陳 昊

（南陽(yáng)市第二人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河南南陽(yáng) 473000）

膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，在神經(jīng)外科較為常見(jiàn)，對(duì)患者生活質(zhì)量及生存等影響均較大，近年研究顯示其發(fā)生率呈升高趨勢(shì)[1,2]。miRNA是近年發(fā)現(xiàn)的與腫瘤形成有關(guān)的重要因子[3]，主要通過(guò)調(diào)控下游靶基因發(fā)揮作用[4,5]。我們應(yīng)用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)膠質(zhì)瘤中異常表達(dá)的miRNAs進(jìn)行篩選，選擇與膠質(zhì)瘤關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的miR-155-5p進(jìn)行研究，應(yīng)用TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)行靶向關(guān)系預(yù)測(cè)，選擇與凋亡關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Caspase-3）和B細(xì)胞淋巴瘤蛋白-2（Bcl-2）作為靶基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過(guò)前瞻性實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，探討miR-155-5p在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)意義，分析其與凋亡因子的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2016年1月～2017年1月在南陽(yáng)市第二人民醫(yī)院確診為膠質(zhì)瘤并行手術(shù)治療的47例患者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均有病理診斷，并符合WHO中關(guān)于膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)；（2）首次確診并手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤復(fù)發(fā)患者；（2）術(shù)前行針對(duì)腫瘤的放、化療；（3）病理診斷不明確者；（4）近3個(gè)月有感染病史及治療者；（5）伴有免疫系統(tǒng)疾病史。共觀察47例，其中男26例，女21例，年齡35～80歲，平均59.61±9.32歲。留取術(shù)后新鮮組織（-80℃凍存）和石蠟包埋組織。研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 qPCR法檢測(cè)miR-155-5p 的表達(dá) 檢測(cè)新鮮標(biāo)本中miR-155-5p的表達(dá)，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）法完成。首先使用TRIzol（美國(guó)ABI）提取總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA，引物由上海召遠(yuǎn)公司合成，其它主要相關(guān)試劑購(gòu)自北京百泰克公司。miR-155-5p引物上游：5＇-AAATATACTGATGCGCGGACGAA-3＇，下游：5＇-TCAAAAAACATACTGGCACCT-3＇。以U6為內(nèi)參[6]，上游：5＇-GGAACAACCAGAGAAAGATTAGC-3＇下游：5＇-TTGGAATTCACAGAATTCCG-3＇。擴(kuò)增程序設(shè)定：95℃10 min，95℃ 25s，64℃ 20s，72℃ 20s，10個(gè)循環(huán)；93℃25s，60℃ 35s，72℃ 20s，35個(gè)循環(huán)后，延伸。60℃采集信號(hào)，記錄Ct值，以2-ΔΔCt表示結(jié)果。

1.2.2 Western blot法檢測(cè)Caspase-3的表達(dá) 基于新鮮標(biāo)本應(yīng)用Western blot法檢測(cè)Caspase-3（為濃縮液，購(gòu)自北京中杉金橋公司，稀釋濃度1：3000）的表達(dá)，內(nèi)參為β-Actin（為濃縮液，購(gòu)自北京中杉金橋公司，稀釋濃度，1：2000）。按實(shí)驗(yàn)說(shuō)明書(shū)操作，均由同一技術(shù)人員完成。以Caspase-3與β-Actin的比值作為定量結(jié)果，應(yīng)用Image J軟件分析。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)Bcl-2的表達(dá) 基于石蠟包埋標(biāo)本檢測(cè)膠質(zhì)瘤中Bcl-2的表達(dá)，應(yīng)用免疫組化（二步法）法完成。設(shè)陽(yáng)性對(duì)照（濾泡性淋巴瘤的病理組織為陽(yáng)性對(duì)照）。Bcl-2工作液購(gòu)自北京中杉金橋公司，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)操作，并由同一技師完成操作。Bcl-2的陽(yáng)性部位是細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞膜，選擇5個(gè)熱點(diǎn)區(qū)（400倍）進(jìn)行計(jì)數(shù)，由病理科醫(yī)師應(yīng)用盲法完成，計(jì)算陽(yáng)性率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行分析，兩組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn)或卡方檢驗(yàn)，應(yīng)用Pearson相關(guān)分析及K-M生存分析，以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膠質(zhì)瘤不同臨床病理特征中miR-155-5p表達(dá)的比較

膠質(zhì)瘤中miR-155-5p表達(dá)范圍是0.98～1.99，平均1.46±0.42。miR-155-5p在不同腫瘤最大徑和不同WHO分級(jí)分組的表達(dá)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而在不同性別、不同年齡分組中的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1、圖1。

表1 膠質(zhì)瘤不同臨床病理特征中miR-155-5p表達(dá)的比較

圖1 miR-155-5p表達(dá)的擴(kuò)增曲線（qPCR法）

2.2 miR-155-5p 與預(yù)后的關(guān)系

應(yīng)用電話、門診或家訪的方式對(duì)患者術(shù)后5年（60月）的生存情況進(jìn)行隨訪，截止時(shí)間點(diǎn)為2022年1月31日。術(shù)后患者生存時(shí)間為9～60個(gè)月，中位生存時(shí)間為45個(gè)月。存活26例，死亡19例（其中1例因車禍死亡，計(jì)為刪失值），失訪1例（計(jì)為刪失值）。K-M生存分析顯示miR-155-5p的表達(dá)與生存時(shí)間相關(guān)（χ2=3.64，P=0.024）。見(jiàn)表2、圖2。

表2 膠質(zhì)瘤不同預(yù)后患者miR-155-5p表達(dá)的比較

圖2 miR-155-5p與預(yù)后的關(guān)系

2.3 miR-155-5p 與Caspase-3的相關(guān)性

Western blot法顯示Caspase-3表達(dá)范圍為0.60～3.81，平均2.81±0.41。相關(guān)分析顯示miR-155-5p 與Caspase-3呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.65，P=0.019）。見(jiàn)圖3、4。

圖3 膠質(zhì)瘤中Caspase-3的表達(dá)(Western blot法)

圖4 miR-155-5p 與Caspase-3的相關(guān)性

2.4 miR-155-5p 與Bcl-2的相關(guān)性

免疫組化方法顯示Bcl-2陽(yáng)性率范圍為1%～80%，平均19.1%。相關(guān)分析顯示miR-155-5p與Bcl-2呈正相關(guān)性（r=0.64，P=0.008）。見(jiàn)圖5、6。

圖5 膠質(zhì)瘤中Bcl-2的表達(dá)（免疫組化二步法）

圖6 miR-155-5p 與Bcl-2的相關(guān)性

3 討論

膠質(zhì)瘤與機(jī)體其它部位發(fā)生的上皮性腫瘤在病變形態(tài)、生物學(xué)行為和預(yù)后方面均不同，病變形成時(shí)，遺傳因素、DNA和RNA均可出現(xiàn)異常[7]。膠質(zhì)瘤進(jìn)展過(guò)程主要為侵襲性生長(zhǎng)，表現(xiàn)為直接侵襲和血行轉(zhuǎn)移，病因涉及多種分子生物學(xué)通路[8]。miRNAs表達(dá)失調(diào)是膠質(zhì)瘤重要的分子進(jìn)展因素[9]。miR-155-5p是在基因庫(kù)中篩選出來(lái)的，主要與膠質(zhì)瘤形成的分子通路有關(guān)，如cAMP/PKA和WNT通路等[10,11]。miR-155-5p對(duì)腫瘤調(diào)節(jié)過(guò)程與腫瘤進(jìn)展有關(guān)，其可出現(xiàn)在腫瘤組織中，也可在血液中高表達(dá)，敏感程度較強(qiáng)。miR-155-5p具有癌基因樣的作用，可使細(xì)胞的失控性增殖明顯，并對(duì)下游的增殖因子和凋亡因子有明確的調(diào)控作用。曾慶等[12]通過(guò)觀察miR-155-5p在宮頸癌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)上調(diào)，與腫瘤的生物學(xué)行為密切相關(guān)，同時(shí)可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖過(guò)程。同樣，有學(xué)者在腎癌和乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了miR-155-5p的異常表達(dá)對(duì)腫瘤的促進(jìn)作用，并認(rèn)為其可能與腫瘤的預(yù)后有關(guān)[13-15]。

本研究應(yīng)用膠質(zhì)瘤術(shù)后的組織標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤中miR-155-5p的表達(dá)范圍為0.98～1.99，平均1.46±0.42，具有一定的表達(dá)量，即miR-155-5p高表達(dá)是腫瘤形成的重要分子事件。miR-155-5p在不同腫瘤最大徑、不同WHO分級(jí)分組的表達(dá)中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示miR-155-5p高表達(dá)參與腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展過(guò)程。miR-155-5p參與腫瘤生長(zhǎng)是通過(guò)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和抑制凋亡實(shí)現(xiàn)的，其對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和基質(zhì)金屬蛋白酶等具有調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和局部侵襲[16]。miR-155-5p還能對(duì)S100B和NF等進(jìn)行調(diào)控，但其具體機(jī)制有待更多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本研究結(jié)果顯示，miR-155-5p的表達(dá)與患者術(shù)后的生存時(shí)間有關(guān)，提示miR-155-5p對(duì)判斷腫瘤的預(yù)后有重要價(jià)值。miR-155-5p下游的主要調(diào)控因子為凋亡因子，可能與P27的調(diào)節(jié)通路有關(guān)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)的miR-155-5p與Caspase-3、Bcl-2的關(guān)系也證實(shí)了miR-155-5p對(duì)凋亡的調(diào)節(jié)作用。凋亡途徑中，Caspase-3是中心調(diào)節(jié)通路，可以激活BAX等途徑，這也是miR-155-5p作用的主要途徑之一[18,19]。miR-155-5p還能調(diào)節(jié)P53誘導(dǎo)的核因子表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖。Fu等[20]通過(guò)在肝細(xì)胞癌中觀察miR-155-5p的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-155-5p通過(guò)PI3K/Ak途徑抑制PTEN的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞增生活躍、細(xì)胞生長(zhǎng)迅速、腫瘤體積增大。miR-155-5p可以加速G0/G1期的轉(zhuǎn)化，使G2/M期細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞增殖加速。但是，miR-155-5p對(duì)凋亡的具體調(diào)控及通路需要體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。研究中發(fā)現(xiàn)miR-155-5p對(duì)預(yù)后判斷有價(jià)值，提示其可能是預(yù)后因子，但尚需在后續(xù)研究中進(jìn)行多中心、大樣本的驗(yàn)證來(lái)進(jìn)一步明確。miR-155-5p作為預(yù)后因子的作用在臨床中可能具有重要價(jià)值，可以更客觀用指標(biāo)來(lái)進(jìn)一步規(guī)范評(píng)價(jià)。

總之，miR-155-5p在膠質(zhì)瘤中表達(dá)升高，參與病變的形成和進(jìn)展，其異常表達(dá)對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡有一定作用，提示miR-155-5p可能是膠質(zhì)瘤的預(yù)后因子。