造林技術(shù)[16]、種子化學(xué)成分和藥理作用[4,17-18]等方面。種質(zhì)資源搜集、保存和遺傳多樣性評(píng)價(jià)鮮有報(bào)道，而遺傳多樣性是種內(nèi)個(gè)體間變異的總和，直接影響到優(yōu)異基因能否被挖掘和利用。遺傳多樣性評(píng)價(jià)的方法主要有形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記和分子標(biāo)記，形態(tài)學(xué)標(biāo)記是種質(zhì)資源遺傳多樣性最直接和最基本的方法。盡管分子標(biāo)記在遺傳多樣性評(píng)價(jià)和品種特異性鑒定上應(yīng)用較多，但由于分子標(biāo)記與形態(tài)學(xué)性狀之間還不具備足夠的相關(guān)性，暫時(shí)無(wú)法取代形態(tài)學(xué)性狀評(píng)價(jià)[19-20]。本課題組實(shí)地走訪河南、陜西、甘肅、湖北的11個(gè)市縣（區(qū)），調(diào)查、收集七葉樹(shù)古樹(shù)種質(zhì)資源14份，對(duì)其形態(tài)性狀進(jìn)行遺傳多樣性、相關(guān)性、主成分和聚類分析，以期為優(yōu)異七葉樹(shù)種質(zhì)的選育提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 調(diào)查點(diǎn)的確定

通過(guò)查閱各地植物志、文獻(xiàn)資料，搜索網(wǎng)絡(luò)信息，結(jié)合前期研究工作以及詢問(wèn)各地林業(yè)部門人員，明確了七葉樹(shù)古樹(shù)的主要分布區(qū)域，據(jù)此制定此次的調(diào)查范圍。調(diào)查地區(qū)有河南省洛陽(yáng)市欒川縣、洛陽(yáng)市嵩縣、濟(jì)源市、南陽(yáng)市方城縣、登封市，湖北省神農(nóng)架林區(qū)，甘肅省隴南市康縣，陜西省西安市長(zhǎng)安區(qū)、寶雞市鳳縣、銅川市宜君縣、漢中市略陽(yáng)縣等4省的11個(gè)市（縣/區(qū)）。

1.2 調(diào)查方法和性狀測(cè)定

根據(jù)調(diào)查點(diǎn)，確定調(diào)查線路，采取實(shí)地踏查的方法尋訪七葉樹(shù)古樹(shù)生長(zhǎng)的地點(diǎn)，進(jìn)行生境觀察和記錄，拍攝樹(shù)木照片，用GPS對(duì)經(jīng)緯度和海拔進(jìn)行定位記錄，用光學(xué)測(cè)高器測(cè)量樹(shù)高（精確到0.10 m），用卷尺測(cè)量胸徑（精確到0.01 m）、用米尺測(cè)量樹(shù)冠冠幅（東西長(zhǎng)和南北長(zhǎng)的平均值，精確到0.10 m）。采集果實(shí)、葉片供后期實(shí)驗(yàn)室研究使用。調(diào)查結(jié)束后用游標(biāo)卡尺分別對(duì)30個(gè)果實(shí)、種子進(jìn)行長(zhǎng)、寬、厚的測(cè)量，精確到0.01 cm。將10個(gè)果實(shí)破皮后疊加，用游標(biāo)卡尺測(cè)量果皮厚度，測(cè)量3組求平均值，精確到0.01 cm。用電子天平稱量10個(gè)果實(shí)和種子重量，稱3組求平均值，精確到0.01 g。采集的七葉樹(shù)種子經(jīng)室外沙藏后，播種到苗圃中，用稻草蓋住，出苗后統(tǒng)計(jì)出苗率，出苗一個(gè)月后用米尺測(cè)量苗高，精確到0.01 cm。

1.3 數(shù)據(jù)整理

利用Excel 2017對(duì)七葉樹(shù)分布地點(diǎn)、測(cè)量的表型性狀統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）、遺傳多樣性（采用Shannon-Wiener′s多樣性指數(shù)（H′），計(jì)算公式為H′=－∑Pi×lnPi，Pi=ni/N）的計(jì)算[21]。用SPSS20.0進(jìn)行多重比較、相關(guān)性系數(shù)、主成分以及系統(tǒng)聚類（聚類采用Ward離差平方和法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 七葉樹(shù)表型性狀遺傳多樣性及相關(guān)性分析

本次調(diào)查的樣點(diǎn)包括河南的2市3縣、湖北的1區(qū)、甘肅的1縣、陜西的1市3縣，其經(jīng)緯度范圍31.76°-35.55° N，105.42°-112.97° E間，海拔從134 m到1 607 m。樹(shù)高變幅9.60~32.00 m，平均20.90 m，變異系數(shù)34.89%，遺傳多樣性系數(shù)2.58。胸徑0.75~2.85 m，平均1.41 m，變異系數(shù)45.83%，遺傳多樣性系數(shù)2.55。樹(shù)冠冠幅12.20~30.30 m，平均19.34 m，變異系數(shù)28.08%，遺傳多樣性系數(shù)2.60（表1和表4）?？傮w來(lái)看，七葉樹(shù)14個(gè)形態(tài)性狀的變異系數(shù)范圍為13.42%~45.83%，平均為24.27%，其中胸徑、樹(shù)高、單種重、單果重變異系數(shù)較大（表4）。遺傳多樣性指數(shù)2.33~2.60，平均2.41，以樹(shù)冠冠幅（2.60）和樹(shù)高（2.58）最大。

表1 七葉樹(shù)種質(zhì)資源調(diào)查情況Tab.1 Investigation list of germplasm resources of A.chinensis

不同地方七葉樹(shù)果皮和種皮的顏色基本一致，如果皮為棕米黃，種皮為黑紅色。果皮除了1號(hào)和2號(hào)開(kāi)裂（為了簡(jiǎn)潔方便，分析結(jié)果中地點(diǎn)用表中編號(hào)表示），其他地方果皮均不開(kāi)裂（表2）。果皮厚度變幅為0.16~0.26 cm，平均0.21 cm，變異系數(shù)21.59%。單果重變幅9.68 g（11號(hào)）~32.03 g（1號(hào)），平均22.07 g，變異系數(shù)33%。單種重變幅5.90 g（3號(hào)）~25.76 g（1號(hào)），平均16.63 g，變異系數(shù)37.50%（表2和表4），可以得出1號(hào)的種子和果實(shí)質(zhì)量均最大。種果比（種子重/果實(shí)重）可以反映種子的比重，3號(hào)種果比值最小，說(shuō)明其種子比重最小。七葉樹(shù)上述形態(tài)特征與地理位置的相關(guān)性表明：樹(shù)高和緯度呈顯著負(fù)相關(guān)，單種重和單果重呈極顯著正相關(guān)（表3）。在調(diào)查走訪中，發(fā)現(xiàn)有些地方的七葉樹(shù)古樹(shù)由于生長(zhǎng)在景區(qū)和寺廟而被保護(hù)起來(lái)，有些樹(shù)生長(zhǎng)在高山或郊外而沒(méi)有被保護(hù)。

表2 七葉樹(shù)果實(shí)和種子的形態(tài)特征Tab.2 Morphological characteristics of A.chinensis fruits and seeds

表3 七葉樹(shù)形態(tài)特征與地理位置間的相關(guān)性分析Tab.3 Analysis of the correlation between morphological characteristics and geographical location of A.chinensis

表4 七葉樹(shù)14個(gè)性狀的遺傳多樣性Tab.4 Genetic diversity of 14 characters in A.chinensis

2.2 七葉樹(shù)種實(shí)性狀多重比較及相關(guān)性分析

通過(guò)七葉樹(shù)果實(shí)和種子性狀的多重比較（表5），可以總結(jié)出，在果實(shí)特征（果實(shí)長(zhǎng)，果實(shí)寬，果實(shí)厚）中3號(hào)和8號(hào)差異均不顯著，顯然這兩個(gè)地方距離較遠(yuǎn)，但果實(shí)特征極為相近，說(shuō)明果實(shí)表型差異性與地理位置間無(wú)相關(guān)性。種子特性（種子長(zhǎng)、種子寬、種子厚、種臍長(zhǎng)、種臍寬）方面，1號(hào)和2號(hào)差異均不顯著，這與其二者位于同一個(gè)縣，地理距離較近有關(guān)。

為分析果實(shí)和種子性狀間的相關(guān)性，對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)性分析。一般而言，相關(guān)系數(shù)越大，相關(guān)性越強(qiáng)，相關(guān)系數(shù)越接近1（正相關(guān)）或-1（負(fù)相關(guān)），相關(guān)度越強(qiáng)，反之相關(guān)系數(shù)越接近于0，相關(guān)度越弱。研究發(fā)現(xiàn)，Pearson相關(guān)系數(shù)的絕對(duì)值在0.80以上，兩者關(guān)聯(lián)強(qiáng)度為極強(qiáng)相關(guān)，0.60~0.80為強(qiáng)相關(guān)，0.40~0.60為中等程度相關(guān)，0.20~0.40為弱相關(guān)，0.20以下為極弱相關(guān)或無(wú)相關(guān)[22]。表6中可以看出果實(shí)長(zhǎng)與果實(shí)寬，種子寬分別與果實(shí)厚、種子長(zhǎng)、種臍長(zhǎng)，種子厚和種臍寬均為極顯著性強(qiáng)正相關(guān)。果實(shí)厚和種子長(zhǎng)、種臍長(zhǎng)，種子長(zhǎng)和種臍長(zhǎng)為極顯著中等程度正相關(guān)。

表6 七葉樹(shù)果實(shí)和種子性狀相關(guān)性分析Tab.6 Pearson coefficient correlation analysis of fruit and seed characters of A.chinensis

2.3 七葉樹(shù)種實(shí)性狀主成分和聚類分析

主成分分析是利用降維的思想把多個(gè)性狀指標(biāo)綜合轉(zhuǎn)化成少數(shù)幾項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)而獲得最主要信息，是對(duì)多因素復(fù)雜問(wèn)題進(jìn)行簡(jiǎn)化分析的方法。對(duì)11份七葉樹(shù)的8個(gè)種實(shí)性狀標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行主成分分析（表7），得到的前3個(gè)主成分，可以反映總信息量的75.91%，基本代表大部分原始性狀的變異信息。主成分1的特征值為3.19，貢獻(xiàn)率為39.85%，對(duì)應(yīng)的特征向量與種子寬、種子長(zhǎng)、種臍長(zhǎng)、果實(shí)厚的關(guān)系密切，為高度相關(guān)因子。主成分2的特征值為1.82，貢獻(xiàn)率為22.78%，主要代表果實(shí)長(zhǎng)、果實(shí)寬。主成分3的特征值為1.06，貢獻(xiàn)率為13.28%，主要代表種子厚和種臍寬。

表7 七葉樹(shù)11份種質(zhì)資源8個(gè)種實(shí)性狀主成分分析Tab.7 Principal component analysis of eight seed traits in 11 germplasm resources of A.chinensis

根據(jù)種實(shí)表型性狀，按照系統(tǒng)聚類Ward法在歐式距離為5可以將七葉樹(shù)種質(zhì)資源劃分為3大類群（圖1）。類群Ⅰ有5份材料，分別為1、2、4、9、10。這5份材料的某些種實(shí)性狀差異不顯著，其中果實(shí)寬（1、2、4、9）差異不顯著，種子寬（1、2、4、10）差異不顯著，種子厚（1、2、9、10）差異不顯著（表5）。類群Ⅱ有4份材料，為3、6、8、11，這4份材料的果實(shí)厚性狀差異不顯著，種子長(zhǎng)和種臍寬方面（3、6、11）差異不顯著，種臍長(zhǎng)（3、6、8）差異不顯著。類群Ⅲ有2份材料，為5和7，這2份材料的果實(shí)長(zhǎng)和種子長(zhǎng)差異不顯著。系統(tǒng)聚類說(shuō)明以上材料是按照果實(shí)和種子性狀差異程度進(jìn)行聚類，而并不是嚴(yán)格按照地域聚類。

圖1 七葉樹(shù)種質(zhì)資源聚類分析（編號(hào)與表2同）Fig.1 Cluster analysis of A.chinensis germplasm resources(The numbers were the same as in Tab.2)

表5 七葉樹(shù)果實(shí)和種子性狀多重比較Tab.5 Multiple comparison of fruit and seed characters of A.chinensis

2.4 七葉樹(shù)種子出苗情況

表8中可以看出，11個(gè)地方的七葉樹(shù)種子共有10個(gè)出苗（5號(hào)由于儲(chǔ)藏不當(dāng)，種子霉?fàn)€）。七葉樹(shù)種子出苗率范圍為12.25%~66.67%，出苗率最高的為8號(hào)（66.67%），其次為1號(hào)（54.76%）和2號(hào)（48.89%）。出苗后一個(gè)月測(cè)量苗高，得出2號(hào)的苗最高(19.22 cm)，6號(hào)苗最矮(10.00 cm)。

表8 七葉樹(shù)種子出苗率和苗高Tab.8 The ratio of seedling emergence and seeding height of A.chinensis

3 結(jié)論與討論

植物的表型性狀是由基因和環(huán)境條件共同決定的，表型多樣性的分析是物種遺傳多樣性評(píng)價(jià)最直接的方法，而遺傳多樣性的評(píng)價(jià)對(duì)優(yōu)異種質(zhì)資源的挖掘和創(chuàng)新利用具有重要意義。胡光明等對(duì)野生獼猴桃（Actinidia）果實(shí)的15個(gè)性狀進(jìn)行遺傳多樣性分析，得出變異系數(shù)在24.66%~75.76%，遺傳多樣性指數(shù)0.35~2.02，表明獼猴桃種質(zhì)的性狀變異類型豐富，表型遺傳多樣性高[23]。廣西食用木薯(Manihot esculenta)也存在一定的遺傳多樣性，48份木薯種質(zhì)資源的表型性狀平均變異系數(shù)為37.90%，平均遺傳多樣性遺傳指數(shù)約為0.81[24]。同樣，云南茶樹(shù)（Camellia sinensis）14個(gè)數(shù)量性狀的變異系數(shù)在10.27%~48.14%，13個(gè)質(zhì)量性狀遺傳多樣性指數(shù)在0.64~1.40[25]，具有豐富的表型遺傳多樣性。楸樹(shù)(Catalpa bungei)葉部性狀及皮孔密度的變異系數(shù)在8.57%~26.91%，遺傳多樣性指數(shù)1.80~1.94，具有較大變異，多樣性豐富且分布均勻[26]。本研究的14份七葉樹(shù)古樹(shù)種質(zhì)資源表型性狀差異較大，變異系數(shù)范圍為13.42%~45.83%，其中以胸徑、樹(shù)高、單種重、單果重的變異最大，變異系數(shù)分別為45.83%、34.89%、37.50%和33.00%，說(shuō)明這些性狀的離散程度大，變異較豐富。遺傳多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener指數(shù))可直觀反映某性狀的出現(xiàn)頻率和分布狀況，暗示其豐富程度[27]。七葉樹(shù)14個(gè)性狀的遺傳多樣性指數(shù)2.33~2.60，平均2.41，這說(shuō)明七葉樹(shù)種內(nèi)有較大的遺傳差異，表型多樣性豐富，可為良種選育提供充足的遺傳資源。

七葉樹(shù)形態(tài)特征與地理位置的相關(guān)性得出，樹(shù)高和緯度為顯著負(fù)相關(guān)。植物表型性狀的地理變異規(guī)律也有過(guò)報(bào)道，如構(gòu)樹(shù)（Broussonetia papyrifera）的種子長(zhǎng)和種子厚受到經(jīng)度的影響大于緯度，其與采種點(diǎn)的海拔呈正相關(guān)[28]。七葉樹(shù)種實(shí)性狀的相關(guān)性表明，果實(shí)長(zhǎng)與果實(shí)寬，種子寬分別與果實(shí)厚、種子長(zhǎng)、種臍長(zhǎng)，種子厚與種臍寬均為強(qiáng)正相關(guān)性。而青檀（Pteroceltis tatarinowii）的種子長(zhǎng)與種子寬為中相關(guān)性，果實(shí)寬與種子寬、種子厚為弱相關(guān)性，種子寬與種子厚為弱相關(guān)性[29]。主成分分析將七葉樹(shù)種實(shí)8個(gè)數(shù)量性狀轉(zhuǎn)化為能代表75.91%信息的3個(gè)主成分，各主成分載荷量反應(yīng)了主要數(shù)量性狀的育種選擇潛力。不同地方的七葉樹(shù)果實(shí)和種子性狀比較發(fā)現(xiàn)，有些雖然生長(zhǎng)地不同，但果實(shí)和種子某些性狀差異并不顯著，并且系統(tǒng)聚類也是按照果實(shí)和種子的差異進(jìn)行聚類，而并不是嚴(yán)格按照地域聚類，這種情況同樣也出現(xiàn)在青檀、山桐子（Idesia polycarpa）、陜西古茶樹(shù)中[29-31]。育苗試驗(yàn)表明11個(gè)地方的七葉樹(shù)種子，有10個(gè)地方的種子出苗，出苗率為12.25%~66.67%，得出不同地方種子出苗率差異較大。七葉樹(shù)種子出苗率差異較大的原因除了種源地有關(guān)外，還與種子含水量、空氣濕度有關(guān)，一方面七葉樹(shù)種子容易脫水失活，自然放置10 d左右，一半以上的種子失活[32]。另一方面遇到連續(xù)陰天空氣濕度大容易發(fā)霉，如本試驗(yàn)中河南濟(jì)源（5號(hào)）的七葉樹(shù)種子就因陰雨天發(fā)霉而腐爛。本研究對(duì)七葉樹(shù)種實(shí)性狀進(jìn)行相關(guān)性、主成分和聚類分析，下一步將對(duì)七葉樹(shù)種質(zhì)資源表型性狀進(jìn)行全面綜合評(píng)價(jià)。