解麗娟，肖 蕾，伍善東，程 偉

（湖南省微生物研究院，湖南 長沙 410009）

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是廣泛存在于自然界的一種非致病細(xì)菌。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，該菌抗菌譜廣，對鐮刀菌（Fusariumspp.）、桃褐腐病菌（Monilinia fructicola）、灰霉病菌（Botrytis cinereaPers.）、棉花黃萎病菌（Verticillium dahliaeKleb）、番茄葉霉病菌（Fulvia fulva）、番茄枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.lycopersici）均有較強(qiáng)的抑制作用[1-4]，還可以分泌一些植物激素類物質(zhì)，促進(jìn)植物生長[5]。以該菌為資源進(jìn)行生物防治具有對環(huán)境友好、對人畜毒害小、對植物副作用小等優(yōu)點(diǎn)，越來越受到人們的重視。

課題組前期從油菜植株內(nèi)分離到一株內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌L-4-3（菌株保藏號為CCTCC NO：M2014320）。杯碟法對峙試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)中均證明該菌株對油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）有很強(qiáng)的拮抗作用，同時(shí)還具有溶磷解鉀的能力。因此，筆者認(rèn)為該菌株有望開發(fā)成植物病害生防制劑，用于油菜菌核病的生物防治。為了進(jìn)一步提高L-4-3 菌株的發(fā)酵水平，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化了該菌株的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件，以期為該生防菌株的產(chǎn)業(yè)化利用提供支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與培養(yǎng)基

供試菌為內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌L-4-3，菌株保藏號為CCTCC NO：M2014320，由筆者所在課題組篩選?；A(chǔ)培養(yǎng)基：淀粉20.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、牛肉膏4.0 g/L、KH2PO41.0 g/L、NaCl 5.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.1 g/L，pH 值7.0。

1.2 試劑與儀器

試驗(yàn)所用生化試劑均為國產(chǎn)分析純，淀粉、黃豆粉等原料購自超市。20 L、50 L 全自動發(fā)酵罐（BIOTECH-20JS、BIOTECH-50JS）購自上海保興生物設(shè)備工程有限公司。

1.3 解淀粉芽孢桿菌L-4-3 培養(yǎng)基成分的篩選

1.3.1 種子液的制備將活化后的L-4-3 菌株接種于裝有50 mL LB 液體培養(yǎng)基的500 mL 三角瓶中，在30℃、180 r/min 的條件下振蕩培養(yǎng)20 h。

1.3.2 培養(yǎng)基成分的篩選通過單因素試驗(yàn)篩選適合菌株的最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽，再用正交試驗(yàn)法確定碳源、氮源的最佳添加量[6]。（1）碳源的篩選。分別以含量為20 g/L 的淀粉、乳糖、葡萄糖、甘露醇和蔗糖替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源，500 mL 三角瓶中裝液量為100 mL，每個(gè)搖瓶中接入5 mL 種子液，于30℃、180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)48 h；采用平皿菌落計(jì)數(shù)法測定發(fā)酵液中的活菌數(shù)，以菌液濃度為考察指標(biāo)確定最優(yōu)處理。（2）氮源的篩選。分別以含量為20 g/L 的黃豆粉、酵母粉、魚粉、蛋白胨、胰蛋白胨、硫酸銨替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源，其他條件和考察方法同上。（3）碳源、氮源的最適添加量確定。以最優(yōu)碳源、氮源進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定各組分的最佳添加量，其他條件和考察方法同上。（4）無機(jī)鹽的篩選。分別添加1 g/L 的KH2PO4、MgSO4·7H2O、KCl、NaCl、鉀長石替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽，其他條件和考察方法同上。（5）無機(jī)鹽的最適添加量。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 g/L的KH2PO4和NaCl 以 及0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/L 的MgSO4·7H2O，其他條件和考察方法同上。

1.4 解淀粉芽孢桿菌L-4-3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

以優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化。培養(yǎng)溫度設(shè)置為20、24、28、32、36℃[7]，培養(yǎng)時(shí)間設(shè)置為44、48、52、56、60、64、68、72 h，初 始pH 值 設(shè)置為6.0、6.4、6.8、7.2、7.6、8.0、8.4，轉(zhuǎn)速設(shè)置為90、120、150、180、210 r/min，接種量設(shè)置為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%，500 mL 三角瓶裝液量設(shè)置為40、60、80、100、120、140 mL，其他條件和考察方法同上。

1.5 50 L 發(fā)酵罐驗(yàn)證試驗(yàn)

采用優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行50 L發(fā)酵罐試驗(yàn)，采用平皿菌落計(jì)數(shù)法測定發(fā)酵液中的活菌數(shù)量，以菌液濃度為最終衡量指標(biāo)。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3 次取平均值，采用Excel 2007 軟件和SPSS 25 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌L-4-3 培養(yǎng)基成分的篩選

2.1.1 最佳碳源、氮源的篩選從圖1 可知，當(dāng)以甘露醇為碳源時(shí)，菌液濃度達(dá)到最大值，為9.3×108CFU/mL；以乳糖為碳源時(shí)，發(fā)酵液中的活菌數(shù)最少，為2.9×108CFU/mL，以淀粉為碳源時(shí)，菌液濃度為5.1×108CFU/mL。由圖2 可知，以酵母粉為唯一氮源時(shí)，菌液濃度達(dá)到最大值，為9.7×108CFU/mL，其余氮源處理的菌液濃度由高到低排列依次為胰蛋白胨＞蛋白胨＞黃豆粉＞魚粉＞硫酸銨。綜合考慮成本因素，甘露醇和淀粉、酵母粉和黃豆粉可分別作為最佳碳源、氮源進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖1 不同碳源處理發(fā)酵液中的菌液濃度

2.1.2 碳源、氮源最適添加量的確定根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，適宜碳源為甘露醇和淀粉，適宜氮源為酵母粉和黃豆粉。為了確定各組分的最佳添加量，以這4種物質(zhì)為因素、以其添加量為水平設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn)，詳見表1。通過均值和極差分析發(fā)現(xiàn)，各因素對L-4-3 菌株發(fā)酵液活菌數(shù)的影響由大到小排列依次為甘露醇＞酵母粉＞淀粉＞黃豆粉。培養(yǎng)基碳源、氮源成分及含量的最優(yōu)組合為A1B2C3D3，即黃豆粉1.0 g/L、淀粉20.0 g/L、酵母粉2.0 g/L、甘露醇10.0 g/L。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.1.3 無機(jī)鹽的篩選由圖3 可知，添加KH2PO4、NaCl、MgSO4·7H2O 的處理菌液濃度基本相當(dāng)，其中添加MgSO4·7H2O 的處理，菌液濃度最高，為6.6×108CFU/mL。后續(xù)試驗(yàn)中選擇KH2PO4、NaCl 和MgSO4·7H2O 作為培養(yǎng)基的無機(jī)鹽成分。

圖3 添加不同無機(jī)鹽發(fā)酵液的菌液濃度

2.1.4 無機(jī)鹽最適添加量的確定由圖4 可知，隨著KH2PO4添加量的增加，菌液濃度呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)添加量為4.0 g/L 時(shí)，菌液濃度達(dá)最大值為5.9×108CFU/mL。由圖5 可知，隨著NaCl 添加量的增加，菌液濃度也隨之增加，當(dāng)添加量為4.0 g/L 時(shí)，菌液濃度達(dá)最大值，為9.1×108CFU/mL，當(dāng)添加量為5.0 g/L 時(shí)，菌液濃度反而降低。由圖6 可知，隨著MgSO4·7H2O 添加量的增加，菌液濃度呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)添加量為3.0 g/L 時(shí)，菌液濃度達(dá)最大值，為10.8×108CFU/mL。因此，最終確定培養(yǎng)基中無機(jī)鹽的最適添加量為KH2PO44.0 g/L、NaCl 4.0 g/L、MgSO4·7H2O 3.0 g/L。

圖4 添加不同量的KH2PO4 對菌液濃度的影響

圖5 添加不同量的NaCl 對菌液濃度的影響

圖6 添加不同量的MgSO4·7H2O 對菌液濃度的影響

2.2 解淀粉芽孢桿菌L-4-3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 初始pH值 由圖7 可知，當(dāng)培養(yǎng)基的初始pH值為6.0～7.2 時(shí)，發(fā)酵結(jié)束菌液濃度的變化不明顯；當(dāng)初始pH 值為8.4 時(shí)，其菌液濃度最低，為3.4×108CFU/mL；初始pH 值為7.2 時(shí)，其菌液濃度最高，為7.1×108CFU/mL。因此，確定菌株L-4-3 的最適初始pH 值為7.2。

圖7 初始pH 值對發(fā)酵液的菌液濃度的影響

2.2.2 裝液量由圖8 可知，當(dāng)500 mL 的三角瓶裝液量為40 mL 時(shí)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌液濃度最高，為19.4×108CFU/mL，隨著裝液量的增加，菌液濃度逐漸降低。因此，確定菌株L-4-3 發(fā)酵培養(yǎng)的最佳裝液量為40 mL/500 mL 三角瓶，即裝液量8%。

圖8 裝液量對發(fā)酵液的菌液濃度的影響

2.2.3 接種量由圖9 可知，當(dāng)接種量為2.0 %時(shí)，菌液濃度達(dá)最大值，為12.8×108CFU/mL；繼續(xù)增加接種量，菌液濃度反而降低。因此，確定菌株L-4-3發(fā)酵培養(yǎng)的最適接種量為2.0 %。

圖9 接種量對發(fā)酵液的菌液濃度的影響

2.2.4 培養(yǎng)溫度由圖10 可知，隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌株L-4-3 發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌液濃度逐漸增加，當(dāng)培養(yǎng)溫度為32℃時(shí)，菌液濃度達(dá)到最大值，為20.1×108CFU/mL，隨后，培養(yǎng)溫度繼續(xù)升高，菌液濃度逐漸變小。因此，確定菌株L-4-3 的最適培養(yǎng)溫度為32℃。

圖10 培養(yǎng)溫度對發(fā)酵液的菌液濃度的影響

2.2.5 轉(zhuǎn)速 由圖11 可知，隨著轉(zhuǎn)速的增加，菌液濃度先升高后降低；當(dāng)轉(zhuǎn)速為180 r/min 時(shí)，菌液濃度達(dá)最大值，為10.1×108CFU/mL。因此，確定菌株L-4-3 的最適轉(zhuǎn)速為180 r/min。

圖11 轉(zhuǎn)速對發(fā)酵液的菌液濃度的影響

2.2.6 培養(yǎng)時(shí)間由圖12 可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，發(fā)酵結(jié)束時(shí)菌液濃度呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為68 h 時(shí)，其菌液濃度為最高，達(dá)到17.0×108CFU/mL；繼續(xù)增加培養(yǎng)時(shí)間，菌液濃度有所降低。因此，確定菌株L-4-3 的最適培養(yǎng)時(shí)間為68 h。

圖12 培養(yǎng)時(shí)間對發(fā)酵液的菌液濃度的影響

綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，菌株L-4-3 發(fā)酵培養(yǎng)的最佳條件為初始pH 值7.2，裝液量8%，接種量2.0 %，溫度32℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)時(shí)間68 h。

2.3 L-4-3 菌株50 L 發(fā)酵罐驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

采用最適培養(yǎng)基配方即甘露醇10.0 g/L、淀粉20.0 g/L、酵母粉2.0 g/L、黃豆粉1.0 g/L、KH2PO44.0 g/L、NaCl 4.0 g/L、MgSO4·7H2O 3.0 g/L，最適培養(yǎng)條件即初始pH 值7.2、裝液量8%、接種量2.0 %、溫度32℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、培養(yǎng)時(shí)間68 h，發(fā)酵結(jié)束采用平皿菌落計(jì)數(shù)法測定發(fā)酵液中的活菌數(shù)為20.8×108CFU/mL。

3 討論與結(jié)論

近年來，微生物菌劑成為植保領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，關(guān)于解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化的研究報(bào)道較多[8-10]。在生產(chǎn)應(yīng)用中，有效活菌數(shù)是影響微生物菌劑的關(guān)鍵因素。因此，優(yōu)化菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)條件，提高發(fā)酵液中的活菌數(shù)是研發(fā)生防微生物菌劑的關(guān)鍵所在[2]。

該研究從培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件2 個(gè)方面對內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌L-4-3 的發(fā)酵水平進(jìn)行了研究，碳源、氮源對L-4-3 菌株菌液濃度的影響依次為甘露醇＞酵母粉＞淀粉＞黃豆粉，碳源、氮源最優(yōu)配比為甘露醇10.0 g/L、淀粉20.0 g/L、酵母粉2.0 g/L、黃豆粉1.0 g/L，無機(jī)鹽最適添加量為KH2PO44.0 g/L、NaCl 4.0 g/L、MgSO4·7H2O 3.0 g/L。搖瓶發(fā)酵最適培養(yǎng)條件為初始pH 值7.2、裝液量8%（500 mL 三角瓶裝液40 mL）、接種量2.0 %、溫度32℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、培養(yǎng)時(shí)間68 h。以優(yōu)化后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行50 L 發(fā)酵罐驗(yàn)證，發(fā)酵液中活菌數(shù)為20.8×108CFU/mL。