蒲 丹

（宜賓市第二人民醫(yī)院/四川大學(xué)華西醫(yī)院宜賓醫(yī)院病理科，四川 宜賓 644000）

宮頸癌（cervical cancer）系女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，位居全球女性癌癥死因第2 位。近年來，隨著生活方式的改變及社會觀念的更新，宮頸癌檢出率相對增高，且患病年齡呈年輕化趨勢[1]。腫瘤生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，宮頸上皮內(nèi)瘤樣變（CIN）是宮頸癌發(fā)生的重要癌前病變，多數(shù)呈漸進式發(fā)展，如若為進行治療或干預(yù)經(jīng)過數(shù)年可進展為宮頸癌[2]。因此，宮頸上皮內(nèi)瘤樣變的組織特性與宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)。高危型人乳頭瘤病毒（HPV）感染和多種致病基因表達異常在宮頸癌前病變中發(fā)揮重要作用[3]。半乳糖凝集素-3（Galectin-3）是凝集素家族成員，調(diào)控細胞間黏附、轉(zhuǎn)移、血管生成、凋亡與免疫耐受等行為[4]。血管新生是原位腫瘤細胞和轉(zhuǎn)移部位生長的必要條件，也是靶器官定位和循環(huán)血液轉(zhuǎn)移的重要因素[5]。研究證實[6]，Galectin-3 可激活N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶Ⅴ，繼而導(dǎo)致血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）-2 磷酸化，促進血管新生。有學(xué)者認為，Galectin-3 高表達在宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[7]。但也有學(xué)者持反對意見，認為Galectin-3在正常宮頸及慢性宮頸炎組織中呈強陽性表達，而在宮頸癌前病變及浸潤性癌中呈遞減趨勢[8]。因此，Galectin-3 表達水平與宮頸癌的發(fā)生關(guān)系還需要深入分析。此外，腫瘤的細胞周期改變在疾病的發(fā)生中同樣起重要作用。P27 kip1 蛋白是多功能周期素依賴激酶抑制劑，通過抑制cyclinD-CDK 4 和cyclinE-CDK 2 等復(fù)合物活性，使細胞停滯在G1期，減少G1/S 期轉(zhuǎn)換[9]，影響細胞分化和凋亡，抑制細胞增殖[10]。另有研究認為[11]，P27 kip1 蛋白表達下調(diào)可能成為早期診斷宮頸癌和預(yù)后評估的敏感性指標?；诖?，該研究重點分析宮頸癌前病變組織中Galectin-3 和P27 kip1 蛋白的表達與臨床預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2017 年1 月-2018 年1 月宜賓市第二人民醫(yī)院/四川大學(xué)華西醫(yī)院宜賓醫(yī)院診斷CIN 患者共74 例，均經(jīng)宮腔鏡活檢，病理確診。其中CINⅠ20 例，CINⅡ24 例，CINⅢ30 例，分別設(shè)為CINⅠ組，CINⅡ組，CINⅢ組；CINⅠ組年齡45～66 歲，平均年齡（51.20±8.60）歲，高危HPV 感染8例（40.00%）；CINⅡ組年齡44～68 歲，平均年齡（53.20±7.90）歲，高危HPV 感染12 例（50.00%）；CINⅢ組年齡46～52 歲，平均年齡（52.60±6.80）歲，高危HPV 感染17 例（56.67%）；三組患者年齡以及高危HPV 感染率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），研究可比。該研究取得患者知情同意，并獲得宜賓市第二人民醫(yī)院/四川大學(xué)華西醫(yī)院宜賓醫(yī)院倫理協(xié)會審批，采用宮頸錐切或根治術(shù)治療，未行放化療。

1.2 方法 采用免疫組化染色法檢測組織中Galectin-3 和P27 kip1 蛋白的陽性表達，PCR 和Western blot 法檢測Galectin-3 和P27 kip1、VEGF-2和cyclinD 的mRNA 和蛋白的定量表達水平。常規(guī)制作組織切片，厚度5 μm，-80 ℃保存。隨訪時間10～23 個月，中位時間16.5 個月，比較復(fù)發(fā)率。

1.2.1 免疫組化染色法 ①將石蠟切片脫蠟至水，PBS 浸泡5 min，滴加3% H2O2溶液，于室溫下孵育10 min，以滅活內(nèi)源性H2O2酶；②PBS 進行洗滌3×3 min，滴加正常山羊血清工作液封閉抗體，室溫下孵育10 min；③倒去血清，不要清洗，滴加鼠抗人Galectin-3 和P27 kip1 單克隆抗體及內(nèi)參β-actin一抗（美國Sigma 公司，1∶2000），于濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜；④PBS 洗滌3×3 min，滴加生物素標記的兔抗鼠IgG 二抗（美國Sigma 公司，1∶500），37 ℃孵育20 min；⑤PBS 洗滌3×3 min，滴加適量SABC 液（江蘇碧云天科技有限公司），37 ℃孵育20 min；⑥PBS 洗滌3×3 min，DAB 顯色，顯微鏡下控制顯色程度，3～10 min，蒸餾水充分沖洗、復(fù)染、封固。結(jié)果根據(jù)染色強度和陽性細胞百分比，采用半定量法表示，即胞漿或胞核黃染至深棕色為染色陽性，陰性計0 分、+計1 分、++計2 分、+++計3 分，陽性細胞百分比≤5%計0 分、6%～25%計1 分、26%～50%計2 分、51%～75%計3 分、＞75%計4 分；兩項乘積0～3 為陰性，4～12 為陽性。

1.2.2 RT-PCR 法 ①在液氮中研碎組織，予每50～100 mg 組織加入1 ml Trizol 試劑，勻漿組織；吸去培養(yǎng)液，PBS 洗滌，在培養(yǎng)板上加入Trizol 裂解細胞，于6 孔板上每孔加入1 ml，移液器吹打；②室溫放置5 min，以Trizol 和氯仿比例1∶0.2 混勻，室溫放置3 min；4 ℃5000 r/min 離心15 min，樣品分3層，取上層無色水相RNA 混合液；③吸取400～600 μl 液體至EP 管，以Trizol 和異丙醇比例1∶0.5沉淀RNA，混勻室溫放置10 min；再次離心取沉淀，加入75%乙醇洗滌RNA 沉淀，再次離心棄上清；室溫干燥RNA 沉淀，加入25～100 μl 無RNase水促溶，紫外分光光度計測定濃度后，-20 ℃保存；④根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒提示合成cDNA，上海生工有限公司根據(jù)Gene Bank 序列合成引物序列，表1 所示反應(yīng)體系為cDNA 2 μl+正逆向引物各1 μl+Taq聚合酶0.5 μl+dNTPs 0.5 μl+MgCl21 μl+10×Buffer 2.5 μl，加水至25 μl。反應(yīng)條件為94 ℃2 min、94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃30 s，共30 個循環(huán)，72 ℃7 min，4 ℃保溫；⑤根據(jù)產(chǎn)物長度選擇對應(yīng)濃度的瓊脂糖凝膠，取適量PCR 產(chǎn)物與上樣緩沖液混合，電泳參數(shù)為電壓120 V，電流60 mA，時間45～60 min，凝膠成像分析系統(tǒng)成像，數(shù)碼照相行灰度值分析。

表1 各引物序列

1.2.3 Western blot 法 病灶組織勻漿后加RIPA 裂解液（北京中杉金橋生物有限公司）提取細胞總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒（美國Sigma 公司）測定蛋白濃度，經(jīng)內(nèi)參β-actin 抗體劑量標準化。取30 μg總蛋白，8%SDS-PAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜；然后加鼠抗人Galectin-3 和P27 kip1、VEGF-2和cyclinD 一抗（1∶2000，美國Sigma 公司）靜置過夜，PBS 洗滌后加兔抗鼠二抗（1∶500，美國Sigma 公司）室溫孵育4 h；PBS 洗滌，ECL 顯色。結(jié)果掃描保存，Lab Works4.5 凝膠成像軟件行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以（）表示，行單因素ANOVA 分析，進一步比較采用LSD-t法檢驗；計數(shù)資料采用[n（%）]表示，行χ2檢驗；P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色結(jié)果 CINⅢ組患者Galectin-3 陽性表達率高于CINⅠ組和Ⅱ組，而P27 kip1 則相反，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1、表2。

表2 免疫組化染色Galectin-3 和P27kip1 蛋白的陽性表達率[n（%）]

圖1 免疫組化染色CIN 組織（×400）

2.2 PCR 結(jié)果 CINⅢ組患者Galectin-3、VEGF-2和cyclinD 的mRNA 定量表達水平高于其他兩組，P27 kip1 低于其他兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 PCR 結(jié)果（）

表3 PCR 結(jié)果（）

2.3 Galectin-3、P27 kip1、VEGF-2 和cyclinDmRNA水平的相關(guān)分析 對Galectin-3、P27 kip1、VEGF-2和cyclinD 的mRNA 定量表達水平進行Pearson 相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，Galectin-3 與VEGF-2 和cyclinD 呈正相關(guān)，P27 kip1 與VEGF-2 和cyclinD 呈負相關(guān)，Galectin-3 與P27 kip1 呈負相關(guān)（P＜0.05），見表4。

表4 Galectin-3、P27 kip1、VEGF-2 和cyclinDmRNA 水平的相關(guān)分析

2.4 Western blot 結(jié)果 CIN Ⅲ組患者Galectin-3、VEGF-2 和cyclinD 的蛋白定量表達水平高于其他兩組，P27 kip1 低于其他兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表5。

表5 Western blot 結(jié)果（）

表5 Western blot 結(jié)果（）

2.5 Galectin-3、P27 kip1、VEGF-2 和cyclinD 蛋白水平的相關(guān)分析 對Galectin-3、P27 kip1、VEGF-2和cyclinD 的蛋白定量表達水平進行Pearson 相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，Galectin-3 與VEGF-2 和cyclinD 呈正相關(guān)，P27 kip1 與VEGF-2 和cyclinD 呈負相關(guān)，Galectin-3 與P27 kip1 呈負相關(guān)（P＜0.05），見表6。

表6 Galectin-3、P27 kip1、VEGF-2 和cyclinD 蛋白水平的相關(guān)分析

2.6 隨訪復(fù)發(fā)率 隨訪CINⅠ組復(fù)發(fā)1 例（5.00%），CINⅡ組復(fù)發(fā)3 例（12.50%），CINⅢ組復(fù)發(fā)11 例（36.67%），以復(fù)發(fā)為終點事件繪制生存曲線，見圖2。CINⅢ組復(fù)發(fā)率高于CINⅠ組和CINⅡ組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.055、5.123，P＜0.05）；隨訪共復(fù)發(fā)15 例，其中Galectin-3 陽性11 例，陰性4 例，Galectin-3 陽性表達患者復(fù)發(fā)率高于陰性表達患者[32.35%（11/34）vs10.00%（4/40），χ2=5.682，P=0.017]；P27 kip1 陽性3 例，陰性12 例，P27 kip1 陰性表達患者復(fù)發(fā)率高于陽性表達患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義[35.29%（12/34）vs7.50%（3/40），χ2=8.785，P=0.003]。

圖2 三組復(fù)發(fā)為終點的生存曲線

3 討論

惡性腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移是影響腫瘤細胞治療和預(yù)后的重要因素。因此，了解影響和調(diào)節(jié)惡性腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的因素及其機制，對于腫瘤的早期診斷和預(yù)后具有重要意義。Galectin-3 廣泛表達于正常組織和腫瘤組織中，參與細胞生長與分化、凋亡、粘附、血管新生、浸潤和轉(zhuǎn)移等[12]。以往研究表明[13，14]，Galectin-3 表達上調(diào)與胃癌、結(jié)直腸癌、肝癌、胰腺癌和食管癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，同時，Wang L 等[6]研究也證實，Galectin-3 上調(diào)與宮頸癌轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移有關(guān)。細胞周期改變在腫瘤形成過程中也發(fā)揮重要作用，P27kip1 蛋白是多功能周期素依賴激酶抑制劑，可抑制cyclinD、CDK 4 等活性，使細胞停滯在G1期，減少G1/S 期轉(zhuǎn)換，抑制細胞增值[9]。

本研究結(jié)果顯示，CINⅢ組患者Galectin-3 陽性表達率高于CINⅠ和Ⅱ組，而P27 kip1 則相反，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明CIN 分期越高，Galectin-3 陽性率越高，P27 kip1 越低，臨床上80%以上宮頸癌是由CIN 進展而來。因此，研究CIN 的組織特性對分析宮頸癌的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。Galectin-3 基因定位于人染色體14q21～22，含有1個特殊嵌合體結(jié)構(gòu)，可導(dǎo)致腫瘤表面黏蛋白1 構(gòu)象改變，暴露黏附分子CD44 和配體位，在體內(nèi)外均可誘導(dǎo)T 細胞凋亡，發(fā)生免疫逃逸，促使腫瘤細胞的黏附和轉(zhuǎn)移[15，16]。此外，Galectin-3 能夠抑制腫瘤壞死因子如CD95 誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡，對放化療產(chǎn)生耐受性[17]。研究顯示[18]，Galectin-3 陽性表達與宮頸癌患者的盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與較差的預(yù)后相關(guān)。CIN Ⅲ組患者Galectin-3、VEGF-2 和cyclinD 的mRNA 和蛋白的定量表達水平高于其他兩組，P27 kip1 低于其他兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Galectin-3 主要表達于細胞質(zhì)，也可表達于細胞核及細胞膜上。VEGF 與其受體結(jié)合后，激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進血管及淋巴管生成，為腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移提供物質(zhì)基礎(chǔ)[19]。唐瑤等[20]研究發(fā)現(xiàn)，宮頸鱗癌患者血清VEGF 及其受體水平明顯高于健康對照組，證實VEGF 在宮頸癌患者體內(nèi)表達水平升高。經(jīng)Pearson 相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，Galectin-3 與VEGF-2 和cyclinD mRNA 和蛋白表達呈正相關(guān)，P27 kip1 與VEGF-2 和cyclinD 呈負相關(guān)，Galectin-3 與P27 kip1呈負相關(guān)（P＜0.05）。P27 kip1 蛋白有抑制細胞增生分裂及促進分化成熟的功能，其通常在中層和表層上皮細胞的細胞核中表達，而在增生活躍的基底層細胞中表達較少，甚至無表達。HPV 的基因產(chǎn)物在G1期釋放大量的轉(zhuǎn)錄因子，激活S 期所需的基因表達，產(chǎn)生多種細胞周期運行所需要的蛋白質(zhì)如cyclinE等，cyclinE 與P27 kip1 結(jié)合可誘導(dǎo)HPV 基因產(chǎn)物降解[21]。因此，P27 kip1 蛋白表達下調(diào)既可能與HPV感染有關(guān)，也可能是細胞周期調(diào)控紊亂的結(jié)果[22]。由此分析，上述指標間可能存在協(xié)同作用，如Galectin-3 與VEGF-2 和cyclinD 可協(xié)同促進宮頸癌的發(fā)生，而P27 kip1 則起拮抗作用。影響宮頸癌發(fā)生的分子可能較多，如何篩選具有高效表達的活性分子對宮頸癌的機制研究和臨床靶向干預(yù)有極為重要的意義。

進一步隨訪發(fā)現(xiàn)，CINⅢ組復(fù)發(fā)率高于其他兩組，并且Galectin-3 陽性表達患者復(fù)發(fā)率高于陰性表達患者，P27 kip1 陰性表達患者復(fù)發(fā)率高于陽性表達患者（P＜0.05），表明Galectin-3 高表達可能是宮頸癌發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后不良的危險因素，而P27 kip1則發(fā)揮保護作用。因此推斷CIN 組織Galectin-3 表達上調(diào)和P27 kip1 表達下調(diào)與腫瘤進展的聯(lián)系，涉及血管新生、細胞黏附、凋亡抑制、免疫逃逸、HPV 感染及細胞周期調(diào)控等多種機制，這一結(jié)論為宮頸癌的早期診斷及預(yù)后評估提供了重要參考指標，其臨床應(yīng)用價值還需要進一步驗證。