馬曉莉,郝春芳,郭東更,吳麗麗,張明珠,楊亞珊，陳坤婷，張英強(qiáng)，徐天宇，殷 喆，郭江濤

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種結(jié)締組織病，屬于免疫性疾病(AID)，其主要病理特征為關(guān)節(jié)炎癥、滑膜炎，并且伴有機(jī)體內(nèi)多系統(tǒng)的免疫炎癥反應(yīng)[1]。研究表明，腸道微生物的功能變化和構(gòu)成與自身免疫性疾病存在緊密聯(lián)系，可能與RA疾病密切相關(guān)，其機(jī)理是腸道微生物及其代謝產(chǎn)物通過對機(jī)體免疫功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，進(jìn)而影響自身免疫病的發(fā)生發(fā)展[2]。人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)維持離不開宿主免疫系統(tǒng)同微生物群之間的相互作用[3]。本研究借助高通量測序技術(shù)探究初發(fā)RA患者和健康人群體內(nèi)腸道菌群的組成特點(diǎn)與差異，深入分析RA的腸道菌群特征，從而為RA的預(yù)防與治療提供新的途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選擇2020年8月至2021年10月寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院住院的30例初發(fā)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者為RA組(RA組)，男9例，女21例，年齡28～71歲，平均年齡(52±10)歲。隨機(jī)選擇同期健康體檢人員30名為健康對照組(HC組)，男10例，女20例；年齡21～65歲，平均年齡(45±15)歲。2組年齡、性別等方面對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (P>0.05)，具有可比性。

1.2 診斷、排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)與美國風(fēng)濕病學(xué)會和歐洲風(fēng)濕病防治聯(lián)合會2010年確立的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)相符[4]。(2)排除條件：①患有嚴(yán)重的心、腎、內(nèi)分泌、消化、血液系統(tǒng)疾病者；②患有結(jié)締組織病(CTD)、干燥綜合征(SS)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、強(qiáng)直性脊柱炎(AS)等自身免疫病或影響免疫功能的其他疾病者。③既往接受過抗風(fēng)濕治療的患者；④曾使用激素治療的患者；⑤近3個月內(nèi)使用過抗生素的患者；⑥曾接受胃腸動力藥治療的患者；⑦有胃腸炎病史的患者。

1.3 方法

1.3.1 腸道微生物群落的基因組學(xué)研究

1.3.1.1 糞便樣本的采集：按標(biāo)準(zhǔn)采集流程使用配套的糞便套裝收集患者清晨中間段新鮮糞便標(biāo)本約200 mg，常溫保持運(yùn)輸，3日內(nèi)進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.3.1.2 總DNA提取：采用QUBIT RNA HSAssay Kit、QUBIT dsDNA HS Kit試劑盒及QIAsymphony SP 核酸自動提取儀、Qubit 3.0核酸定量儀提取糞便細(xì)菌基因組總DNA，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.3.1.3 基因組測序：應(yīng)用ION TORRENT平臺技術(shù)、Ion PGM基因組測序儀對細(xì)菌16 S rDNA V2、V3、V4、V6、V7、V8、V9可變區(qū)進(jìn)行靶向高通量測序并構(gòu)建文庫。按照樣品準(zhǔn)備、擴(kuò)增16S高變區(qū)及純化、測定文庫濃度、末端修復(fù)及純化、連接接頭及純化、擴(kuò)增文庫及純化、測定文庫濃度順序進(jìn)行，對篩選所得有效序列開展除雜，獲得優(yōu)化序列。

1.3.1.4 菌群多樣性分析：借助Shannon指數(shù)等完成稀釋曲線，對2組實(shí)驗(yàn)對象的復(fù)雜度進(jìn)行分析，結(jié)果顯示所測數(shù)據(jù)量完整，能夠反映樣本所有微生物的多樣性信息。最后對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行OTU分析、Alpha樣品多樣性分析、LEfSe樣本組間差異性分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法：采用qiime2(version 2022.2)進(jìn)行Alpha多樣性分析(Chao1、Goods_coverage、Observed_species、Shannon、Simpson等物種多樣性統(tǒng)計)，并使用biobakery LEFSe對效應(yīng)量測量(LEfSe)后展開計算。相對豐度箱線圖繪制后使用軟件R(version 4.2.0)進(jìn)行操作，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組腸道菌群基因組測序OTU分析:初發(fā)RA組的腸道菌群豐度低于對照組，腸道菌群OUT總量上較對照組偏低，見圖1(封二)。在既定相似度下聚類獲得各樣品OUT數(shù)量，繪制Venn圖，2組合計75個OTU；RA組、HC組特有OTU個數(shù)分別為32個和4個，見圖2(封二)。

2.2 2組腸道菌群基因組測序Alpha分析:菌群多樣性比較顯示，2組多樣性指數(shù)分析中Chao1指數(shù)、Observe_species指數(shù)、Simpson指數(shù)、Goods_coverage指數(shù)方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，2組之間Shannon指數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，RA組低于HC組，見表1。

表1 2組Alpha diversity指數(shù)差異性分析

2.3 2組腸道菌群基因組測序LEfSe樣本分析:菌群結(jié)構(gòu)和菌群差異分析得出，2組在門、科、屬水平上差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，初發(fā)RA患者組放線菌門(Actinobacteria)、雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)、厚壁菌科(Clostridiales Family XIII Incertae Sedis)相對豐度與健康對照組相比較明顯增加(P<0.05)。初發(fā)RA患者組木假單胞菌屬(Paraprevotella)、Tyzzerella屬、類桿菌屬(Coprobacter)相對豐度與健康對照組相比則明顯減少(P<0.05),見圖3-圖4(封二)。

3 討論

腸道所含微生物種類超過了1000種，對300萬以上的細(xì)菌基因(微生物組)進(jìn)行編碼，其數(shù)量為人類基因數(shù)量的150倍[5]。目前包括高通量測序在內(nèi)的各項(xiàng)基因測序技術(shù)的提高使得研究者對人體微生物的構(gòu)成和作用能夠進(jìn)行更深入的分析。研究者不再局限于對腸道菌群能夠調(diào)節(jié)機(jī)體營養(yǎng)代謝、抵抗病原體、維持腸道黏膜屏障完整等作用的研究，而更加重視其在維持宿主免疫應(yīng)答反應(yīng)。腸道菌群發(fā)生紊亂會致病菌的數(shù)量異常提高，可導(dǎo)致腸道黏膜屏障的完整性受損、炎性細(xì)胞聚集、分泌趨化因子等多種促炎因子，幫助T細(xì)胞遷移并激活外周B細(xì)胞，使其分化為成熟的漿細(xì)胞產(chǎn)生大量自身抗體作用于關(guān)節(jié)滑膜，最終導(dǎo)致了免疫相關(guān)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[6]。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是較為多見的自身免疫病之一，其主要機(jī)制與環(huán)境因素、免疫系統(tǒng)、遺傳因素之間相互作用相關(guān)。有研究表明，腸道菌群失調(diào)與多種自身免疫性疾病與代謝性疾病存在聯(lián)系，如干燥綜合征(SS)[7]、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、強(qiáng)直性脊柱炎(AS)、糖尿病(DM)、動脈硬化性腦梗死[8]等。16SrDNA可揭示生物物種的特征核酸序列，成為分析細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育及分類鑒定的最佳指標(biāo)。本次試驗(yàn)的樣本測序深度具合理性，豐度分布曲線表明各樣本的菌群豐富度及均勻度皆較好，經(jīng)由coverage 指數(shù)可知，此項(xiàng)試驗(yàn)中的樣本菌群對于多數(shù)菌種具備良好覆蓋率。經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)，RA病人腸道菌群多樣性、豐富度均低于健康人群，這與國內(nèi)外多項(xiàng)研究結(jié)果一致。提示RA病人體內(nèi)存在腸道菌群紊亂。有研究證明，腸道菌群多樣性降低，腸道內(nèi)環(huán)境之間平衡被破壞，會導(dǎo)致黏膜免疫功能異常，可成為多種自身免疫性疾病的重要誘因[2]。

人體腸道微生物的構(gòu)成為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門與擬桿菌門4大類。其中擬桿菌門及厚壁菌門相對豐度達(dá)90%以上，變形菌以及放線菌等其他菌相對豐度則在10%以下，此類腸道菌群結(jié)構(gòu)對于腸道穩(wěn)態(tài)的維持發(fā)揮著重要作用。腸道菌群失調(diào)會導(dǎo)致免疫系統(tǒng)疾病發(fā)生[9]。此項(xiàng)實(shí)驗(yàn)借助軟件LEfSe開展線性判斷分析(LDA)得出：①門上對比結(jié)果顯示：RA組糞便中放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度明顯增加，與譚迪等學(xué)者的研究結(jié)果一致。已有研究報道稱放線菌門(Actinobacteria)在 RA、多發(fā)性硬化癥(MS)、潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、克羅恩病(CD)等自身免疫病患者中數(shù)量明顯增多[10]，說明此類細(xì)菌可能在自身免疫炎癥過程中發(fā)揮了重要作用，甚至直接參與其中。②科上比較得出，RA患者厚壁菌科相對豐度顯著升高,同有關(guān)研究結(jié)果一致。厚壁菌門的梭菌屬于一種革蘭氏陽性厭氧菌，對人體營養(yǎng)物質(zhì)代謝發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。梭菌可經(jīng)由發(fā)酵飲食所含的可溶性纖維產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFA)以促進(jìn)維生素的合成。動物模型試驗(yàn)結(jié)果顯示，口服SCFAs可以提高Treg細(xì)胞含量，使得淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病病情得到改善[11]。另有報道結(jié)果顯示，口服SCFAs對于Treg、Th1以及Th17這3類細(xì)胞的發(fā)育有促進(jìn)作用，使得子宮炎與腎臟炎癥變得更加嚴(yán)重[12]。也有試驗(yàn)結(jié)果顯示，喂食SCFAs的小鼠，可經(jīng)由加強(qiáng)K/Bx N血清轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)AIA，導(dǎo)致K/Bx N小鼠患多發(fā)性關(guān)節(jié)炎，表現(xiàn)為類似于RA的軟骨、骨的破壞。轉(zhuǎn)移K/Bx N小鼠血清能夠在大多數(shù)小鼠品系中誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎[13]?？粕媳容^得出，RA患者雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)相對豐度顯著升高。Bifidobacteriaceae可單獨(dú)誘導(dǎo)Th17細(xì)胞，并且在小鼠模型中促進(jìn)自身免疫性關(guān)節(jié)炎，而動物雙歧桿菌和長雙歧桿菌則可誘導(dǎo)IFN-γ和TNF-α，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[14]。③屬上比較得出RA組類桿菌屬(Coprobacter)、木假單胞菌屬(Paraprevotella)，Tyzzerella屬相對豐度低于健康對照組。有實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從共生型脆弱擬桿菌中引入細(xì)菌多糖對這些自身免疫性疾病的發(fā)展具有抑制作用[15]。

總之，初發(fā)RA病人腸道菌群豐度較健康者明顯偏低，一些菌群有著明顯區(qū)別，本研究中的部分結(jié)果與既往研究不相符，考慮可能是因?yàn)槟c道菌群易受病情、年齡、飲食、地理位置等多種因素影響[13]。腸道菌群變化和RA的病理機(jī)制存在確切聯(lián)系，但尚未探明其確切機(jī)制，需要通過更為深入的研究來明確。對腸道菌群紊亂進(jìn)行靶向治療，可能為探索RA的治療方案帶來新的研究方向。早期改善腸道菌群失調(diào)，恢復(fù)腸道菌群穩(wěn)態(tài)有望降低RA的發(fā)病并減輕病情活動程度、延緩疾病進(jìn)展，成為傳統(tǒng)治療方法的補(bǔ)充。