蘇 赟,毛澄源,秦小飛,單迎光,史長河,范麗媛,董亞麗,鄭惠敏,李心蔚,張 槊,胡正威,楊 靖,許予明

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 鄭州 450052 3)河南省肝病藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450052

Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病(neurofibromatosis type 1,NF1)為單基因遺傳病，是由神經(jīng)外胚層發(fā)育異常而導(dǎo)致漸進(jìn)性多系統(tǒng)損害的常染色體顯性遺傳病，發(fā)病率為1/3 000～1/2 500[1]，臨床表型異質(zhì)性大。美國國立衛(wèi)生研究院制定了統(tǒng)一的NF1診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，至少符合以下兩條即可診斷為NF1：①有6個(gè)或6個(gè)以上牛奶咖啡斑，最大直徑≥5 mm(青春期前)/15 mm(青春期后)。②有2個(gè)或2個(gè)以上任何類型的神經(jīng)纖維瘤或1個(gè)叢狀神經(jīng)纖維瘤。③腋窩或腹股溝區(qū)有雀斑。④有視神經(jīng)膠質(zhì)瘤或其他腦實(shí)質(zhì)膠質(zhì)瘤。⑤有2個(gè)或2個(gè)以上虹膜Lisch結(jié)節(jié)。⑥骨發(fā)育不良或有明確的骨性病變。⑦一級親屬患NF1。

Neurofibromin 1(NF1)基因突變是該病的遺傳學(xué)病因。NF1基因編碼的神經(jīng)纖維蛋白是原癌基因Ras的負(fù)性調(diào)控因子，NF1基因突變或異常表達(dá)導(dǎo)致神經(jīng)纖維蛋白功能降低或喪失，從而引起Ras信號通路過度激活，細(xì)胞大量增殖且難以凋亡，進(jìn)而增加各種良性及惡性腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[3]。

現(xiàn)對一個(gè)以高血壓、骨折等不典型表現(xiàn)為首發(fā)癥狀的NF1家系進(jìn)行報(bào)道，并利用目標(biāo)捕獲高通量測序技術(shù)[4]對該家系成員進(jìn)行NF1基因突變檢測。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1 臨床資料

1.1 先證者資料男性，12歲，漢族，因“血壓升高1年”收治于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院?；颊? a前因右側(cè)股骨轉(zhuǎn)子間骨折于外院行骨折固定術(shù)后發(fā)現(xiàn)血壓升高，最高達(dá)180/120 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，無頭暈頭痛、惡心嘔吐、視物模糊等；腎上腺增強(qiáng)CT示左側(cè)腎上腺瘤，于外院行手術(shù)治療，術(shù)后口服苯磺酸氨氯地平片降壓，血壓控制于(140～150)/(90～100) mmHg。

近1 a血壓持續(xù)偏高，伴體位變動(dòng)后頭暈、休息后好轉(zhuǎn)。自述幼年時(shí)即出現(xiàn)軀干、頸部及四肢皮膚多發(fā)性深棕色牛奶咖啡斑，逐年增大和增多，未診治。查體：身高150 cm，BMI 20.89 kg/m2；胸腹部呈彌漫大片狀牛奶咖啡斑，與周圍組織界限清楚(圖1)；左上肢血壓166/108 mmHg，右上肢158/99 mmHg，左下肢155/93 mmHg，右下肢149/94 mmHg；心臟、肺部、腹部及神經(jīng)系統(tǒng)檢查均未見異常。血尿便常規(guī)、肝腎功能、血電解質(zhì)、血脂、炎癥指標(biāo)基本正常。24 h尿兒茶酚胺、24 h尿游離皮質(zhì)醇、24 h尿醛固酮及24 h尿香草苦杏仁酸結(jié)果均正常；促腎上腺皮質(zhì)激素及皮質(zhì)醇節(jié)律無異常；立臥位腎素活性、血管緊張素Ⅱ及醛固酮水平均正常。24 h動(dòng)態(tài)血壓監(jiān)測：全天平均血壓158/93 mmHg，心率86次/min；日間平均血壓164/95 mmHg，心率90次/min；夜間平均血壓149/87 mmHg，心率84次/min。眼科裂隙燈檢查未見虹膜Lisch結(jié)節(jié)及其他損害。

A：胸腹部彌漫大片狀牛奶咖啡斑；B：下肢散在牛奶咖啡斑

超聲檢查示：心內(nèi)結(jié)構(gòu)及功能未見明顯異常，肝膽胰脾未見明顯異常，雙腎大小形態(tài)正常，右腎囊腫，雙側(cè)腎動(dòng)脈走行、內(nèi)徑及血流速度未見異常。CT示：右腎囊腫，右側(cè)腎上腺大小、形態(tài)及密度未見異常，且增強(qiáng)后未見異常強(qiáng)化；脊柱旁(約雙腎水平)見多發(fā)軟組織密度影，部分融合成團(tuán)，右側(cè)為大，邊界尚可，密度均勻，增強(qiáng)后未見明顯強(qiáng)化，考慮神經(jīng)來源腫瘤；L3椎體骨質(zhì)破壞，右側(cè)臀大肌萎縮。腰椎及雙髖關(guān)節(jié)MRI示：雙側(cè)骶叢神經(jīng)增粗，右側(cè)坐骨神經(jīng)走行區(qū)及腰段水平椎間孔神經(jīng)走行區(qū)內(nèi)多發(fā)團(tuán)片狀、串珠狀長T2信號(圖2)，考慮神經(jīng)纖維瘤；腰椎體形態(tài)失常，腰椎后突，腰背部皮下軟組織水腫(圖2)；雙側(cè)骶髂關(guān)節(jié)炎癥，右側(cè)股骨近端骨折伴骨髓水腫、周圍軟組織水腫、滑膜增生。因先證者拒絕未行組織病理學(xué)等檢查。

A：髖關(guān)節(jié)T2WI橫軸面抑脂圖像，見右側(cè)坐骨神經(jīng)走行區(qū)多發(fā)串珠狀長T2信號；B：腰椎T2WI橫軸面圖像，見腰段水平雙側(cè)椎間孔神經(jīng)走行區(qū)內(nèi)對稱性團(tuán)塊狀長T2信號；C：T2WI矢狀面圖像，見腰椎體形態(tài)失常，腰椎后突，L3椎體骨質(zhì)破壞，腰背部皮下軟組織水腫

上述結(jié)果不支持繼發(fā)性高血壓的診斷，鑒于既往腎上腺瘤切除術(shù)后高血壓持續(xù)不緩解，予“氨氯地平+非洛地平”口服控制血壓，血壓控制于140/80 mmHg。請骨科及神經(jīng)外科會診，建議定期復(fù)查，對癥治療。為明確診斷，進(jìn)一步行基因檢測。

1.2 家系調(diào)查該核心家系共2代3人，無近親結(jié)婚，否認(rèn)高血壓家族史。先證者母親軀干部位密集分布雀斑樣咖啡色小斑點(diǎn)，多處散在褐色斑，直徑數(shù)毫米至數(shù)厘米，無高血壓及其他伴隨癥狀。先證者父親無類似表現(xiàn)。

1.3 NF1基因突變檢測檢測獲得受試者知情同意。采用EDTA抗凝管收集先證者及其父母外周靜脈血2 mL，采用純化試劑盒法(北京百泰克，貨號DP2201)提取全血基因組DNA，對NF1基因全部編碼區(qū)外顯子進(jìn)行目標(biāo)捕獲高通量測序，對可疑突變進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證，將測序結(jié)果與UCSC數(shù)據(jù)庫人類基因組信息(GRCh37/hg19)進(jìn)行比對。測序委托北京金準(zhǔn)基因科技有限責(zé)任公司完成。高通量測序目標(biāo)區(qū)覆蓋度達(dá)99.90%，目標(biāo)區(qū)平均測序深度不小于200×，目標(biāo)區(qū)測序深度大于20×的覆蓋率達(dá)到99.90%。結(jié)果顯示：先證者NF1基因第38號外顯子存在雜合突變c.5719delG。

Sanger測序結(jié)果(圖4)證實(shí)先證者存在NF1基因第5719位堿基G缺失，造成該位置以后出現(xiàn)連續(xù)套峰，在蛋白水平將導(dǎo)致第1907位氨基酸由谷氨酸變?yōu)橘嚢彼?，并在之后的?4位形成終止密碼，導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯提前終止，形成僅由1 920個(gè)氨基酸組成的截短多肽。其母此位點(diǎn)存在相同的雜合移碼突變，而表型正常的父親不攜帶此突變，符合家系共分離。

圖4 該家系NF1基因突變位點(diǎn)測序圖(箭頭所示為c.5719delG)

1.4 突變位點(diǎn)致病性分析及蛋白預(yù)測檢索人類基因突變數(shù)據(jù)庫(The Human Gene Mutation Database,HGMD)專業(yè)版2022.1(http://www.hgmd.org/)及外顯子組整合數(shù)據(jù)庫(The Exome Aggregation Consortium,ExAC)3.3版(http://exac.broadinstitute.org)，參照人類基因突變協(xié)會命名規(guī)則及美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)與指南[5]，參考HGMD數(shù)據(jù)庫報(bào)道的NF1轉(zhuǎn)錄版本(NM_000267.3)，對該突變進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，HGMD和ExAC中均未檢索到該突變位點(diǎn)；中外文數(shù)據(jù)庫中均未檢索到該突變致病性的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。先證者及其母親攜帶可致截短型蛋白的移碼突變，為非常強(qiáng)的致病性證據(jù)(PVS1：基因存在功能喪失型變異)；ExAC數(shù)據(jù)庫中未見該突變在正常對照人群中的頻率，為中等致病性證據(jù)(PM2：正常人變異數(shù)據(jù)庫未見報(bào)道)；攜帶該突變的先證者及其母親的臨床表現(xiàn)符合NF1，為支持致病性證據(jù)(PP4:突變攜帶者的表型或家族史高度符合某種單基因遺傳疾病)。因此根據(jù) ACMG指南，該突變被評定為“致病(pathogenic)”。

利用SIFT(http://sift.jcvi.org/)和PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2)等生物信息學(xué)預(yù)測軟件對突變蛋白功能進(jìn)行預(yù)測?；贖umanVar數(shù)據(jù)庫，PolyPhen2分值為0.969，表明該突變?yōu)椤昂芸赡苡泻?probably damaging)”，導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)或功能改變的可能性大。

2 討論

NF1為單基因遺傳病，臨床表型異質(zhì)性大，診斷主要基于臨床表現(xiàn)，但典型的特征具有年齡相關(guān)性，即牛奶咖啡斑、神經(jīng)纖維瘤、腋窩或腹股溝雀斑等表現(xiàn)出現(xiàn)時(shí)間跨度大，故疾病早期往往由于缺乏特異性而難以明確診斷[6]。本家系中，先證者骨骼病變明顯，以右側(cè)股骨近端骨折為首發(fā)癥狀；影像學(xué)結(jié)果示L3椎體骨質(zhì)破壞及腰椎后突。神經(jīng)纖維瘤病導(dǎo)致脊柱畸形的具體機(jī)制尚不清楚，推測可能與原發(fā)外胚層缺陷及神經(jīng)纖維瘤組織直接侵入骨骼等有關(guān)[7]。1.5%～39.0%的NF1患者伴發(fā)椎旁神經(jīng)纖維瘤[8-10]，椎旁神經(jīng)纖維瘤過度生長可侵犯脊椎，造成椎體骨質(zhì)破壞及形態(tài)失常，進(jìn)一步導(dǎo)致脊柱結(jié)構(gòu)改變。既往研究[11]發(fā)現(xiàn)，約16%的NF1患者合并高血壓。國內(nèi)曾報(bào)道過3例NF1患兒合并高血壓，均為腎血管性高血壓[12-14]。本家系先證者合并高血壓病(3級，低危)，相關(guān)檢查均未見明顯異常，不支持繼發(fā)性高血壓的診斷，考慮到高血壓持續(xù)不緩解，故首選藥物治療，穩(wěn)定控制血壓并定期監(jiān)測；同時(shí)加強(qiáng)隨訪及用藥指導(dǎo)，以期預(yù)防靶器官損害及延緩心腦血管不良事件的發(fā)生，并警惕繼發(fā)性高血壓的發(fā)生。此外，先證者的胸腹部呈彌漫大片狀、不規(guī)則形、光滑的色素異常沉著病損(直徑約16 cm)，顏色均一，邊界清晰。如此巨大的牛奶咖啡斑在神經(jīng)纖維瘤病患者中鮮有發(fā)現(xiàn)，故需收集更多的病例，以探究其是否為一種獨(dú)特的臨床表型。

NF1基因自發(fā)突變率高達(dá)50%，目前HGMD數(shù)據(jù)庫已收集超過3 700種NF1基因突變，包括單核苷酸替換、插入、缺失及剪切等多種類型的突變[15]。但在已報(bào)道的突變中，尚未發(fā)現(xiàn)熱點(diǎn)區(qū)域，也未發(fā)現(xiàn)基因型與臨床表型之間的相關(guān)性[16]。目前研究[17]發(fā)現(xiàn)，NF1基因型與表型的相關(guān)性僅體現(xiàn)在特定的基因突變類型中，如NF1基因第17號外顯子3 bp框內(nèi)缺失與NF1的典型色素特征有關(guān)，但不發(fā)生皮膚神經(jīng)纖維瘤。

目標(biāo)捕獲高通量測序技術(shù)相比于全基因組測序更高效快捷[4]。本研究采用目標(biāo)捕獲高通量測序結(jié)合Sanger測序，對該家系進(jìn)行了快速的基因檢測，結(jié)果為先證者及其母攜帶相同的NF1基因突變，但兩者臨床表現(xiàn)差異較大，提示基因型與臨床表型關(guān)系的不確定性。在同一家系，同樣的基因突變也可能有不同的臨床表現(xiàn)，說明除基因突變外，NF1表型可能還受到鑲嵌或修飾基因的調(diào)控[18]。本研究所發(fā)現(xiàn)的NF1基因第38號外顯子雜合突變c.5719delG為新發(fā)突變，在HGMD和ExAC數(shù)據(jù)庫中未有報(bào)道。該突變造成開放閱讀框發(fā)生移碼改變，理論上導(dǎo)致蛋白質(zhì)翻譯提前終止，形成僅由1 920個(gè)氨基酸組成的截短蛋白(p.Glu1907Lysfs*14)，影響蛋白質(zhì)的功能，最終導(dǎo)致疾病發(fā)生。

本研究提示對于僅有高血壓等不典型臨床癥狀同時(shí)合并皮膚病變的患者，應(yīng)考慮NF1的可能，系統(tǒng)的臨床檢查及基因檢測有助于明確診斷。本研究發(fā)現(xiàn)的NF1突變(c.5719delG)豐富了中國漢族人群NF1基因突變譜，可為該疾病的遺傳學(xué)診斷提供更多信息。