李 霞，黃東萍，王仕寶 ，趙苗苗，李崇勇，何志鵬，崔艷麗

（1.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)林技術(shù)與生物工程學(xué)院，陜西 漢中 723000；2.漢中食品藥品檢驗檢測中心，陜西漢中 723000；3.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 漢中 723000；4.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院 秦巴山區(qū)藥（食）用植物研究所，陜西 漢中 723000；5.陜西國際商貿(mào)學(xué)院 醫(yī)藥學(xué)院，陜西 西安 712046；6.漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院 基礎(chǔ)課教學(xué)部；陜西 漢中 723000）

紅茴香（Illicium henryi Diels）來源于木蘭科八角屬，又名紅毒茴，是中國特有植物；生于海拔300～2200 m的丘陵或山地溝谷、溪邊濕潤常綠闊葉林中或林緣[1]，主產(chǎn)于陜西、甘肅、云南、廣西等地。在中藥資源普查中發(fā)現(xiàn)，紅茴香在陜南區(qū)域分布廣泛，在民間通常替代八角茴香作為調(diào)味品食用。

莽草酸（shikimic acid，簡稱SA），作為一種芳香族中間代謝產(chǎn)物，是合成抗癌藥物和甲型H1N1流感病毒藥物奧司他韋的前體原料[2-3]。莽草酸有較強的生物活性，作用機制體現(xiàn)在影響花生四烯酸代謝，抑制血小板聚集和腦血栓形成；還有抗炎、鎮(zhèn)痛作用[4-5]。莽草酸在木蘭科八角屬植物的果實等部位中廣泛分布，因此，八角果實中莽草酸的提取分離、含量檢測等方面文獻報道較多，但在其它部位中莽草酸檢測和資源開發(fā)利用研究相對較少?；诘谒拇稳珖兴庂Y源普查和傳統(tǒng)知識調(diào)查，在陜南巴山地區(qū)，野生紅茴香分布較廣，但資源的開發(fā)利用相對單一，僅將紅茴香果實作為調(diào)味品自采自用，其他部位如葉子、皮類等資源均未充分利用。本文主要探究HPLC測定紅茴香不同部位中莽草酸含量，并與市購食用八角的不同部位中莽草酸含量進行比較分析，結(jié)合15批不同來源樣品構(gòu)建中藥指紋圖譜，針對莽草酸含量進行比較分析和相似度評價，得出樣品中莽草酸含量差異性變化，從而為該區(qū)域紅茴香資源的開發(fā)利用提供一定參考。

1 儀器、材料與試藥

高效液相色譜儀（島津LC-20AT），輸液泵（LC-20AT），二極管陣列檢測器（SPD-M20A）；超聲波清洗器（KQ-800E）；粉碎機（HL-500A型高速多功能粉碎機）；電子天平（MS105DU，d=0.01 mg，梅特勒-托利多）等。

莽草酸對照品：購于北京華工科創(chuàng)生物技術(shù)有限公司（批號：AF8102671，純度：98 %）。試驗材料野生紅茴香于2020年6月～10月采自陜西寧強、南鄭和鎮(zhèn)巴，經(jīng)漢中職業(yè)技術(shù)學(xué)院秦巴山區(qū)（食）藥用研究所王仕寶副教授鑒定為木蘭科植物紅茴香 Illicium henryi Diels，自然干燥后保存?zhèn)溆谩０私遣牧腺徲跐h中農(nóng)用市場，總計3批；在試驗前對其中一批按照果殼、籽、果柄進行分類備用。方法學(xué)考察采用編號為HHX03的樣品，樣品編號信息見表2。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hedera NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（用磷酸調(diào)pH值3.5）（40:60）；流速：1 ml/min；檢測波長：210 nm；進樣量：20.0 μl。在該條件下，對照品與樣品的色譜圖見圖1（A、B）。

圖1 紅茴香對照品與樣品色譜圖

2.2 溶液制備

對照品貯備液：取莽草酸對照品適量，精密稱定，置入50 ml量瓶，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻作為對照品貯備液（質(zhì)量濃度：560.56 μg/ml）。

供試品溶液的制備：取干燥后的紅茴香果實、果殼（不含籽）、葉、皮及八角果實，依次粉碎，過2號篩，取0.25 g精密稱定，置入100 ml量瓶，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液分別作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 粉碎粒度考察 取供試品（HHX03）粉碎后分別過1號篩（10目），2號篩（24目），3號篩（50目），4號篩（65目）。比較不同過篩粒度，結(jié)果表明，粉碎粒度為過2號篩較適宜。

2.3.2 提取溶劑考察 供試品（HHX03）粉碎后過2號篩，分別用50 %乙醇、95 %乙醇、50 %甲醇、甲醇、水溶液為溶劑進行超聲提取。比較不同的提取溶劑的提取得率，結(jié)果表明，提取溶劑以甲醇較適宜。

2.3.3 提取時間考察 供試品（HHX06）粉碎后過2號篩，以甲醇為提取劑，分別采用超聲10，20，30，40 min提取，計算莽草酸得率。結(jié)果表明，超聲30 min較適宜。

2.3.4 線性范圍考察 線性范圍考察 精密量取對照品貯備液0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 ml，分別置入50 ml量瓶，用甲醇稀釋至刻度并搖勻，制成濃度分別為5.61，11.21，22.42，56.06，112.11 μg/ml的溶液，及濃度為560.56 μg/ml 的對照品貯備液，作為系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別注入液相色譜儀，測定峰面積，以莽草酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，以峰面積值為縱坐標(biāo)Y，得回歸方程Y=50 943.4X-27 400.6，r=0.9997。結(jié)果表明：莽草酸進樣量在5.61～560.56 μg/ml與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.5 精密度試驗 分別制備供試品（HHX03）6份，按照2.2項方法制備供試品溶液，每次進樣量20.0 μl，根據(jù)峰面積計算含量，其RSD=1.6 %，表明方法具有較好的重復(fù)性。

2.3.6 供試品溶液穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于 0，6，12，24，48 h進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果峰面積RSD=0.8 %，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 加樣回收率試驗 分別精密稱取6份已知含量的供試品（HHX03）適量，精密加入對照品貯備液適量，按2.2項方法制備供試品溶液，測定并計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率（n=6）

2.4 樣品含量測定

收集的15批樣品分別依2.2項下方法制備供試品溶液，每次進樣量20.0 μl，計算含量，樣品各成份的含量見表2。

表2 樣品信息及含量測定值

2.5 中藥指紋圖譜相似度評價

參照文獻，將15批樣品的HPLC指紋圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012 A版），分別對各批次樣品指紋圖譜進行匹配，得出相應(yīng)的對照圖譜，以生成的對照圖譜（R）為對照，通過設(shè)參照圖譜、多點校正、自動匹配和采用中位數(shù)計算相似度，范圍在0.048～0.999之間，結(jié)果表明，15批樣品莽草酸含量差異較大。所有樣品和對照品HPLC指紋圖譜分別見圖2和圖3。

圖2 15批樣品HPLC指紋圖譜

圖3 對照品HPLC指紋圖譜

表3 樣品相似度數(shù)據(jù)

3 討論

3.1 結(jié)合文獻[6-7]及中國植物志[8]發(fā)現(xiàn)，紅茴香和紅毒茴是兩個不同的種類，紅茴香Illicium henryi Diels又稱紅毒茴、披針葉茴香、莽草（古名）等；紅毒茴 Illicium lanceolatum A.C.Smith.又稱紅茴香、披針葉茴香、莽草等。另外，八角屬（Illicium）植物部分種類具有藥用價值[9]。八角屬植物中的莽草酸，具有抗病毒、抗腫瘤和對心血管系統(tǒng)的作用[10]，還可作為組織再生劑，促進傷口愈合和增強真皮重建作用[11]。本文針對15批樣品進行分析，根據(jù)莽草酸含量檢測比較：果殼（不含籽）＞果實（含籽）＞葉＞莖皮。分析原因，主要與紅茴香不同部位、不同產(chǎn)地和不同采收樣品的時間有關(guān)。此外，以八角為研究材料，得出莽草酸含量其果殼（不含籽）＞果柄＞籽。但是，從比較野生的紅茴香和栽培八角的不同基原進行，同一部位果實（含籽）中莽草酸含量檢測結(jié)果，得出紅茴香（117.17，113.26，96.14 mg/g）＞八角茴香（90.03，73.57，68.69 mg/g）。最后，由于本次收集樣品較少，故以上數(shù)據(jù)不能完全反映不同部位中莽草酸含量高低，因此有待今后對紅茴香不同部位、不同季節(jié)中莽草酸累計含量值進行詳細研究。

3.2 藥材中有效成分的提取方法多樣，本研究紅茴香樣品（葉子、果實、果殼、葉、莖皮）在前期試驗中探究了回流、超聲、浸漬、微波輔助和索氏提取等方法，通過比較紅茴香葉中莽草酸提取得率，選擇了超聲提取方法較為適宜。另據(jù)文獻報道[12]，用二極管陣列檢測器在一定條件下，分析了莽草酸對照品色譜峰及樣品中目標(biāo)組分對應(yīng)色譜峰的紫外光譜，確定莽草酸在210 nm處有最大吸收。因此，本研究考慮選擇210 nm作為檢測波長，既可對目標(biāo)成分進行準(zhǔn)確分析又可將相關(guān)物質(zhì)有效檢出。結(jié)合流動相優(yōu)化，確定乙腈-水（用磷酸調(diào)pH值3.5）（40:60），色譜峰分離較好，拖尾現(xiàn)象較少。

3.3 中藥指紋圖譜作為中藥質(zhì)量領(lǐng)域的一種常用手段，具有一定優(yōu)點，可全面評價中藥的化學(xué)成分和藥品質(zhì)量，為中藥多指標(biāo)質(zhì)量評價提供新的思路。依據(jù)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012 A版），按照檢測結(jié)果的HPLC圖譜，通過標(biāo)定共有的特征峰，同時結(jié)合參照圖譜、多點校正、自動匹配和采用中位數(shù)計算相似度，最后構(gòu)建所有樣品的HPLC指紋圖譜[13-14]。本研究結(jié)果表明，15批樣品中莽草酸含量差異很大。另外，八角果實不同部位（帶籽果實、果殼、籽和果柄）含量為41.36～92.73 mg/g。以上結(jié)果可為紅茴香和八角果實的不同部位進行莽草酸含量測定和質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。