紫若·塔里哈提，曙麗盼·木拉提，張偉怡*，周文婷*

1新疆醫(yī)科大學藥學院；2新疆天然藥物活性組分與釋藥技術重點實驗室，烏魯木齊 830011

宮頸癌是婦女生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，超過99%的宮頸癌患者均伴有高危人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)的感染，其中HPV 16和HPV 18作為常見的高危表型[1]。近年來，其發(fā)病率明顯升高，雖然藥物放/化療和手術治療對早期宮頸癌有一定療效，但對中晚期宮頸癌的治療效果欠佳，且復發(fā)率高，副作用明顯[2]。E6/E7作為宮頸癌中主要的致癌基因，是上皮細胞發(fā)生初始變化的原因，能夠促進宿主細胞增殖和病毒擴增[3]。研究表明，HPV E6/E7癌蛋白成為治療宮頸癌的潛在藥物靶點[4]。因此，誘導E6/E7降解的天然化合物可能是抗宮頸癌藥物的重要來源。

肉桂作為臨床上的常用中藥之一，具有“百藥之長”的稱號[5]。桂皮醛(cinnamaldehyde，CA)作為肉桂揮發(fā)油中的主要成分，是一種天然的小分子化合物[6]。研究表明，其具有解熱、抗炎及降糖等多種藥理活性，同時能夠抑制非小細胞肺癌、肝癌、胃癌以及黑色素瘤等多種腫瘤細胞增殖，呈現(xiàn)出一定的抗腫瘤作用[7-11]，但其誘導腫瘤細胞凋亡的分子機制尚未完全闡明，關于其抗宮頸癌的作用也少見報道。本研究利用人宮頸癌Siha細胞，檢測CA在體外的抑癌效應及作用機制，為抗宮頸癌研究提供進一步的理論基礎和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

1.1.1 主要試劑

人宮頸癌Siha細胞，購自武漢普諾賽生命科技有限公司。桂皮醛(CA)、紫杉醇(TAX)、順鉑(Pt)以及5-氟尿嘧啶(5-FU)購自上海源葉生物科技有限公司(純度均≥ 98%)。CCK-8試劑盒(Lot No：BA08198147)、β-Actin、Bax、Bcl-2以及Survivin抗體購自北京bioss生物科技有限公司(純度均≥ 98%)；PAGE凝膠快速制備試劑盒(Lot No：20201230)、Hoechst 33342試劑盒(Lot No：20210623)、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(Lot No：20210512)以及細胞周期檢測試劑盒(Lot No：20201106)均購自北京索萊寶生物科技有限公司；細胞培養(yǎng)級別二甲基亞砜DMSO(Lot No：WXBD0293V)、DMEM高糖培養(yǎng)基(Lot No：2130206)以及胎牛血清FBS均購自美國Gibco公司；HPV E6及HPV E7購自美國Gene Tex公司；化學發(fā)光試劑盒(貨號：2021601)及PVDF膜(貨號：R1MB52546)均購自美國Millipore公司；HPR-goat anti rabbit抗體購自美國CST公司。

1.1.2 主要儀器

細胞培養(yǎng)箱、多功能酶標儀、高速低溫離心機以及垂直層流潔凈工作臺(美國Thermo公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；智能成像系統(tǒng)(上海Tanon公司)；蛋白電泳設備(美國伯樂公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

Siha細胞采用含10% FBS的不同培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)細胞，根據(jù)細胞的生長情況約2～3天傳代一次。

1.2.2 CCK-8法測定細胞增殖

Siha細胞，以3.0×103個/孔鋪于96孔板內培養(yǎng)過夜。實驗組分別加入不同濃度的化合物，空白組加入雙蒸水(空白對照，藥品用DMSO配成母液后，通過雙蒸水進行稀釋)，對照組加入等倍稀釋的溶劑DMSO(溶劑對照)。每組設3個復孔，培養(yǎng)72 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，于37 ℃作用2 h，用酶標儀于450 nm處測定OD值。并按下列公式分別計算不同化合物對多種細胞生長抑制率。

細胞增殖抑制率 =

(OD溶劑對照-OD給藥)/OD溶劑對照×100%

運用SPSS軟件，根據(jù)不同濃度化合物對細胞生長抑制率分別計算出其IC50。

1.2.3 細胞遷移實驗

在6孔板背面沿孔直徑均勻劃橫線。Siha細胞以2.0×105個/孔鋪于6孔板中培養(yǎng)過夜。用黃色吸頭垂直于橫線劃痕。去培養(yǎng)基，PBS清洗2～3次，加入不含血清的培養(yǎng)基。實驗組分別加入不同濃度的CA培養(yǎng)48 h，分別在劃痕0 h和48 h后觀察并拍照。使用Image J軟件進行統(tǒng)計分析。

1.2.4 細胞周期的流式細胞儀檢測

Siha細胞，以2.0×105個/孔鋪于6孔板中培養(yǎng)過夜。實驗組分別加入不同濃度的CA培養(yǎng)24 h。收集細胞樣品于流式管中，4 ℃，1 200 r/min離心5 min后，棄上清，加入1 mL PBS重懸后，再次按上述方法重復洗滌，棄上清。加入純度為95%的冷乙醇，混勻后置于4 ℃固定過夜。取上述固定細胞，4 ℃，1 200 r/min離心5 min后，去除乙醇后用PBS重懸，再次離心，重復此步驟兩次。每管分別加入400 μL RNaseA酶，置于37 ℃孵育30 min。隨后每管分別加入100 μL的碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液，避光置于4 ℃孵育30 min后，上機進行流式檢測。最后采用Modfit軟件分析實驗結果。

1.2.5 Hoechst 33342熒光染色法鑒定凋亡細胞

Siha細胞以5.0×104/孔鋪于共聚焦小皿中培養(yǎng)過夜。實驗組分別加入不同濃度的CA培養(yǎng)24 h。棄去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛在4 ℃條件下固定15 min。棄固定液，Hoechst 33342染色液室溫條件下染色15 min。使用熒光顯微鏡觀測。

1.2.6 細胞中線粒體膜電位的檢測

Siha細胞以3.0×105/孔鋪于6孔板中培養(yǎng)過夜。實驗組分別加入不同濃度的CA，陽性對照組加入10 μmol/L 解偶聯(lián)劑(chloro carbonyl cyanide phenyl hydrazone，CCCP，能夠攜帶質子穿透線粒體內膜)，培養(yǎng)24 h。加入1 mL JC-1染色工作液，充分混勻，孵育20 min。隨后，用1×的JC-1染色緩沖液洗滌2次。再加入2 mL細胞培養(yǎng)液，于共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.7 Western blot檢測

Siha細胞以3.0×105/孔鋪于6孔板中培養(yǎng)過夜。實驗組分別加入不同濃度的CA培養(yǎng)24 h。PBS清洗后，加入高效RIPA細胞裂解液，冰上裂解20 min，12 000 r/min離心15 min。分別收集上清，用BCA試劑盒進行蛋白定量。SDS-PAGE凝膠電泳后，電轉移至PVDF膜上，經5%脫脂牛奶封閉后，分別加入按相應比例稀釋后的一抗溶液(β-Actin、E6、E7、Bcl-2、Survivin及Bax)，4 ℃孵育過夜。經TBST室溫清洗3次，每次10 min。隨后加入1∶5 000稀釋的二抗溶液，室溫孵育1 h。經TBST充分清洗后，加入化學發(fā)光液進行曝光檢測。使用Image J軟件進行灰度統(tǒng)計分析。

1.2.8 藥物協(xié)同指數(shù)計算

利用CompuSyn軟件，可計算出兩種藥物之間共同作用的聯(lián)用指數(shù)(combination index，CI)。CI值>1，兩種化合物為拮抗；CI值=1，兩種化合物為相加；CI值<1，兩種化合物具為協(xié)同。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 實驗結果

2.1 CA抑制Siha細胞的增殖和遷移

首先對CA在不同時間、濃度下對Siha細胞的生長抑制作用分別進行檢測。結果如圖1A所示，CA呈時間、濃度依賴性地抑制Siha細胞的生長，且給藥后24、48和72 h的IC50分別為110.96、85.52、47.05 μmol/L，說明CA能夠抑制Siha細胞的增殖。

圖1 CA對Siha細胞增殖的抑制作用(n = 3)Fig.1 Inhibitory effect of CA on the proliferation in Siha cells (n = 3)

為了進一步驗證CA對Siha細胞生長的抑制作用，我們進行了細胞劃痕實驗。結果如圖2所示，與空白對照組(Ctrl)相比，隨著CA給藥濃度的升高，能夠明顯抑制Siha細胞的遷移，證實CA能夠有效抑制Siha細胞的遷移能力。

圖2 CA對Siha細胞遷移能力的影響(n = 3)Fig.2 Effect of CA on migration in Siha cells (n = 3)注：與Ctrl組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，下同。Note:Compared with Ctrl group,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,the same below.

2.2 CA阻滯Siha細胞周期并誘導凋亡

目前常用的細胞周期檢測方法為PI染色，由于PI能夠嵌入到DNA雙鏈之間，從而被激光激發(fā)出紅色熒光，隨后再通過RNaseA酶孵育去除RNA。我們利用該方法，通過流式細胞術檢測CA對Siha細胞周期的影響，結果如圖3所示，與空白對照組(Ctrl)相比，隨CA濃度的升高，G2/M期的比例從21.62%上升至33.91%，并具有明顯的濃度依賴性，說明CA能夠阻滯在Siha細胞的G2/M期。

為了分析CA是否能夠誘導Siha細胞凋亡，我們首先通過Hoechst 33342染色觀察細胞凋亡情況。結果如圖4所示，CA處理后，細胞核呈現(xiàn)亮藍色熒光，且具有濃度依賴性，提示CA誘導Siha細胞凋亡。為了進一步驗證該結果，我們進行JC-1染色，通過熒光共聚焦顯微鏡觀察CA作用于Siha細胞后線粒體膜電位的變化情況。結果如圖5所示，與陽性對照組相比，隨CA濃度的升高，劑量組綠色熒光顯著增強，說明CA破壞了線粒體跨膜電位，誘導Siha細胞凋亡。

圖3 CA對Siha細胞周期的影響Fig.3 Effect of CA on cell cycle in Siha cells

圖4 CA對Siha細胞核染色質的形態(tài)學變化影響(標尺：50 μm)Fig.4 Effect of CA on the morphology of nuclear chromatin in Siha cells(scale:50 μm).

圖5 CA對Siha細胞中線粒體跨膜電位的影響(標尺：50 μm)Fig.5 Effect of CA on mitochondrial membrane potential in Siha cells (scale:50 μm)

此外，進一步通過Western blot法檢測了CA對Siha細胞中凋亡相關蛋白的影響。結果如圖6所示，通過灰度統(tǒng)計分析可以看出，抗凋亡蛋白Bcl-2、Survivin的表達減少，促凋亡蛋白Bax的表達增多。以上結果均進一步證明了CA可以誘導Siha細胞發(fā)生凋亡。

圖6 CA對Siha細胞凋亡的影響(n = 3)Fig.6 Effect of CA on apoptosis in Siha cells (n = 3)

2.3 CA通過蛋白酶體途徑抑制Siha細胞中HPV E6/E7的表達

考慮到HPV E6/E7在伴有HPV感染的癌細胞(如Siha)的生存中起著關鍵作用，我們進一步探究了CA對Siha細胞中E6/E7蛋白表達的影響。結果顯示，CA顯著降低了Siha細胞中E6/E7的表達水平，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性(見圖7)。

圖7 CA對Siha細胞中HPV E6/E7的影響(n = 3)Fig.7 Effect of CA on HPVE6/E7 in Siha cells (n = 3)

隨后，進一步探究CA抑制E6/E7表達的作用機制。預先加入一種蛋白酶體抑制劑MG132處理1 h，再加入CA共同作用6 h后檢測，結果如圖8所示，當MG132與CA共同作用后，E6/E7表達明顯增加，表明CA通過蛋白酶體途徑抑制E6/E7表達。

圖8 蛋白酶體抑制劑MG132對CA抑制Siha細胞中HPV E6/E7表達的影響(n = 3)Fig.8 Effect of proteasome inhibitor MG132 on the inhibition of CA on HPV E6/E7 expression in Siha cells (n = 3)注：與Ctrl組比較，**P<0.01，***P<0.001；與MG132 10 μmol/L組比較，#P<0.05；##P<0.01。Note:Compared with Ctrl group,**P<0.01,***P<0.001;Compared with MG132 10 μmol/L group,#P<0.05;##P<0.01.

2.4 CA與不同宮頸癌化療藥物聯(lián)用后具有協(xié)同效果

TAX、Pt以及5-FU均為治療宮頸癌的常用化療藥物，為了檢測CA是否能與這三種化療藥物產生協(xié)同效果，我們分別檢測了TAX、Pt、5-FU這三種藥物在Siha細胞中的抑制作用，并計算其IC50值。

首先對其單獨在Siha細胞中的活性進行檢測。結果如圖9A、9B、9C所示，給藥72 h后，其中TAX的IC50為16 μmol/L，Pt的IC50為36 μmol/L，5-FU的IC50為31 μmol/L。為了進一步檢測其與CA聯(lián)合在Siha細胞中是否有協(xié)同效果，我們根據(jù)其亞致死濃度，設定聯(lián)合給藥的濃度，并分別與CA進行聯(lián)合給藥考察抑制效果。通過計算IC50值發(fā)現(xiàn)，與單獨給藥組相比，TAX/Pt/5-FU分別與不同濃度的CA聯(lián)用后抑制作用明顯增強，且具有一定的濃度依賴性(圖9D、9E、9F)。隨后，將上述結果分別投入到聯(lián)合指數(shù)計算軟件中進行計算，發(fā)現(xiàn)TAX/Pt/5-FU與CA在一定濃度范圍內均具有協(xié)同效果(圖9G、9H、9I，協(xié)同指數(shù)見表1)。

圖9 三種宮頸癌化療藥物對Siha細胞的抗腫瘤效果及與CA的協(xié)同效果Fig.9 Anti-tumor effect of three cervical cancer chemotherapy drugs and synergistic effect with CA in Siha cells

表1 CA聯(lián)合三種宮頸癌化療藥物在Siha細胞中的協(xié)同指數(shù)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

3 討論與結論

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，常伴有高復發(fā)率和高轉移率的特點，嚴重威脅女性健康[12]。近年來，天然化合物通過抑制E6/E7，已廣泛探索其作為宮頸癌治療的潛在用途。例如，丹參酮IIA在轉錄水平抑制E6/E7，對宮頸癌細胞形成p53依賴的生長抑制[13]；茴香酸通過蛋白酶體降解在蛋白水平下調宮頸癌細胞中的E6/E7表達，并誘導p53非依賴性線粒體凋亡[14]；n-芐基肉桂酰胺通過抑制E6/E7 mRNA水平促進人宮頸癌細胞凋亡[15]。在本研究中，我們首次報道了CA能夠誘導Siha細胞凋亡并下調HPV E6/E7蛋白的表達水平。

細胞周期異常是腫瘤形成的主要原因之一，其調控機制包括細胞周期驅動和監(jiān)控。當驅動機制受損時，會促使正常細胞生長失控，并向腫瘤細胞轉化；當監(jiān)控機制受損時，會誘導細胞在DNA修復以及細胞死亡等環(huán)節(jié)發(fā)生功能紊亂，惡化整個調控機制[16,17]。我們通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，CA能夠誘導Siha細胞中G2/M期的細胞比例明顯增加，說明CA阻滯在G2/M期。細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種形式[18,19]，其過程主要涉及死亡受體信號通路、線粒體信號通路和內質網(wǎng)信號通路[20,21]。其中“線粒體信號通路”中的代表蛋白為Bcl-2及Bax等，它們在接收到胞內的死亡信號后激活，在線粒體外膜或胞漿中產生相互作用，從而引起線粒體膜通透性的改變、跨膜電位的丟失，進而釋放細胞色素C和其他蛋白[22]。前期實驗我們首先通過Hoechst 33342染色證實CA誘導Siha細胞凋亡；隨后通過JC-1熒光探針檢測，發(fā)現(xiàn)CA顯著降低Siha細胞中線粒體的跨膜電位；進一步的Western blot驗證發(fā)現(xiàn)CA使Siha細胞中的抗凋亡蛋白Bcl-2，survivin減少，促凋亡蛋白Bax增多，進一步說明細胞發(fā)生凋亡。E6/E7蛋白有助于維持伴有HPV感染的宮頸癌細胞的惡性表型，并且能夠調節(jié)許多與細胞存活、凋亡通路相關的分子。本文證明CA能夠下調E6/E7的表達水平，從而誘導伴有HPV感染的Siha細胞發(fā)生凋亡。隨后我們探究了CA誘導E6/E7降解的具體機制。結果證實用蛋白酶體抑制劑MG132預先作用后，能夠明顯減弱CA誘導的E6/E7降解現(xiàn)象，說明這兩個蛋白之前是由于蛋白酶體而發(fā)生降解。

小分子藥物對基因功能的影響都具有濃度依賴性[23]。如果一個小分子藥物能夠發(fā)揮抗腫瘤作用，它就可以采用亞致死濃度去篩選出能夠與其協(xié)同致死的藥物，這種方法被稱為化學基因組學篩選策略[24]。由于目前臨床上治療宮頸癌的化療藥物對患者具有一定的選擇性，且長期使用會出現(xiàn)耐藥性等副作用，而現(xiàn)有的臨床聯(lián)合給藥方案也僅對部分患者有效。因此，尋找并開發(fā)出新的治療藥物和聯(lián)合給藥的方案是我們需要進行的研究工作。在本研究中，我們利用化學基因組學篩選策略，對CA與臨床上常用的治療宮頸癌藥TAX、Pt、5-FU在Siha細胞中進行協(xié)同效果的檢測。結果證實，CA聯(lián)合上述化療藥物均能在一定濃度下呈現(xiàn)協(xié)同效果，且聯(lián)合用藥組的作用效果優(yōu)于單獨用藥組，差異有統(tǒng)計學意義。據(jù)文獻報道，在抗腫瘤過程中，上述化療藥物均可引起DNA損傷，并阻滯細胞周期；其中，TAX可阻滯G2M期[25]；Pt可阻滯G2M期[26]；5-FU可阻滯G0/G1期[27]。根據(jù)本文研究結果，提示CA可能與上述化療藥物通過共同阻滯細胞周期，發(fā)揮協(xié)同增效的作用，進而誘導細胞凋亡，增強其抗宮頸癌效果。

綜上所述，本研究證實CA通過線粒體途徑誘導Siha細胞凋亡，并通過蛋白酶體途徑下調HPV E6/E7蛋白的表達；同時與多種宮頸癌常用化療藥物均能在細胞水平上呈現(xiàn)協(xié)同效果。以上研究為更好地治療宮頸癌提供了新的研究思路，同時也提出了新的聯(lián)合給藥方案，為減輕患者在抗宮頸癌治療中的耐藥性，提高對患者的有效率，提供了理論依據(jù)。