陸 杰，楊 立，朱遠(yuǎn)航，張華文，楊 靖

鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052

子宮內(nèi)膜異位癥是育齡婦女常見(jiàn)的慢性婦科疾病，目前發(fā)病機(jī)制尚不明確，局限于激素或手術(shù)治療，且治療后復(fù)發(fā)率高。有學(xué)者[1]發(fā)現(xiàn)在育齡期女性中高脂飲食是子宮內(nèi)膜異位癥的高危因素。脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白4(adipocyte fatty acid-binding protein 4，F(xiàn)ABP4)是一種重要的脂質(zhì)代謝因子，與機(jī)體脂肪含量相關(guān)，可導(dǎo)致肥胖[2]。我們前期的研究[3]表明：子宮內(nèi)膜異位癥患者血清及腹腔沖洗液中FABP4水平較高。本研究以子宮內(nèi)膜異位癥模型小鼠為研究對(duì)象，觀察高脂飲食對(duì)小鼠異位子宮內(nèi)膜增長(zhǎng)及FABP4表達(dá)的影響，探究高脂飲食在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)展中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑SPF級(jí)雌性C57BL/6J小鼠[SCXK(豫)2017-0001]20只，均購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,6周齡,體重18～20 g。小鼠飼養(yǎng)間晝夜交替12 h，環(huán)境平均溫度為(23±2) ℃，平均相對(duì)濕度為(50±5)%，小鼠自由取食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程均遵循動(dòng)物倫理學(xué)規(guī)范。高脂飼料(H10060，21.92 kJ/g，脂肪供能比60%)購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司[許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0008]，普通小鼠生長(zhǎng)維持飼料(16.11 kJ/g，脂肪供能比12%)購(gòu)自湖南嘉泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)：SCXK(湘)2015-0010]。FABP4多克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔、EDTA抗原修復(fù)液及DAB顯色劑購(gòu)自武漢Servicebio生物科技有限公司；核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；過(guò)氧化物酶體增殖劑激活受體γ(peroxisome proliferators activated receptor γ，PPARγ)抗體購(gòu)自美國(guó)Affinity公司；TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒均購(gòu)自福州度一基地生物科技有限公司；苯甲酸雌二醇購(gòu)自上海全宇生物科技有限公司。

1.2 子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型的建立術(shù)前1天小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇(0.1 mg/kg)，使所有實(shí)驗(yàn)小鼠處于同一動(dòng)情周期。手術(shù)在無(wú)菌條件下進(jìn)行。麻醉小鼠后，將其仰臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，腹部剪毛、消毒，于尿道上端沿腹中線切開(kāi)1 cm左右，使用止血鉗鈍性分離左側(cè)子宮，于靠近左側(cè)卵巢及子宮Y形端兩端結(jié)扎，取中間一段管狀子宮后迅速放入盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中，剪開(kāi)管狀子宮，留取中間完整5 mm×5 mm大小的子宮片。隨后將切好的子宮片縫合于右側(cè)腹壁固定，逐層縫合腹腔。術(shù)后1周內(nèi)腹腔注射慶大霉素0.1 mL預(yù)防感染。建模后兩周開(kāi)腹、觀察。小鼠移植物呈囊狀小泡，表面有血管生成，表明造模成功，共18只小鼠建模成功，建模成功率90%。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理將建模成功后的小鼠分為兩組：普食組和高脂飲食組，每組9只。普食組用普通小鼠生長(zhǎng)維持飼料、高脂飲食組用高脂飼料飼養(yǎng)，自由取食，小鼠體重每周測(cè)量1次。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)飼養(yǎng)8周后禁食和水5 h，取小鼠尾靜脈血，-70 ℃保存。使用ELISA試劑盒檢測(cè)兩組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。頸椎脫臼處死小鼠，測(cè)量?jī)山M小鼠的體重、體長(zhǎng)(鼻子至肛門的距離)，計(jì)算Lee′s指數(shù)[4]，打開(kāi)小鼠腹腔，觀察子宮內(nèi)膜異位病灶，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量子宮內(nèi)膜異位病灶的長(zhǎng)、寬、高,計(jì)算子宮內(nèi)膜異位病灶體積(mm3)=0.52×長(zhǎng)×寬×高。隨后將兩組小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶分離，PBS液清洗后取0.3 g組織用于Western blot，剩余組織使用40 g/L多聚甲醛溶液固定，用于HE染色和免疫組化。

1.5 子宮內(nèi)膜異位病灶組織的HE染色觀察子宮內(nèi)膜異位病灶組織固定24 h后，蒸餾水清洗，梯度乙醇脫水后石蠟包埋，4 μm厚切片。依次使用二甲苯和梯度乙醇對(duì)組織切片進(jìn)行脫蠟和水化，HE染色，脫水、透明后中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.6 子宮內(nèi)膜異位病灶組織中FABP4蛋白表達(dá)的檢測(cè)取1.5中的組織切片，依次使用二甲苯和梯度乙醇對(duì)組織切片進(jìn)行脫蠟和水化，體積分?jǐn)?shù)3%雙氧水溶液避光孵育25 min，PBS洗滌3次，血清封閉30 min。在切片上滴加一抗(FABP4多克隆抗體，稀釋倍數(shù)1∶2 000)，于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過(guò)夜。PBS洗滌3次。滴加二抗(HRP標(biāo)記的山羊抗兔，稀釋倍數(shù) 1∶200)，室溫孵育50 min。PBS洗滌3次。滴加DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時(shí)間，陽(yáng)性為棕黃色，流水沖洗切片終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。脫水，晾干，中性樹膠封片。以PBS做陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性結(jié)果做陽(yáng)性對(duì)照。免疫組化染色陽(yáng)性結(jié)果判定：以細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃色或棕色顆粒為陽(yáng)性表達(dá)。每張切片選擇10個(gè)高倍鏡視野(×400)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，取10個(gè)視野的平均數(shù)： <5%為0分、5%～為1分、26%～為2分、>50%為3分。染色強(qiáng)度：無(wú)染色為0分、淺黃色為1分、棕黃色為2分、棕色為3分。取兩項(xiàng)結(jié)果之和:0～1分為陰性(-)、2分為弱陽(yáng)性(+)、3～4分為陽(yáng)性()、≥5分為強(qiáng)陽(yáng)性()。

1.7 子宮內(nèi)膜異位病灶組織中PPARγ、NF-κB蛋白表達(dá)的檢測(cè)采用Western blot法，將0.3 g組織標(biāo)本轉(zhuǎn)移至離心管中，加入裂解液，置于冰上用勻漿機(jī)充分研磨勻漿30 min，離心，提取上清液后，加入Buffer使蛋白變性，冷卻離心，置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照配方配?00 g/L分離膠和50 g/L濃縮膠，放入加滿電泳液的電泳槽中上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，50 g/L牛奶室溫封閉1 h、一抗(PPARγ抗體稀釋倍數(shù)1∶2 000，NF-κB抗體稀釋倍數(shù)1∶1 000)4 ℃孵育24 h，次日用二抗( HRP標(biāo)記的山羊抗兔，稀釋倍數(shù)1∶5 000)孵育1 h，再次清洗，加入DAB顯影劑顯色。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，用Quantity One軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行分析。以PPARγ、NF-κB 蛋白和內(nèi)參條帶灰度值的比值作為蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行分析。兩組小鼠飼養(yǎng)8周后體重增加量、子宮內(nèi)膜異位病灶體積、Lee′s 指數(shù)，血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，子宮內(nèi)膜異位病灶組織PPARγ、NF-κB蛋白水平的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。兩組小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶組織FABP4蛋白表達(dá)的比較采用秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 小鼠子宮內(nèi)膜異位癥模型建立情況兩組小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶均生長(zhǎng)良好，體積增大，呈隆起的暗紅色或透亮的囊腫小泡，生長(zhǎng)良好，其內(nèi)充滿液體，子宮內(nèi)膜異位病灶周圍血管豐富，部分病灶與周圍組織粘連；HE染色可見(jiàn)兩組小鼠異位的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞呈柱狀、立方狀或扁平狀,以環(huán)形或鋸齒狀生長(zhǎng),間質(zhì)中腺體數(shù)量減少,血管豐富,肌層結(jié)構(gòu)不清晰(圖1)。

A：普食組；B：高脂飲食組；1：大體，箭頭示小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶；2：HE染色(×100)

2.2 兩組小鼠體重、子宮內(nèi)膜異位病灶體積、Lee′s指數(shù)建模前兩組小鼠體重?zé)o差異，飼養(yǎng)8周后高脂飲食組小鼠體重增加量、Lee′s 指數(shù)均大于普食組(表1)。

表1 兩組小鼠體重、子宮內(nèi)膜異位病灶體積、Lee′s指數(shù)比較

2.3 兩組小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶組織FABP4蛋白的表達(dá)FABP4蛋白主要在小鼠異位的子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞中表達(dá)(圖2)。高脂飲食組小鼠子宮內(nèi)膜異位組織FABP4蛋白的表達(dá)高于普食組小鼠(表2)。

A:普食組；B：高脂飲食組

表2 兩組小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶組織FABP4蛋白表達(dá)的比較 例

2.4 兩組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平與普食組比較，高脂飲食組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高(表3)。

2.5 兩組小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶組織PPARγ、NF-κB蛋白的表達(dá)與普食組比較，高脂飲食組小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶組織PPARγ蛋白的表達(dá)降低，NF-κB蛋白的表達(dá)升高(表4)。

表4 兩組小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶組織PPARγ和NF-κB蛋白表達(dá)的比較

3 討論

高脂飲食會(huì)導(dǎo)致機(jī)體營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩和脂質(zhì)代謝紊亂，使機(jī)體內(nèi)脂肪積聚，從而導(dǎo)致肥胖的發(fā)生。已有研究[5]表明，脂肪組織不僅是機(jī)體的能量?jī)?chǔ)存器官，還是重要的內(nèi)分泌器官，能夠分泌瘦素、脂聯(lián)素等脂肪因子，可溶性細(xì)胞間黏附分子(sICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)等黏附分子，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、胎盤生長(zhǎng)因子(PIGF)等趨化因子，在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、炎癥等方面起到重要作用。有研究[6-8]發(fā)現(xiàn)瘦素、脂聯(lián)素等脂肪因子、sICAM-1、VCAM等黏附分子和VEGF、FGF、PIGF等趨化因子可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜組織在腹腔內(nèi)黏附、侵襲和血管生成，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生。子宮內(nèi)膜異位癥是一種激素依賴性疾病，而脂肪組織可以促進(jìn)雌、雄激素之間相互轉(zhuǎn)化，是除卵巢外雌激素的重要來(lái)源[9]。本研究結(jié)果表明高脂飲食組小鼠飼養(yǎng)8周后體重增加量、Lee′s指數(shù)和子宮內(nèi)膜異位病灶體積大于普食組小鼠，提示高脂飲食促進(jìn)了小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶的增長(zhǎng)。臨床研究[10]表明，與非子宮內(nèi)膜異位癥婦女比較，患有子宮內(nèi)膜異位癥的婦女BMI偏低。Ferrero等[10]研究發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜異位癥患者中存在脂質(zhì)功能障礙和脂肪流失的現(xiàn)象。一項(xiàng)關(guān)于子宮內(nèi)膜異位癥小鼠模型的研究[11]發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥可降低小鼠體重和體脂水平。以上研究結(jié)果表明子宮內(nèi)膜異位癥與BMI呈負(fù)相關(guān)，與我們的結(jié)果不一致。這可能與行為因素有關(guān)，如子宮內(nèi)膜異位癥的慢性疼痛，以及伴隨的胃腸道紊亂(惡心和腹瀉)，導(dǎo)致食欲不振從而導(dǎo)致體重降低。最新研究[12]結(jié)果表明，子宮內(nèi)膜異位癥會(huì)減少機(jī)體脂肪干細(xì)胞，并通過(guò)microRNA誘導(dǎo)的脂肪細(xì)胞代謝基因表達(dá)的改變，導(dǎo)致機(jī)體低脂肪的傾向，提示低BMI是子宮內(nèi)膜異位癥的結(jié)果。肥胖對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥的影響尚無(wú)定論。

FABP4是成熟脂肪細(xì)胞的重要細(xì)胞溶質(zhì)蛋白，在脂肪組織中高度表達(dá)，在脂類代謝紊亂和炎癥疾病的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。血清FABP4 水平與代謝疾病和肥胖的嚴(yán)重程度成正相關(guān)[2]，即高脂飲食會(huì)導(dǎo)致FABP4的表達(dá)升高。Zhu等[13]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP4在增生期和分泌期子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、分泌期基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，沉默或選擇性抑制FABP4會(huì)抑制子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，F(xiàn)ABP4在維持子宮內(nèi)膜細(xì)胞功能中具有重要作用；他們還指出FABP4可能還參與了子宮內(nèi)膜病變的發(fā)生發(fā)展，如功能失調(diào)性子宮出血、子宮內(nèi)膜增生、子宮內(nèi)膜癌、子宮內(nèi)膜異位癥和子宮腺肌癥。陳勇等[14]的研究顯示與非子宮內(nèi)膜異位癥患者比較，子宮內(nèi)膜異位癥患者的血清和異位的子宮內(nèi)膜組織中FABP4表達(dá)水平均上升，并且血清FABP4水平與子宮內(nèi)膜異位癥分期和血清CA125水平密切相關(guān)，證實(shí)FABP4在子宮內(nèi)膜異位癥中發(fā)揮重要作用。有研究[13]認(rèn)為子宮內(nèi)膜細(xì)胞中FABP4的表達(dá)含量與機(jī)體雌、孕激素水平有關(guān)。本研究結(jié)果表明高脂飲食組小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶FABP4蛋白的陽(yáng)性表達(dá)高于普食組小鼠，提示高脂飲食促進(jìn)小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶組織FABP4的表達(dá)，從而促進(jìn)小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶的生長(zhǎng)。

有報(bào)道[15]指出，PPARγ是FABP4的一個(gè)靶基因，F(xiàn)ABP4可以負(fù)反饋調(diào)節(jié)PPARγ水平。PPARγ能夠負(fù)反饋調(diào)節(jié)NF-κB活性[16]。NF-κB是子宮內(nèi)膜異位癥的重要轉(zhuǎn)錄因子，可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞增殖[17]。子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)展依賴于NF-κB的激活，NF-κB參與異位的子宮內(nèi)膜細(xì)胞增殖活化、遷移侵襲、血管生成等多種病理生理過(guò)程[18]；并且激活NF-κB可誘導(dǎo)多種炎性因子、抗細(xì)胞凋亡因子等的釋放[19]，參與子宮內(nèi)膜異位病灶組織形成過(guò)程中發(fā)生的炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展[20]。本研究結(jié)果也顯示與普食組小鼠比較，高脂飲食組小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶組織PPARγ蛋白降低，NF-κB蛋白升高，高脂飲食組小鼠體內(nèi)炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平升高，表明高脂飲食可促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥小鼠FABP4的表達(dá)，并可能通過(guò)抑制PPARγ的表達(dá)和激活NF-κB的表達(dá)促使炎癥的產(chǎn)生，從而促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)展。

綜上所述，高脂飲食能通過(guò)促進(jìn)小鼠子宮內(nèi)膜異位病灶組織FABP4蛋白的表達(dá)，從而進(jìn)一步促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)展，其機(jī)制可能與抑制PPARγ表達(dá)和激活NF-κB有關(guān)。