李建麗，李 慧，李慧峰，程艷剛，王佳敏，田洪嶺，王穎莉*

1山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，晉中 030619；2山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，汾陽(yáng) 032200

藥效物質(zhì)累積規(guī)律與藥材生長(zhǎng)年份、采收時(shí)間有密切關(guān)系，二者對(duì)藥材本身的質(zhì)量、療效有直接的影響，所以選擇合適的采收時(shí)間是保證藥材有效性的關(guān)鍵所在，對(duì)藥材藥效物質(zhì)累積規(guī)律的研究可為其種植采收提供參考依據(jù)，可以保證藥效物質(zhì)的含量，進(jìn)而保證藥效。遠(yuǎn)志的生長(zhǎng)種植年份，多以3年生為主[9]，一般在種植滿兩年后的10月或第二年3、4月采收[10,11]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》規(guī)定遠(yuǎn)志在春、秋二季采挖，雖對(duì)采收期進(jìn)行規(guī)定，但無(wú)生長(zhǎng)年限要求。遠(yuǎn)志野生資源匱乏，是國(guó)家三級(jí)野生保護(hù)植物，當(dāng)前流通多為遠(yuǎn)志栽培品。山西是遠(yuǎn)志的道地產(chǎn)區(qū)，市面所售80%遠(yuǎn)志產(chǎn)自山西。栽培資源主要集中于山西新絳、聞喜、洪洞等地[12]。

本研究利用定量和指紋圖譜法對(duì)遠(yuǎn)志進(jìn)行綜合考察，探討遠(yuǎn)志不同產(chǎn)地、生長(zhǎng)年份、采收時(shí)間與其藥材的長(zhǎng)度、直徑、含水量、浸出物及含量測(cè)定等多方面累積規(guī)律的關(guān)系，以期對(duì)遠(yuǎn)志藥材選種、種植、采收提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters 2695高效液相色譜儀、Waters 2998 PDA檢測(cè)器(沃特世科技有限公司)；Alltech ELSD 2000ES檢測(cè)器；Waters XSelect CSH C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)； SMART-NE純水儀(力康生物醫(yī)療科技控股有限公司)；KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；RE-5298旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 材料

從山西汾陽(yáng)、新絳采集了12批不同遠(yuǎn)志藥材(采收時(shí)間分別為2021年春4月、秋10月)，經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)裴香萍教授鑒定為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志PolygalatenuifoliaWild.。原植物標(biāo)本保存于山西中醫(yī)藥大學(xué)山西省現(xiàn)代中藥工程實(shí)驗(yàn)室,其詳細(xì)信息見表1；PX Ⅲ對(duì)照品(批號(hào)：P27A11S122507，純度≥98%；上海源葉生物科技有限公司)；DISS對(duì)照品(批號(hào)：YZM2-XPU0；含量96.6%；中國(guó)食品藥品檢定研究院)；TEN對(duì)照品(批號(hào)：R23N8F49013；純度≥98%；上海源葉生物科技有限公司)；色譜級(jí)甲醇、乙腈(瑞典Oceanpak公司)。無(wú)水乙醇、正丁醇、甲醇、氫氧化鈉等試劑均為分析純。

表1 遠(yuǎn)志信息表

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2 方法與結(jié)果

2.1 檢查

2.1.1 水分檢查

遠(yuǎn)志采收后，除去附著泥沙，平鋪于地面，室溫通風(fēng)陰干，2天后再次除去干燥泥沙，抽取木芯，繼續(xù)通風(fēng)陰干遠(yuǎn)志筒，至藥材干燥易折斷，收集得到待測(cè)遠(yuǎn)志藥材。秋采與春采干燥方法和時(shí)間相同。按照2020版《中華人民共和國(guó)藥典》的通則0832熱烘法進(jìn)行水分測(cè)定，計(jì)算藥材中含水量(%)，數(shù)據(jù)記錄見表2。

12批藥材含水量均小于12%，符合要求。新絳產(chǎn)6批藥材含水量均高于汾陽(yáng)，各相同生長(zhǎng)年份的汾陽(yáng)產(chǎn)與新絳產(chǎn)藥材水分含量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；兩地產(chǎn)春采與秋采藥材水分含量差異不明顯。

2.1.2 浸出物檢查

按照2020版《中華人民共和國(guó)藥典》的通則2201項(xiàng)下的熱浸法，用70%乙醇作溶劑，計(jì)算浸出物的含量(%)，數(shù)據(jù)記錄見表2。

表2 遠(yuǎn)志藥材含水量、浸出物含量

12批遠(yuǎn)志浸出物含量均大于2020版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的30%。由圖1可知，汾陽(yáng)產(chǎn)春采藥材浸出物含量隨著生長(zhǎng)年份的增加而升高，趨勢(shì)明顯，新絳產(chǎn)春采藥材浸出物含量隨著生長(zhǎng)年份的增加而降低，與汾陽(yáng)產(chǎn)趨勢(shì)相反。兩地秋采藥材浸出物含量與生長(zhǎng)年份均不具有明顯的增加或減少趨勢(shì)。兩地各生長(zhǎng)年份、采收季節(jié)相同的藥材相比，新絳產(chǎn)浸出物含量較高。新絳秋采藥材浸出物含量低于春采。

2.2 遠(yuǎn)志指標(biāo)性成分的含量測(cè)定

2.2.1 溶液的制備

取PX Ⅲ、DISS對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含PX Ⅲ 0.15 mg、DISS 0.2 mg的混合對(duì)照品溶液；取TEN對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含TEN 1 mg的溶液，得對(duì)照品溶液。

圖1 遠(yuǎn)志藥材浸出物含量變化Fig.1 Changes of extract content of Polygalae Radix注：左圖為汾陽(yáng)產(chǎn)；右圖為新絳產(chǎn)。Note:Left:Fenyang production;Right:Xinjiang production.

PX Ⅲ、DISS和TEN供試品溶液均嚴(yán)格按照2020版《中華人民共和國(guó)藥典》含量測(cè)定項(xiàng)下各方法步驟制備。

2.2.2 色譜條件

PX Ⅲ、DISS含量測(cè)定的色譜條件：Waters XSelect CSH C18色譜柱(250 mm×4. 6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.05%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～19 min，15%A；19～19.5 min，15%→18%A；19～60 min，18%A)；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm；進(jìn)樣體積10 μL；體積流量1.0 mL/min。對(duì)照品、樣品色譜圖見圖2。

TEN含量測(cè)定的色譜條件：Waters XSelect CSH C18色譜柱(250 mm×4. 6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.2%甲酸水溶液(B)，等度洗脫(0～20 min，38%A)；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；體積流量1.0 mL/min，ELSD漂移管溫度110 ℃；氣體流速：2.1 L/min，對(duì)照品、樣品色譜圖見圖3。

圖2 PX Ⅲ、DISS對(duì)照品(A)及樣品(B)色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of PX Ⅲ,DISS reference substances (A) and sample (B)

圖3 TEN對(duì)照品(A)及供試品(B)色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of TEN reference substance (A) and sample (B)

2.2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

線性關(guān)系考察：取“2.2.1”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液的不同體積，按“2.2.2”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰峰面積，以峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。PX Ⅲ、DISS、TEN標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程分別為Y= 1 577 068.928X- 370 244.988 ，R2= 0.995；Y= 2 506 214.075X- 749 554.703，R2= 0.994；Y= 339 807.092X+ 63 135.823，R2 = 0.999。表明PX Ⅲ、DISS、TEN進(jìn)樣量分別在0.72～2.70、0.96～3.60、4.86～24.30 μg內(nèi)有良好的線性。

精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取“2.2.1”項(xiàng)下溶液，按“2.2.2”項(xiàng)色譜條件測(cè)定，精密度以對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次；重復(fù)性以S-1-3制備6份供試品溶液分別進(jìn)樣，穩(wěn)定性以S-1-1供試品溶液考察24 h內(nèi)穩(wěn)定性?？疾旖Y(jié)果表明儀器精密度高；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)顯示，PX Ⅲ、DISS和TEN平均含量分別為1.10、8.48和24.60 mg/g，三者含量的RSD分別為和0.84%、0.85%和2.56%，重復(fù)性好；樣品24 h內(nèi)穩(wěn)定。其保留時(shí)間和峰面積RSD結(jié)果見表3。

表3 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

加樣回收率：精密稱取已知PX Ⅲ、DISS含量的S-1-2樣品干燥粉末約1 g，共6份，精密加入PX Ⅲ、DISS濃度分別為0.120 5、0.112 7 mg/mL的混合對(duì)照品溶液1 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算PX Ⅲ、DISS平均回收率分別為99.13%、99.71%，RSD分別為1.50%、1.58%。精密稱取已知TEN含量的S-1-2干燥粉末約1 g，共6份，精密加入濃度為1.030 5 mg/mL的TEN對(duì)照品溶液1 mL，按“2.2.1”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算TEN的平均回收率為99.86%，RSD為1.46%，表明方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率結(jié)果

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取12批藥材，各平行取3份，按照“2.2.1”項(xiàng)制備供試品溶液，按照“2.2.2”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，分別計(jì)算PX Ⅲ、DISS、TEN在樣品中的含量，結(jié)果見表5。

表5 遠(yuǎn)志三種指標(biāo)性成分的含量測(cè)定

結(jié)果表明，12批藥材中DISS含量均大于《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的0.5%。汾陽(yáng)產(chǎn)春采DISS含量高于秋采，但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在種植3年后含量累積達(dá)到最大。新絳產(chǎn)春采DISS含量高于秋采，春采藥材與汾陽(yáng)產(chǎn)有類似的累積規(guī)律，在3年后達(dá)到最大累積含量；秋采中DISS隨著生長(zhǎng)年限的增加，含量逐漸增加。

汾陽(yáng)、新絳產(chǎn)PX Ⅲ 含量與生長(zhǎng)年份的關(guān)系不太明顯，兩地相同生長(zhǎng)年份秋采PX Ⅲ 含量較高，且均在種植3年后到峰值；與DISS累積規(guī)律類似。

汾陽(yáng)產(chǎn)TEN生長(zhǎng)2年達(dá)到含量最大值，3年達(dá)到最低值，且春采TEN含量高于秋采。新絳產(chǎn)在生長(zhǎng)3年含量達(dá)到最高值，規(guī)律同汾陽(yáng)一致春采高于秋采；TEN2年生含量高于4年生。

綜上，兩地春采樣品PX Ⅲ、DISS有類似的累積規(guī)律，均在生長(zhǎng)3年出現(xiàn)累積最大值，與傳統(tǒng)的種植采收時(shí)間相符。TEN春采含量較高，且2年生高于4年生。

以上三種指標(biāo)性成分的含量相加得到總含量并對(duì)其進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)汾陽(yáng)產(chǎn)遠(yuǎn)志相同生長(zhǎng)年份春采總含量高于秋采，秋采藥材隨著生長(zhǎng)年份的增加總含量逐年減少。不同采收時(shí)間的新絳產(chǎn)遠(yuǎn)志均在生長(zhǎng)第三年達(dá)到總含量的最大值，有相同的累積規(guī)律，且相同生長(zhǎng)年份春采總含量高于秋采(見圖4)。

圖4 遠(yuǎn)志藥材三種成分總含量Fig.4 Total content of three components of Polygalae Radix注：左圖為汾陽(yáng)產(chǎn)；右圖為新絳產(chǎn)。Note:Left:Fenyang production;Right:Xinjiang production.

2.3 遠(yuǎn)志藥材指紋圖譜的建立

2.3.1 溶液的制備

取0.5 g藥材，精密稱定，加20 mL 70%甲醇搖勻，室溫超聲提取30 min(200 W，40 kHz)，用70%甲醇補(bǔ)足失重。過(guò)濾，即得供試品溶液。

精密稱取PX Ⅲ、DISS對(duì)照品適量，制成0.1 mg/mL 的單獨(dú)對(duì)照品溶液和0.1 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3.2 色譜條件

Waters XSelect CSH C18色譜柱(250 mm×4. 6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-0.05%磷酸水(B)，梯度洗脫系統(tǒng)(0～10 min，10%→20% A；10～15 min，20%→21% A；15～20 min，21%→23% A；20～30 min，23%→26% A；30～40 min，26%→38% A；40～50 min，38%→40%A；50～70 min，40%→42% A；70～73 min，42%→10%A)，體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)316 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積10 μL。

2.3.3 色譜峰的指認(rèn)與方法學(xué)考察

將對(duì)照品溶液按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖與結(jié)果，經(jīng)對(duì)照品指認(rèn)，最終確認(rèn)共有峰5為PX Ⅲ，峰8為DISS。峰5、8均在12批樣品中出現(xiàn)并完全分離。對(duì)照品色譜圖見圖5。

圖5 PX Ⅲ、DISS指紋圖譜Fig.5 HPLC fingerprint of PX Ⅲ and DISS

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取S-2-1供試品溶液，與“2.2.3”項(xiàng)方法相同，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)指紋圖譜，獲得峰5 PX Ⅲ和峰8 DISS的保留時(shí)間RSD分別為0.48%、0.62%，峰面積RSD分別為1.34%、1.03%，說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取S-2-1藥材，與 “2.2.3”項(xiàng)方法相同，按照“2.3.1”制備供試品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)指紋圖譜，獲得峰5 PX Ⅲ和峰8 DISS的保留時(shí)間RSD分別為0.68%、1.06%，峰面積RSD分別為2.34%、2.63%，重復(fù)性好。

2.3.4 指紋圖譜的建立與結(jié)果分析

取汾陽(yáng)、新絳產(chǎn)共12批遠(yuǎn)志供試品溶液，以“2.3.2”色譜條件分析記錄色譜圖與結(jié)果，將色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012)”，以中位數(shù)法生成遠(yuǎn)志共有圖譜，并作為參照?qǐng)D譜，采用多點(diǎn)校正、全峰匹配建立12批樣品指紋圖譜，樣品指紋圖譜見圖6，系統(tǒng)生成的對(duì)照指紋圖譜見圖7。

圖6 12批樣品HPLC指紋圖譜Fig.6 HPLC fingerprint of 12 batches of samples

圖7 12批樣品HPLC共有峰Fig.7 Common peaks of 12 batches of samples

樣品指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)：遠(yuǎn)志12批樣品共有35個(gè)共有峰，相似度介于0.823～0.962之間，見表6。兩地產(chǎn)遠(yuǎn)志藥材相似度高，其化學(xué)成分種類相似，在含量上略有差異。12批樣品相同生長(zhǎng)年份春采相似度高于秋采，汾陽(yáng)產(chǎn)生長(zhǎng)3年樣品春采和秋采的相似度均為最低。汾陽(yáng)產(chǎn)和新絳產(chǎn)樣品相似度沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，同一基源、不同產(chǎn)地、不同生長(zhǎng)年份樣品指紋圖譜相似度高。

表6 12批樣品指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)

3 討論與結(jié)論

藥用植物中有效成分的含量及累積規(guī)律會(huì)受到基源、種植、采收及環(huán)境等多種因素的影響，藥材生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)除對(duì)藥材性狀如長(zhǎng)度、直徑等造成直觀影響外，對(duì)有效成分的含量影響很大，進(jìn)而會(huì)影響其藥效。中藥材的最佳采收期應(yīng)是包含采收時(shí)間和采收年限的雙重概念，在其有效成分含量高、外觀性狀佳的時(shí)期進(jìn)行采收，才能得到優(yōu)質(zhì)的藥材，從而達(dá)到更好藥效。本研究除對(duì)藥材性狀進(jìn)行測(cè)量外，利用熱浸法、HPLC，從浸出物、PX Ⅲ、DISS和TEN的含量及指紋圖譜相似度等多方面對(duì)12批同一基源、不同年份、產(chǎn)地和采收時(shí)間的遠(yuǎn)志藥材進(jìn)行藥效物質(zhì)累積規(guī)律的研究。

12批藥材醇浸出物含量均大于30%，DISS含量均大于0.50%；以PX Ⅲ為指標(biāo)，僅有S-1-4、S-1-5的含量達(dá)到0.15%；以TEN為指標(biāo)，僅S-1-1、S-2-2、S-2-5有的含量達(dá)到2.0%。文獻(xiàn)表明，HPLC測(cè)定遠(yuǎn)志藥材中PX Ⅲ的合格率在50%～80%左右[13]；TEN含量范圍為1.4%～4.4%[14-16]，與本研究的結(jié)果相近。含量測(cè)定變化區(qū)間大的原因可能有PX Ⅲ存在兩種分子構(gòu)型[17]和ELSD檢測(cè)器靈敏度低等。遠(yuǎn)志藥材中所含化學(xué)成分的多樣，故以此三種化學(xué)成分的含量為指標(biāo)評(píng)價(jià)遠(yuǎn)志質(zhì)量的合理性與準(zhǔn)確性仍需考量。

本研究發(fā)現(xiàn)新絳產(chǎn)遠(yuǎn)志含水量、浸出物含量和三種指標(biāo)性成分總含量均高于汾陽(yáng)產(chǎn)；兩地春采藥材浸出物、成分總含量均高于秋采。山西為遠(yuǎn)志的道地產(chǎn)區(qū)，產(chǎn)區(qū)多分布于山西南部，相較于汾陽(yáng)，新絳地理位置偏南，本研究表明新絳更適合遠(yuǎn)志的種植與栽培。兩地遠(yuǎn)志浸出物、總成分含量與采收季節(jié)有關(guān)，均表現(xiàn)為春季含量較高，本研究認(rèn)為相同生長(zhǎng)年份，春季采收的遠(yuǎn)志更為合適。

藥材的藥效物質(zhì)累積規(guī)律與其品種、產(chǎn)地和采收時(shí)間有密切的關(guān)系，藥材采收時(shí)間的確定也要考慮到品種、產(chǎn)地及其不同藥用部位的影響，且因治療目的的不同可能導(dǎo)致不同的生長(zhǎng)期限和采收時(shí)間?？蛇M(jìn)一步探究是否能夠根據(jù)治療疾病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的不同，靈活、合理、選擇性地安排其采收時(shí)間。因本研究遠(yuǎn)志樣品批次選取的限制性、不同批次內(nèi)樣本數(shù)量的有限性、所選取測(cè)定成分的合理性，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果是否具有代表性、全面性還需進(jìn)一步研究。另外，在全國(guó)范圍內(nèi)的其他遠(yuǎn)志種植區(qū)、不同基源遠(yuǎn)志是否具有相同的累積規(guī)律也需要深入研究，為遠(yuǎn)志的種植采收提供更有力可信的參考。