陳思云，歐陽軍，白晨倩，蘇晨皓，崔琴琴，劉 丁，謝靜涵，趙瑛瑛

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎內(nèi)科 鄭州 450014 2)鄭州大學(xué)醫(yī)藥科學(xué)研究院內(nèi)分泌研究室 鄭州 450001

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是一組以短期內(nèi)腎功能急劇減退為主要表現(xiàn)的臨床綜合征，近年來，其發(fā)病率及病死率都呈明顯升高趨勢，而有效治療手段卻依舊受限[1]。順鉑作為高效廣譜化療藥物，可通過與腫瘤細(xì)胞DNA交聯(lián)使復(fù)制及轉(zhuǎn)錄受損，從而達(dá)到抗腫瘤效果，但約30%的患者在使用期間會發(fā)生順鉑所致的AKI[2]。研究[3-4]表明，順鉑可通過產(chǎn)生大量氧自由基及活性氧，促進(jìn)TNF-α、IL-1等炎癥因子表達(dá)，激活核因子-κB(nuclear factor-κappa B，NF-κB)信號通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡等多種途徑損傷腎組織細(xì)胞，從而導(dǎo)致AKI發(fā)生，阻斷或調(diào)節(jié)上述途徑可減輕相應(yīng)腎臟損傷。姜黃素作為一種提取自姜黃類植物根莖中的疏水多酚類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗癌等多種藥理學(xué)活性[5]。既往研究[6]發(fā)現(xiàn)姜黃素可通過減輕炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激從而對腺嘌呤所誘導(dǎo)的慢性腎損傷大鼠起到保護(hù)作用。本研究用姜黃素預(yù)處理和構(gòu)建AKI小鼠模型后，觀察腎組織TNF-α、IL-18 mRNA和Toll樣受體-4(toll-like receptor 4，TLR-4)/NF-κB通路蛋白表達(dá)的變化，探討姜黃素的作用及相應(yīng)機(jī)制，以期為AKI提供預(yù)防及治療新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器順鉑、姜黃素購自美國Sigma公司，丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，RNA提取液、引物、兔抗鼠TLR-4/NF-κB多克隆抗體等均購自武漢Servicebio公司。酶標(biāo)檢測儀(美國BioTeK公司)、全自動生化儀(南京三和儀器有限公司)、熒光定量PCR儀(美國Bio-rad公司)、垂直電泳儀(武漢賽維爾生物科技有限公司)、灰度分析軟件(美國Alpha Innotech公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物、分組及處理健康雄性昆明小鼠40只，6周齡，體重(42±2) g，購自浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動物有限公司，動物合格證書編號：20210609Abzz0619000746，飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心。每籠5只小鼠，自由進(jìn)食及飲水。所有動物實(shí)驗(yàn)均符合鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)(倫理號：2021324)。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：對照組、模型組、低劑量組以及高劑量組，每組10只。每天每只小鼠需定時稱重并灌胃1次，共10天。低、高劑量組分別給予姜黃素150、300 mg/kg灌胃，對照組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。灌胃第5天晚，對照組腹腔注射生理鹽水，其余3組小鼠均給予單次腹腔注射順鉑7.5 mg/kg以誘導(dǎo)AKI模型[7]。

1.3 腎功能指標(biāo)檢測于實(shí)驗(yàn)最后1天麻醉處死各組小鼠，迅速取心臟血并分離雙側(cè)腎臟。血液離心后取血清，使用全自動生化儀進(jìn)行血清肌酐(serum creatinine，Scr)、血清尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)水平檢測。

1.4 腎組織病理學(xué)觀察取小鼠部分腎組織置于體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛溶液中固定，包埋、切片后行HE染色，于光鏡下觀察腎組織病理變化。

1.5 腎組織MDA和SOD檢測精確稱取0.2 g鼠腎臟組織進(jìn)行機(jī)械勻漿，離心后取上清液，余漩渦混勻、恒溫水浴、分光光度檢測等操作步驟按MDA、SOD檢測試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 腎組織TNF-α和IL-18 mRNA表達(dá)水平的qRT-PCR檢測小鼠腎組織勻漿后取上清，使用試劑盒抽提總RNA，參照操作說明書行反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR。以GAPDH為內(nèi)參。TNF-α上游引物5’-CCCTCACACTCACAAACCACC-3’，下游引物5’-CTTTGAGATCCATGCCGTTG-3’；IL-18上游引物5’-TGAAGTAAGAGGACTGGCTGTGA-3’；下游引物5’-TTGGCAAGCAAGAAAGTGTCC-3’；GAPDH上游引物5’-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3’，下游引物5’-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3’。反應(yīng)體系：qPCR Mix 7.5 μL+上、下游引物各1.5 μL+cDNA 2.0 μL，用無RNase的ddH2O補(bǔ)足體系至15 μL。反應(yīng)條件:95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s、60 ℃30 s，共40個循環(huán)；95 ℃ 5 min。采用2-ΔΔCT法計算目的mRNA表達(dá)水平。

1.7 腎組織TLR-4和NF-κB蛋白表達(dá)的Western blot檢測提取腎組織總蛋白并用BCA蛋白濃度測定試劑盒定量，沸水浴變性后上樣行SDS-PAGE電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，依次加入TLR4和NF-κB一抗(按1∶1 000稀釋)、二抗(按1∶3 000稀釋)，化學(xué)發(fā)光，掃描存檔膠片。采用AlphaEase FC軟件分析條帶灰度值，并用目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值來表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 25.0分析。各組小鼠Scr，血清BUN，腎組織MDA含量和SOD活性，腎組織TNF-α、IL-18 mRNA和TLR-4、NF-κB蛋白表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腎功能指標(biāo)比較與對照組比較，模型組和低劑量組小鼠Scr、血清BUN水平升高；與模型組比較，低、高劑量組小鼠Scr、血清BUN水平降低；與低劑量組比較，高劑量組小鼠Scr、血清BUN水平降低，見表1。

表1 各組小鼠腎功能指標(biāo)比較

*：與對照組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05；△：與低劑量組比較，P<0.05

2.2 各組小鼠腎組織病理學(xué)變化見圖1。對照組可見腎臟皮、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)分明，腎單位形態(tài)正常，間質(zhì)未見炎癥細(xì)胞聚集；模型組可見大量腎小管上皮細(xì)胞腫脹，空泡變性明顯，刷狀緣消失，部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)壞死崩解，管腔擠壓變形，腔內(nèi)可見類蛋白管型，間質(zhì)有炎癥細(xì)胞聚集；低、高劑量組腎小管細(xì)胞腫脹變性、壞死脫落以及炎細(xì)胞聚集等損傷均較模型組減輕，且高劑量組改善更為明顯。

2.3 各組小鼠腎組織MDA含量和SOD活性比較與對照組比較，模型組和低劑量組腎組織MDA含量升高、SOD活性降低；與模型組比較，低、高劑量組腎組織MDA含量降低、SOD活性升高；與低劑量組比較，高劑量組腎組織MDA含量降低、SOD活性升高，見表2。

表2 各組小鼠腎組織MDA含量和SOD活性比較

2.4 各組小鼠腎組織TNF-α和IL-18 mRNA表達(dá)的比較與對照組比較，模型組和低、高劑量組腎組織TNF-α和IL-18 mRNA表達(dá)水平升高；與模型組比較，低、高劑量組腎組織TNF-α和IL-18 mRNA表達(dá)水平降低；與低劑量組比較，高劑量組腎組織TNF-α和IL-18 mRNA表達(dá)水平降低，見表3。

表3 各組小鼠腎組織TNF-α和IL-18 mRNA表達(dá)的比較

2.5 各組小鼠腎組織TLR-4和NF-κB蛋白表達(dá)的比較與對照組比較，模型組和低、高劑量組腎組織TLR-4和NF-κB蛋白表達(dá)升高；與模型組比較，低、高劑量組腎組織TLR-4和NF-κB蛋白表達(dá)降低，且高劑量組降低更顯著，見表4。

表4 各組小鼠腎組織TLR-4和NF-κB蛋白表達(dá)的比較

3 討論

順鉑作為臨床一線化療藥，在肺癌、睪丸癌、卵巢癌及宮頸癌等多種實(shí)體腫瘤中治療效果顯著，經(jīng)腎小球?yàn)V過后，會以高出血液數(shù)倍的濃度聚集于腎小管，腎損傷程度及AKI發(fā)生率具有劑量依賴性[3-4]。除直接損傷細(xì)胞DNA外，當(dāng)順鉑進(jìn)入腎小管細(xì)胞時，可與內(nèi)源性抗氧化劑谷胱甘肽結(jié)合，使氧化應(yīng)激增加，造成線粒體功能受損[8]。此外，順鉑還可促進(jìn)多種炎性細(xì)胞因子及趨化因子表達(dá)增加，招募炎細(xì)胞聚集于腎臟，同時激活多條細(xì)胞凋亡途徑[9-10]。本研究采用順鉑單次腹腔注射法來制備AKI模型。與對照組比較，模型組小鼠腎功能指標(biāo)Scr及血清BUN均升高，且光鏡下可觀察到腎小管細(xì)胞腫脹壞死、管腔明顯變形、間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤等病理變化，提示AKI模型建立成功。

姜黃素作為一種親脂性多酚化合物，可通過調(diào)節(jié)多種生物靶點(diǎn)(包括轉(zhuǎn)錄因子、生長因子、炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子和凋亡蛋白等)和細(xì)胞通路，發(fā)揮抗癌、抗炎、延緩衰老等生物活性[11]。既往研究[12]發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注誘導(dǎo)的AKI可引起晚期腎臟纖維化，而姜黃素則可通過上調(diào)APPL1的表達(dá)和抑制Akt磷酸化從而減輕這種損害。本研究結(jié)果表明，與模型組比較，姜黃素預(yù)處理后，低、高劑量組Scr和血清BUN水平降低，高劑量組降低更明顯，提示姜黃素對順鉑引起的腎臟損傷具有保護(hù)作用，且可能有劑量依賴性。MDA和SOD常被用于反應(yīng)組織氧化應(yīng)激損傷程度。前者作為脂質(zhì)過氧化的降解產(chǎn)物，不僅反映組織中活性氧及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)水平，還間接代表生物膜受自由基氧化損傷的程度；而后者作為生物體內(nèi)重要的抗氧化酶之一，可清除體內(nèi)自由基，修復(fù)受損細(xì)胞[13]。Chen等[14]構(gòu)建的高尿酸血癥小鼠模型中，姜黃素可有效抑制血清及肝臟中的黃嘌呤氧化酶，進(jìn)一步恢復(fù)組織SOD活性，減少血清MDA積累。在本研究中，經(jīng)姜黃素預(yù)處理后，低、高劑量組腎組織MDA含量均低于模型組，且兩組SOD活性均升高，提示姜黃素同樣能通過清除腎組織內(nèi)活性氧，降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而改善氧化應(yīng)激，減輕腎臟損傷。

TLR-4廣泛表達(dá)于白細(xì)胞及多種腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞，當(dāng)與配體結(jié)合后，其下游NF-κB被激活，繼而參與調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)表達(dá)[15]。既往研究[16]表明，在順鉑誘導(dǎo)的AKI中，腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞中TLR-4的激活可促進(jìn)多種細(xì)胞因子產(chǎn)生，引起炎癥反應(yīng)，加重腎臟損傷。Benedetti等[17]發(fā)現(xiàn)，與單純應(yīng)用順鉑比較，順鉑聯(lián)合TNF-α處理可使體外培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞損傷程度加重、死亡細(xì)胞增加，而TNF-α又是順鉑誘導(dǎo)腎組織炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵上游調(diào)節(jié)因子，可協(xié)調(diào)多種促炎因子激活，誘導(dǎo)黏附分子表達(dá)，促進(jìn)腎組織內(nèi)炎癥細(xì)胞募集。近年來，姜黃素在腎臟疾病應(yīng)用方面受到廣泛關(guān)注。有研究[18]通過構(gòu)建高尿酸血癥大鼠模型，發(fā)現(xiàn)姜黃素可能通過減輕氧化應(yīng)激及調(diào)控NF-κB表達(dá)，減輕腎組織纖維化和炎癥反應(yīng)。Huang等[19]發(fā)現(xiàn)姜黃素可能通過抑制lncRNA PVT1表達(dá)，從而抑制JNK/NF-κB通路，緩解脂多糖誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠AKI。本研究結(jié)果表明，與對照組比較，模型組腎組織TLR-4和NF-κB蛋白，TNF-α和IL-18 mRNA表達(dá)升高，而經(jīng)姜黃素預(yù)處理后，低、高劑量組以上指標(biāo)均降低，高劑量組降低更明顯，提示姜黃素可能通過抑制TLR-4和NF-κB蛋白表達(dá)、減少炎癥因子產(chǎn)生從而減輕炎癥反應(yīng)，對順鉑誘導(dǎo)的AKI起到保護(hù)作用。

綜上所述，姜黃素可通過增加腎組織SOD活性，降低MDA含量，抑制TLR4/NF-κB通路蛋白表達(dá)，減少TNF-α和IL-18等炎癥因子產(chǎn)生，從而起到減輕氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，保護(hù)腎功能等作用。該研究可為姜黃素用于AKI防治提供理論依據(jù)，但它是否還能通過其他途徑發(fā)揮相應(yīng)作用仍有待進(jìn)一步研究。