莊 麗，陳照宇，韓光明，楊 倩，張 艷

（山東省日照市中醫(yī)醫(yī)院，山東 日照 276800）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種慢性、侵蝕性自身免疫性疾 病，主要臨床表現(xiàn)為對稱性關(guān)節(jié)炎［1］，常伴有嚴(yán)重的疼痛和腫脹，嚴(yán)重者甚至?xí)?dǎo)致關(guān)節(jié)損傷和殘疾，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［2］。目前，全球的發(fā)病率為0.3%～1.0%，我國類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的患病人數(shù)隨人口老齡化趨勢逐年增加［3］。由于發(fā)病原因不明且發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其病理機(jī)制尚不明確。臨床常用的非甾體抗炎藥及糖皮質(zhì)激素等抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物，一定程度上緩解了病情，但長期使用會產(chǎn)生副作用［4］。中醫(yī)認(rèn)為，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎屬“歷節(jié)風(fēng)”“頑痹”等范疇，由風(fēng)、寒、濕三氣雜至所致［5-6］。中醫(yī)藥治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎歷史悠久，潛力和優(yōu)勢明顯。藤枝愈痹顆粒是根據(jù)全國名老中醫(yī)孫學(xué)全主任醫(yī)師臨床經(jīng)驗方藤枝愈痹方制備而成的顆粒劑，由雞血藤、絡(luò)石藤、青風(fēng)藤、海風(fēng)藤、桂枝、桑枝、豨薟草、薏苡仁等組方，具有祛風(fēng)除濕、散寒止痛功效。其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)類的療效顯著，但由于中藥復(fù)方成分復(fù)雜，具體的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制并不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過構(gòu)建藥物、靶點及疾病之間的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從整體上揭示中藥與疾病的相關(guān)性，進(jìn)而系統(tǒng)闡述中藥多成分、多靶點、多通路的潛在分子機(jī)制［7］。本研究中基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，對藤枝愈痹顆粒治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的活性成分、作用靶點及作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測和分析?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 資料收集

本研究中所用數(shù)據(jù)庫信息見表1。

表1 數(shù)據(jù)庫信息Tab.l Information of databases

1.2 方法

藤枝愈痹顆?；钚猿煞旨俺煞职悬c獲?。阂钥诜锢枚龋∣B）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為篩選條件，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索藤枝愈痹顆粒中雞血藤、青風(fēng)藤、海風(fēng)藤、絡(luò)石藤、桂枝、桑枝、豨薟草、薏苡仁的活性成分及成分靶點，并借助Uniprot數(shù)據(jù)庫對成分靶點進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎潛在靶點獲取與篩選：以“rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞，分別在GeneCards及DisGeNET數(shù)據(jù)中檢索類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的靶點，取上述數(shù)據(jù)庫的共有靶點為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在靶點。并將上述獲得的成分靶點與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在靶點分別輸入Venny 2.0.2數(shù)據(jù)庫，得到的共有靶點即為藤枝愈痹顆粒治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在靶點。

中藥-活性成分-共有靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建：按照一一對應(yīng)的關(guān)系，分別將組成藤枝愈痹顆粒的中藥、活性成分及共有靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件中，構(gòu)建中藥-活性成分-共有靶點網(wǎng)絡(luò)，并對其進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析，根據(jù)度值篩選位置靠前的成分為核心成分。網(wǎng)絡(luò)中度值越大，表明網(wǎng)絡(luò)中與其他節(jié)點連線越多，位置越重要。

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建：將上述共有靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫中，最小交互打分值設(shè)置為0.7，物種設(shè)置為“智人”種，構(gòu)建PPI，作用結(jié)果借助Cytoscape 3.7.0軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析，并根據(jù)度值篩選位置靠前的靶點為核心靶點。

GO功能富集分析和KEGG通路富集分析：采用DAVID數(shù)據(jù)庫對共有靶點進(jìn)行分析，其中GO功能富集分析包括生物過程（BP）、分子功能（MF）和細(xì)胞組成（CC）3個部分。設(shè)定P<0.05為富集結(jié)果較好的過程及通路，采用R語言作圖分析。

分子對接驗證：將得到的核心成分與核心靶點采用Autodock Vina軟件進(jìn)行分子對接驗證。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取核心成分的MOL2格式，并借助ChemDrew 3D軟件進(jìn)行能量最小化處理，再采用Autodock 1.5.6軟件保存為PDBQT文件格式，備用。采用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫獲取核心靶點的晶體結(jié)構(gòu)，并通過Autodock軟件進(jìn)行去水加氫、去配體等處理后保存為PDBQT文件格式，備用。最后采用Autodock Vina軟件對核心成分與核心靶點進(jìn)行分子對接處理。以最低結(jié)合能評價結(jié)合的分子對接結(jié)果，結(jié)合能越低，對接結(jié)果越好。本研究中以結(jié)合能不高于-5 kJ/mol為兩者相互作用較好［8］。

2 結(jié)果

2.1 活性成分及成分靶點

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共篩選出活性成分88個，其中桂枝7個，海風(fēng)藤21個，雞血藤23個，絡(luò)石藤9個，青風(fēng)藤6個，桑葉3個，豨薟草9個，薏苡仁9個（表2），剔除無靶點及重復(fù)成分后得到67個活性成分。得到藤枝愈痹顆粒成分靶點1196個，剔除重復(fù)項后得到164個成分靶點。

表2 藤枝愈痹顆粒活性成分Tab.2 Active components in Tengzhi Yubi Granules

2.2 治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在靶點

通過GeneCards及DisGeNET數(shù)據(jù)庫分別獲得類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點5018個、2723個，取交集后得到潛在靶點1879個，再與上述的164個成分靶點取交集后得到共有靶點85個，即為藤枝愈痹顆粒治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在靶點（圖1）。

圖1 藤枝愈痹顆?；钚猿煞峙c類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎共有靶點維恩圖Fig.1 Venn diagram of the common targets of the active components in Tengzhi Yubi Granules and RA

續(xù)表2藤枝愈痹顆粒活性成分Continued Tab.2 Active components in Tengzhi Yubi Granules

2.3 中藥-活性成分-共有靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將中藥、活性成分及共有靶點導(dǎo)入Cytoscape 3.7.0軟件中構(gòu)建中藥-活性成分-共有靶點網(wǎng)絡(luò)（圖2），包含158個節(jié)點、507條邊。根據(jù)度值篩選得到木犀草素、山柰酚、甘草查耳酮A等10個成分為核心成分，詳見表3。

圖2 中藥-活性成分-共有靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Network of TCM-active components-common targets

表3 藤枝愈痹顆粒核心成分信息Tab.3 Information of core components of Tengzhi Yubi Granules

2.4 PPI構(gòu)建

通過String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI（圖3），其中包含85個節(jié)點、569條邊。根據(jù)度值篩選得到白細(xì)胞介素6（IL-6）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、促分裂原活化的蛋白激酶8（MAPK8）、促分裂原活化的蛋白激酶1（MAPK1）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）等10個靶點為核心靶點，詳見表4。

圖3 藤枝愈痹顆粒治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的PPIFig.3 PPI of Tengzhi Yubi Granules in the treatment of RA

表4 核心靶點信息Tab.4 Information of core targets

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫，對共有靶點進(jìn)行分析。其中，GO功能富集分析主要涉及對脂多糖的反應(yīng)、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、對金屬離子的反應(yīng)等1619條生物過程；細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶全酶復(fù)合物、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物及蛋白激酶復(fù)合物等38條細(xì)胞組成；核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等120條分子功能，根據(jù)P值各篩選前10條結(jié)果作圖，詳見圖4。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，共有靶點主要富集在腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素17（IL-17）及磷脂酰肌醇3激酶-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（PI3K-AKT）等130條信號通路，根據(jù)P值篩選排名前20條結(jié)果作圖，詳見圖5。

圖4 GO功能富集分析條形圖Fig.4 Bar chart of GO function enrichment analysis

圖5 KEGG通路富集分析氣泡圖Fig.5 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis

2.6 通路-核心靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了更加清晰地反映通路與核心靶點間的關(guān)系，構(gòu)建了通路-核心靶點網(wǎng)絡(luò)（圖6），網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點越大，度值越大?？梢姡琈APK1，AKT1，MAPK8等靶點富集的信號通路較多，是其核心靶點。

圖6 通路-核心靶點網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Network of pathways-core targets

2.7 分子對接驗證

采用Autodock Vina軟件對排名前10個核心成分與核心靶點進(jìn)行分子對接驗證（圖7）。結(jié)果顯示，核心成分與核心靶點的對接結(jié)合能均低于-5 kJ/mol，表明對接結(jié)果良好（圖7 A）。甘草查耳酮A與IL-6、山柰酚與表皮生長因子受體（EGFR）的結(jié)合能最低（分別為-9.1，-9.0 kJ/mol），表明其結(jié)合能力最強(qiáng)。采用Pymol軟件展示其結(jié)合模式（圖7 B和圖7 C），甘草查耳酮A與IL-6在GLN，SER，ASN處形成氫鍵，山柰酚與EGFR在LEU，SER，MET處形成氫鍵，故具有較強(qiáng)的結(jié)合力。

圖7 分子對接圖A.Heat map of molecular docking scoring between the core components and core targets B.Binding pattern diagram of licochalcone A and IL-6 C.Binding pattern diagram of kaempferol and EGFRFig.7 Diagram of molecular docking

3 討論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病理特征為反復(fù)性的關(guān)節(jié)滑膜炎及血管翳，具有較高的致殘率，病因復(fù)雜，通常與激素、環(huán)境、遺傳等因素有關(guān)［9］。本研究中基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共篩選得到藤枝愈痹顆?；钚猿煞?7個，主要包括木犀草素、山柰酚、甘草查耳酮A等。木犀草素能抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠NLRP3炎性小體的高表達(dá)，使VEGF及缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的表達(dá)水平下降，并增加骨組織內(nèi)保護(hù)素的表達(dá)，從而保護(hù)骨關(guān)節(jié)［10］。山柰酚可顯著抑制TNF-α誘導(dǎo)的MAPK活化，進(jìn)而抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的遷移和侵襲［11］。甘草查耳酮能通過增強(qiáng)p62的磷酸化和表達(dá)來激活Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1-核因子E2相關(guān)因子2（Keap1-Nrf2）信號，抑制細(xì)胞增殖和阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)凋亡，抑制促炎細(xì)胞因子分泌，進(jìn)而抑制關(guān)節(jié)炎［12］。毛蕊異黃酮通過激活p62/Nrf2連接的血紅素加氧酶1（HO-1）抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，可顯著抑制IL-6和IL-33的分泌［13］。β-谷甾醇能顯著下調(diào)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型小鼠的炎性細(xì)胞因子，減輕其關(guān)節(jié)腫脹而保護(hù)關(guān)節(jié)［14］。上述活性成分為藤枝愈痹顆?？诡愶L(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的物質(zhì)基礎(chǔ)，對于后續(xù)研究具有重要意義。

PPI及KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，藤枝愈痹顆?？赡芡ㄟ^IL-6，STAT3，AKT1等靶點調(diào)控TNF，IL-17，PI3K/Akt等信號通路，從而發(fā)揮治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用。IL-6為多效應(yīng)細(xì)胞因子，其過度表達(dá)可使機(jī)體免疫功能失衡而處于病理狀態(tài)。研究顯示，IL-6水平的升高可加重患者關(guān)節(jié)腫痛及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病情［15］。TNF-α作為一種前細(xì)胞因子，可促進(jìn)IL-6、趨化因子、前列腺素等的大量分泌，導(dǎo)致類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎炎性反應(yīng)與骨破壞［16］。IL-6可促進(jìn)IL-17的分泌及表達(dá)，使滑膜組織增生，加重骨及軟骨的破壞。研究表明，降低患者血清IL-6及IL-17的表達(dá)水平，可明顯改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的免疫炎性反應(yīng)［17］。STAT3是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵致病因子，可抑制滑膜細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管生成，激活Jun激酶（JNK）/STAT3信號通路，促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎炎性反應(yīng)。研究顯示，通過抑制JNK1和STAT3的磷酸化，可抑制JNK/STAT3信號通路活化，從而對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型大鼠的炎性損傷及骨組織病變起到保護(hù)作用［18］。AKT1被認(rèn)為與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜成纖維細(xì)胞生成有關(guān)。研究顯示，激活A(yù)KT1/STAT3能促進(jìn)B細(xì)胞的增殖與分化，進(jìn)而加重關(guān)節(jié)炎［19］。AKT及其上游基因PI3K共同組成的PI3K/AKT信號通路在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生與發(fā)展中起到了重要作用。研究顯示，通過抑制PI3K/AKT信號的活性，使其下游VEGF的產(chǎn)生及表達(dá)水平降低，抑制滑膜組織血管的生成，進(jìn)而對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎起到治療作用［20］。

綜上所述，藤枝愈痹顆粒通過木犀草素、山柰酚、甘草查耳酮A等成分作用于IL-6，STAT3，AKT1等靶點，從而發(fā)揮治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用，涉及TNF，IL-17，PI3K/AKT等信號通路。