趙方新，李 怡，張 烜，陸景坤，牛 燕，丁 楓，武建強(qiáng)

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

斑馬魚作為動物疾病模型相較于傳統(tǒng)的嚙齒動物模型具有獨(dú)特優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、毒理檢驗(yàn)以及環(huán)境科學(xué)等眾多領(lǐng)域[1]。斑馬魚肝臟的細(xì)胞表型與哺乳動物高度相似，擁有相同的功能，包括膽汁分泌、糖原和脂質(zhì)儲存、胰島素反應(yīng)、異種物質(zhì)和氨代謝等[2]，因此眾多學(xué)者利用斑馬魚作為動物模型在肝病、肝功能等方面進(jìn)行研究。油紅O（Oil Red O，ORO）屬于偶氮染料，具有很強(qiáng)的脂溶性和染脂性，在脂類中的溶解度比在溶劑中大，可與甘油三酯結(jié)合呈小脂滴狀，滴于冰凍組織切片時油紅O 溶于組織內(nèi)的脂質(zhì)（脂滴）中，使其呈橘紅色，因此油紅O 染色技術(shù)可以用來鑒定肝臟組織脂肪沉積情況，具有細(xì)胞定位功能作用，有助于判斷及定性疾病[3，4]。斑馬魚脂肪肝病模型日漸成熟，冰凍切片油紅O 染色技術(shù)更是研究脂肪性肝病的必要選擇，但因斑馬魚肝臟結(jié)構(gòu)與常用嚙齒類動物差別大，體量微小，質(zhì)地薄軟，使用油紅O 染色時斑馬魚肝組織的前處理以及切片厚度、染色時間以及步驟尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。為了今后科研工作中斑馬魚肝臟疾病模型鑒定和研究提供技術(shù)參考，本研究利用斑馬魚肝組織冰凍切片，以探索不同前處理步驟、切片厚度、染色時間等條件下，最佳的斑馬魚肝臟組織油紅O 染色方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 野生AB 型斑馬魚，3 月齡，上海費(fèi)曦生物科技有限公司；4%多聚甲醛，Biosharp；異丙醇等，天津市鑫鉑特化工有限公司；油紅O，蘇木素染液，甘油明膠封片劑，北京索萊寶科技有限公司；OCT 包埋劑，日本櫻花；粘附載玻片，蓋玻片，江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司；冷凍切片機(jī)，臺式顯微鏡等由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 染色液以及脫水溶液的配置 ①油紅O 染色液：稱取油紅O 粉末500 mg 溶于100 ml 異丙醇適度震蕩制成油紅O 飽和儲備液。實(shí)驗(yàn)前取適量儲備液與ddH2O 制成60%染色液。染色前用0.42 μm 針式有機(jī)濾器進(jìn)行過濾后得到實(shí)驗(yàn)染色液[5]（2 h 內(nèi)使用）；②蔗糖脫水液：稱取10 g（20 g，30 g）蔗糖溶解于100 ml 純水中，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 取材 3 月齡野生AB 型斑馬魚，禁食3 d 冰水浴處死，沿斑馬魚泄殖孔向前剪開小口，浸入4%多聚甲醛，4 ℃過夜，第2 天將斑馬魚固定于臺式顯微鏡下，取出肝臟部分浸泡在4%多聚甲醛4 ℃過夜。次日取出，浸入10%蔗糖溶液，組織沉底后轉(zhuǎn)入20%蔗糖溶液，直至在30%蔗糖溶液完成脫水。略吸去水分，OCT 包埋，放入-80 ℃冰箱。

1.2.3 切片 適當(dāng)修塊，肝臟組織露出后，設(shè)置不同厚度連續(xù)切片，粘附載玻片粘取切片。

1.2.4 染色 晾片：染色前冷凍切片在室溫晾干（1 h 或無水氣即可）。前處理：切片浸泡在4%多聚甲醛中固定10 min（或不固定）。油紅O 染色：將切片平放在濕盒中并滴加足量的油紅O 染色液（經(jīng)0.22 μm 針式濾膜過濾器濾過），合蓋停留不同時間（5、10、15 min）。分化：75%酒精、60%異丙醇分化2 s 后ddH2O 漂洗5 s，或直接ddH2O 浸洗30 s。蘇木素染色：切片置于蘇木素中停留不同時間（1、3、5 min）。漂洗：ddH2O 浸泡30 s 去浮色。1%鹽酸酒精分化2 s，流水沖洗2 min返藍(lán)。甘油明膠封片。將切好的冷凍切片分為四組，每組內(nèi)切片來源于同一組織塊。厚度組包含6、8、10、12 μm 四種不同厚度各2 片；其他各組切片厚度均為8 μm，每種不同的處理方法處理2 張切片。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察成片后顯微鏡視野內(nèi)（×200 和×400）組織情況，判斷有無明顯裂痕缺損脫片，橘紅色脂滴染色是否清晰、細(xì)胞邊界是否明顯，整體背景染色情況以及是否可以分辨出深染的細(xì)胞核。

2 結(jié)果

2.1 切片厚度選擇 切片機(jī)分別設(shè)置6、8、10、12 μm，做同樣連續(xù)切片，后執(zhí)行相同的處理步驟。切片厚為5 μm 時，組織脫片以及破裂程度較大，不完整；厚度為8 μm 和10 μm 時，視野中基本沒有脫片和破損，無殘留背景，細(xì)胞中間有深染的細(xì)胞核，細(xì)胞內(nèi)脂滴呈橘紅色，定位清楚，二者沒有明顯差異；當(dāng)厚度為12 μm 時，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，脂滴不清晰，見圖1。因此，斑馬魚肝臟冷東切片的適宜厚度應(yīng)設(shè)置在8～10 μm。

圖1 不同厚度的斑馬魚肝臟冷凍切片的油紅O 染色效果比較（×200）

2.2 染色前處理設(shè)置 取8 μm 的切片分組行不同染色前處理。室溫晾干1 h，經(jīng)4%甲醛固定10 min 后染色的切片，200 倍視野下組織基本完整，無脫落、破裂的情況，染色定位清晰，效果滿意。室溫晾干1 h后無甲醛固定步驟染色的切片，組織輕度脫落、破裂，有均勻分布的空洞，可能影響最終對于脂滴的的判斷。而僅室溫晾到無水氣的切片，無論有無甲醛固定步驟，都有較為明顯的脫片現(xiàn)象，見圖2。

圖2 斑馬魚肝臟冷東切片不同染色前處理效果比較（×200）

2.3 油紅O 染色時間與分化方法的選擇 取8 μm的切片執(zhí)行不同的染色時間（8、10、15 min），每組內(nèi)用不同的分化液（75%乙醇、60%異丙醇、ddH2O）處理。當(dāng)油紅O 染色5 min 時，油紅O 著色均較淺（圖3A、3B、3C）。染色10 min 時，經(jīng)過75%乙醇、60%異丙醇分化后，鏡下可見組織切片中的脂質(zhì)被油紅O染成橘紅色（紅色），細(xì)胞核為藍(lán)紫色，無背景殘留（圖3D、3E），ddH2O 分化30 s 的背景殘留多（圖3F），可見ddH2O 無法洗脫殘留油紅O。相比而言，同一組織的切片，60%異丙醇分化后的脂滴更多，75%酒精分化的脂滴相對更少，75%酒精對脂質(zhì)的洗脫力更強(qiáng)。染色時間延長至15 min 時，三種分化方法均背景著色嚴(yán)重（圖3G、3H、3I）。因此，油紅O染色10 min 后使用60%異丙醇分化效果最好。

圖3 不同染色時間與不同分化方法的效果比較（×200）

2.4 蘇木素染色時間比較 取8 μm 切片，蘇木素染色時間設(shè)置為1、3、5 min，其他步驟相同。蘇木素染色1 min 時（圖4A、4D），細(xì)胞核染色過淺，邊緣模糊不清；蘇木素染色3 min 時（圖4B、4E），細(xì)胞核呈深淺適宜的藍(lán)紫色，輪廓清晰；蘇木素染色5 min 時（圖4C、4F），細(xì)胞核著色加深，油紅O 著色有所減少，因此蘇木素在斑馬魚肝臟冷凍切片的油紅O 染色中設(shè)置為3 min 較為適宜，見圖4。

圖4 斑馬魚肝臟冷凍切片的油紅O 染色中蘇木素染色時間的效果比較

3 討論

近年來，各類型斑馬魚疾病模型以及轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系日漸完善，也因其成?？?、價格便宜、養(yǎng)殖要求低等獨(dú)特的優(yōu)勢被越來越多的研究團(tuán)體和人員使用[6-9]。在研究肝臟疾病、相關(guān)藥物篩選和評價等方面亦是如此，斑馬魚肝臟在細(xì)胞、功能、信號傳導(dǎo)以及疾病的細(xì)胞過程等方面與人類十分相似[10-12]，在基因、蛋白水平上也與人類也具有高度保守性，這使斑馬魚成為研究人類肝臟疾病基本機(jī)制的良好工具。

油紅O 染色法因其性價比高和操作相對簡單，是病理診斷和科研的常用方法，在肝臟疾病，尤其是脂肪性肝病的研究中是必不可少的[13-15]。但與小鼠等動物的肝臟相比，斑馬魚肝臟[16-17]薄而狹長，分為三葉，包繞在腸道外，結(jié)締組織極少，上述特點(diǎn)決定斑馬魚肝臟的質(zhì)地較為軟且脆，因此適合于哺乳動物肝臟冷凍切片油紅O 染色法并不完全適用于斑馬魚肝臟。另外斑馬魚肝臟組織在新鮮狀態(tài)下不易剝離，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將延泄殖孔向前剪開5 mm 左右在4%多聚甲醛中浸泡數(shù)小時后再進(jìn)行解剖更易操作，此時經(jīng)過固定后的肝臟較硬且形狀固定，可以剝出完整的肝臟組織。OCT 包埋時應(yīng)根據(jù)需要調(diào)整位置保證切片時能切到較大面積的肝實(shí)質(zhì)。一般而言，實(shí)驗(yàn)結(jié)束會收取較多樣品組織，不可能在短時間內(nèi)完成切片以及染色等全部步驟，需要冷凍儲存。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不經(jīng)脫水固定的斑馬魚肝臟樣品組織冷凍后再切片會有較大孔洞，且容易出現(xiàn)褶皺破損，這可能與冷凍中產(chǎn)生的冰晶有關(guān)[18]，因此包埋前應(yīng)進(jìn)行10%～30%蔗糖溶液梯度脫水，一般遵循組織塊沉底后轉(zhuǎn)入下一梯度，完成脫水后直接OCT 包埋可儲存在-80 ℃冰箱中隨時取用。因組織塊較小，OCT包埋時應(yīng)根據(jù)需要調(diào)整位置保證切片時能切到較大面積的肝實(shí)質(zhì)。當(dāng)一次性切取較多冷凍切片時，可以將切片保存在-20 ℃冰箱里，經(jīng)過脫水固定處理的組織切片可以保存較長時間，不影響后續(xù)染色效果。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，冰箱中的切片在染色前應(yīng)提前在室溫徹底晾干復(fù)溫1 h，否則易出現(xiàn)脫片破裂等情況。據(jù)研究報道[19]，油紅O 染色步驟說法不一且少有針對斑馬魚肝臟的處理方法。本次實(shí)驗(yàn)設(shè)置不同厚度、不同染色前處理、不同染色時間、不同分化液，對比顯微鏡下效果，得到適合于斑馬魚肝臟的處理步驟：切片厚度8～10 μm，室溫晾干1 h，甲醛（4%）固定10 min，油紅O 染色濕盒滴染10 min，60%異丙醇分化2 s，ddH2O 浸洗浸泡5 s 后，蘇木素染色3 min，ddH2O 浸泡30 s 去浮色，1%鹽酸酒精分化2 s，流水沖洗2 min 返藍(lán)，甘油明膠封片。此方法步驟簡單，耗時短，切片染色效果好，可快速簡便的獲得滿意的斑馬魚肝臟冷凍油紅O 染色片。

綜上所述，本次優(yōu)化的斑馬魚油紅O 染色方法可以較為清晰地顯示肝臟脂滴，可辨別細(xì)胞核輪廓位置，進(jìn)而對斑馬魚肝病模型中的脂肪變性情況進(jìn)行定位與半定量的分析。