秦宇蒙，王艷麗，周笑犁, ，董平坤，吳棟斐

（1.貴陽(yáng)學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550005；2.貴州省普通高等學(xué)校功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550005）

微生物酵素是指含有豐富的維生素、礦物質(zhì)、酶和次生代謝產(chǎn)物等營(yíng)養(yǎng)成分的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品，一般以一種或多種新鮮水果、蔬菜、菌菇、中草藥等為原料，經(jīng)多種有益菌發(fā)酵而得，具有抗菌、抗氧化、提高免疫力、保護(hù)心血管以及抑制肥胖等作用。由于發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的微生物代謝過(guò)程，通過(guò)其自身的物質(zhì)代謝，使發(fā)酵原料在分子水平上發(fā)生分解和結(jié)構(gòu)改變，產(chǎn)生了復(fù)雜的中間代謝或交叉代謝產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)之間的代謝轉(zhuǎn)化，從而產(chǎn)生新的生物活性成分，并代謝產(chǎn)生多種生物酶等。目前對(duì)于酵素的研究大多關(guān)于其發(fā)酵工藝的優(yōu)化，生物活性的探究，發(fā)酵過(guò)程中微生物群落的動(dòng)態(tài)變化以及代謝物質(zhì)的研究。如，以酵母菌和植物乳桿菌等菌株發(fā)酵棗汁或荔枝等果蔬汁，均發(fā)現(xiàn)發(fā)酵能影響其功效酶活性及其生物活性物質(zhì)；在蘋(píng)果酒發(fā)酵過(guò)程中，-葡萄糖苷酶、果膠酶和蛋白酶活性與其中酯類(lèi)物質(zhì)、醇類(lèi)物質(zhì)、酸類(lèi)物質(zhì)以及醛酮類(lèi)物質(zhì)的含量具有很強(qiáng)的相關(guān)性，說(shuō)明果蔬經(jīng)過(guò)微生物代謝酶催化碳水化合物等前體物質(zhì)的水解可以影響發(fā)酵產(chǎn)品的風(fēng)味類(lèi)型與強(qiáng)度。但對(duì)于果蔬自然發(fā)酵過(guò)程的代謝規(guī)律研究還較少，目前主要對(duì)蘋(píng)果、枇杷等果蔬自然發(fā)酵開(kāi)展了生物活性物質(zhì)變化規(guī)律等研究，而對(duì)于果蔬自然發(fā)酵過(guò)程中功效酶變化規(guī)律的全面評(píng)價(jià)還鮮有報(bào)道。

本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)番茄酵素在自然發(fā)酵過(guò)程中的微生物區(qū)系和理化特性進(jìn)行了探究，發(fā)現(xiàn)不同階段發(fā)酵液中均涵蓋了細(xì)菌和真菌兩大類(lèi)，且以細(xì)菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而細(xì)菌中優(yōu)勢(shì)菌主要包括乳桿菌屬、明串珠菌屬和魏斯氏屬等；且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，活性物質(zhì)和抗氧化能力發(fā)生了顯著性變化。但是這些變化規(guī)律是否與發(fā)酵體系中的代謝酶的活性強(qiáng)弱具有一定的關(guān)聯(lián)性，因此，番茄酵素自然發(fā)酵過(guò)程中功效酶的動(dòng)態(tài)變化亟待進(jìn)一步探究。本研究以番茄自然發(fā)酵液為研究對(duì)象，分析其在發(fā)酵過(guò)程中淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、脂肪酶、蛋白酶、超氧化物歧化酶的活力及其變化規(guī)律，以期為闡明番茄酵素功能活性機(jī)理和綜合開(kāi)發(fā)利用提供相關(guān)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮小番茄、白砂糖 購(gòu)自沃爾瑪超市；三羥甲基氨基甲烷、三氯乙酸、TritonX-100、亞硫酸鈉、羥甲基纖維素鈉、果膠、沒(méi)食子酸 分析純，天津鼎盛鑫華化工有限公司；冰醋酸、三水合乙酸鈉、結(jié)晶酚、醋酸鈉、半乳糖醛酸 分析純，上海麥坤化工有限公司；碳酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、無(wú)水乙醇、氫氧化鈉、硼酸鈉、3，5-二硝基水楊酸 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；對(duì)硝基苯酚、對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯、氯化鈉、酒石酸鉀鈉分析純，天津市北辰方正試劑廠。

FA124 型電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C pH 計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器有限公司；UV-2550 型紫外可見(jiàn)光度計(jì) 濟(jì)南海能儀器股份有限公司；TCL-16A 型冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；AA605112 型恒溫水浴鍋 上海梅香儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 番茄發(fā)酵液的制備與取樣 將處理好的新鮮番茄與白砂糖按質(zhì)量比3:1 的比例放入滅菌發(fā)酵罐中，于室溫下避光固態(tài)發(fā)酵90 d，發(fā)酵前期每天上下翻轉(zhuǎn)搖晃玻璃瓶使白砂糖均勻融化，定期排氣防止脹罐，然后取0、10、20、30、60、90 d 的發(fā)酵液用于酶活力的測(cè)定。

1.2.2 酶提取液的制備 稱取適量樣品，研磨成勻漿后用磷酸鹽緩沖液稀釋，然后于4000 r/min 離心15 min，收集上清液，即為酶提取液。

1.2.3 淀粉酶活性的測(cè)定 參考陳爽等的方法。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別吸取0、0.2、0.6、1.0、1,4、1.8、2.0 mL 的1 mg/mL 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液于試管中，加入蒸餾水使溶液體積至2 mL，最后向每支試管加入2 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑。置于沸水浴中煮沸5 min，冷卻后加蒸餾水至20 mL，在波長(zhǎng)540 nm 處測(cè)吸光度值。以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

淀粉酶活力的測(cè)定：試管A（對(duì)照）：1 mL 淀粉酶提取液（沸水浴，5 min）+1 mL 1%淀粉溶液（50 ℃，5 min）+2 mL DNS 試劑（沸水浴，5 min）+蒸餾水至20 mL；試管B（樣品）：1 mL 淀粉酶提取液+1 mL 1%淀粉溶液（50 ℃，5 min）+2 mL DNS 試劑（沸水浴，5 min）+蒸餾水至20 mL。每個(gè)樣品做三個(gè)平行，均于540 nm 處測(cè)吸光度值。

式中，m為反應(yīng)體系中麥芽糖含量，mg；V為淀粉酶提取液總體積，mL；T 為酶促反應(yīng)時(shí)間，min；V為酶促反應(yīng)時(shí)消耗的淀粉酶提取液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 纖維素酶活性的測(cè)定 參照QB 2583-2003纖維素酶制劑羧甲基纖維素-還原糖酶活力（CMCADNS）測(cè)定法。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 的1 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于試管中，加入蒸餾水使溶液體積至2 mL，最后向每支試管加入1.5 mL 3,5-二硝基水楊酸試劑。將試管置于沸水浴中煮沸5 min，冷卻后加蒸餾水至25 mL，在波長(zhǎng)540 nm 處測(cè)吸光度值。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

纖維素酶活性的測(cè)定：試管A（對(duì)照）：0.5 mL 纖維素酶提取液（沸水浴，5 min）+1.5 mL 10 mg/mL CMC-Na（50 ℃水浴保溫30 min）+1.5 mL DNS 試劑（沸水浴，5 min）+蒸餾水至25 mL；試管B：0.5 mL纖維素酶提取液+1.5 mL 10 mg/mL CMC-Na（50 ℃水浴保溫30 min）+1.5 mL DNS 試劑（沸水浴，5 min）+蒸餾水至25 mL。每個(gè)樣品做三個(gè)平行，均于540 nm處測(cè)吸光度值。

式中，m為反應(yīng)體系中葡萄糖含量，mg；V為纖維素酶提取液總體積，mL；T 為酶促反應(yīng)時(shí)間，min；V為酶促反應(yīng)時(shí)消耗的纖維素酶提取液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.5 果膠酶活性的測(cè)定 參考Oliveira 等所報(bào)道的方法。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別吸取0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2 mL 的1 μg/mL 半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，加入pH 為5.0 醋酸鹽緩沖液，使溶液體積至4 mL，最后向每支試管加入2 mL DNS 試劑。將試管置于沸水浴中煮沸5 min，冷卻后加磷酸鹽緩沖液至20 mL，在波長(zhǎng)540 nm 處測(cè)吸光度值。以半乳糖醛酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

果膠酶活力的測(cè)定：取酶提取液0.2 mL，加0.5% pH 4.0 果膠溶液3.8 mL，37℃恒溫反應(yīng)30 min后加入2.5 mL DNS 試劑，沸水浴5 min，冷水浴至室溫后用緩沖液定容至25 mL。取10 mL 定容待測(cè)樣液于離心管中，10000 r/min 離心5 min，離心完后立即轉(zhuǎn)入預(yù)凍處理過(guò)的EP 管內(nèi)，放入盛放生物冰袋采樣箱內(nèi)于波長(zhǎng)540 nm 測(cè)吸光值，每個(gè)樣品做三個(gè)平行。

式中，m為反應(yīng)體系中半乳糖醛酸含量，μg；V為果膠酶提取液總體積，mL；T 為酶促反應(yīng)時(shí)間，min；V為酶促反應(yīng)時(shí)消耗的果膠酶提取液體積mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.6 脂肪酶活性的測(cè)定 對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液用無(wú)水乙醇溶液稀釋成適當(dāng)?shù)奶荻?，加? mL 0.5 mol/L 的三氯乙酸混合，再加入15 mL 0.5 mol/L NaOH 調(diào)pH，直至pH 與加酸前一致，分別測(cè)定吸光度。

脂肪酶活力的測(cè)定：取4 mL p-NPP 底物溶液，37 ℃預(yù)熱5 min 后加入1 mL 脂肪酶提取液，反應(yīng)10 min 后立即加入5 mL 0.5 mol/L 的三氯乙酸混合均勻，放置5 min 終止反應(yīng)，再加入15 mL 0.5 mol/L NaOH 調(diào)pH，直至pH 與反應(yīng)前一致，用1 mL 蒸餾水替換作為對(duì)照，于410 nm 測(cè)定吸光度。

式中，C 由標(biāo)曲查得的對(duì)硝基苯酚濃度，μmol/L；V為酸堿度調(diào)節(jié)后的反應(yīng)液總體積mL；V為樣品處理液總體積，mL；T 為酶促反應(yīng)時(shí)間，min；V為酶促反應(yīng)時(shí)消耗的脂肪酶提取液體積，mL；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.2.7 蛋白酶活性的測(cè)定 參照GB/T 23527-2009《蛋白酶制劑》中的福林法進(jìn)行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：分別配制0、10、20、30、40、50 μg/mL L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取上述溶液1 mL，加入5 mL 碳酸鈉和1 mL 福林酚試劑，振蕩均勻，置于37 ℃水浴中顯色20 min，以蒸餾水代替酪氨酸作為空白對(duì)照，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)680 nm 下測(cè)定其吸光度。以酪氨酸的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

蛋白酶活性的測(cè)定：取1 mL 蛋白酶提取液，加入酪蛋白溶液1 mL 搖勻，在37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)10 min 后，加入2 mL 三氯乙酸，搖勻靜止10 min后過(guò)濾，取1mL 濾液加碳酸鈉溶液5 mL 和1 mL 福林酚試劑，在37 ℃水浴中顯色20 min，用1 mL 蒸餾水替換酶提取液作為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)680 nm 處測(cè)定吸光度。

1.2.8 超氧化物歧化酶活性的測(cè)定 在堿性條件下，鄰苯三酚會(huì)發(fā)生自氧化，可根據(jù)SOD 抑制鄰苯三酚自氧化能力測(cè)定SOD 酶活力，具體測(cè)量方法參照GB/T 5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性》。

鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定：在試管中加入2.35 mL Tris-HCl 緩沖液、0.1 mL 蒸餾水和0.7 mL 鄰苯三酚溶液，然后渦旋處理3 s，立即將混合液在325 nm 波長(zhǎng)條件下讀取30 s 吸光值。

樣品抑制鄰苯三酚自氧化速率測(cè)定：冰浴保存的樣品放入25 ℃水浴鍋中水浴3 min 后避光保存。以鄰苯三酚自氧化速率實(shí)驗(yàn)為參比，于25 ℃環(huán)境中，向離心管中加入2.35 mL Tris-HCl 緩沖液，0.1 mL 酶提取液，0.7 mL 鄰苯三酚溶液，渦旋處理3 s。立即將混合液在325 nm 波長(zhǎng)條件下讀取吸光值。

式中：△A為鄰苯三酚自氧化速率；△A′為SOD 酶液抑制鄰苯三酚自氧化速率；4.5 為反應(yīng)液總體積mL；V為所加樣液體積，mL；V為樣液總體積，mL；n 為樣液的稀釋倍數(shù)；m 為樣品質(zhì)量，g。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（ANOVA）和SPSS 25.0 軟件進(jìn)行單次實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)性狀分析，采用Duncan 多重極差法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，確定各試驗(yàn)數(shù)據(jù)性狀的顯著性（＜0.05），采用Excel 2016 軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄酵素自然發(fā)酵過(guò)程中淀粉酶活力的變化

由圖1 可知，番茄酵素在發(fā)酵0～30 d 時(shí)其淀粉酶活力變化較小，隨后其活力顯著上升（＜0.05），在發(fā)酵第90 d 時(shí)酶活達(dá)到了79.289 U/g。有研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中過(guò)高的可溶性固形物含量具有較高的滲透壓，對(duì)微生物活力具有一定的抑制作用，從而影響代謝酶的積累。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，番茄酵素發(fā)酵過(guò)程中可溶性固形物含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，這可能有助于淀粉酶的產(chǎn)生。并且番茄酵素在發(fā)酵后期，酵母菌逐步成為了真菌中的優(yōu)勢(shì)菌，它在分解多糖時(shí)需要在細(xì)胞水平將碳水化合物分解為雙糖，才能被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)部，并在細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)一步降解為單糖，在這一過(guò)程中酵母菌是通過(guò)在環(huán)境中分泌生物胞外酶來(lái)實(shí)現(xiàn)代謝的。因此，在番茄發(fā)酵后期淀粉酶活力驟然升高。

圖1 淀粉酶活力變化Fig.1 Change of amylase activity

2.2 番茄酵素自然發(fā)酵過(guò)程中纖維素酶活力的變化

由圖2 可知，在番茄酵素自然發(fā)酵的過(guò)程中，纖維素酶活力逐漸上升（＜0.05），并于發(fā)酵第90 d 達(dá)到38.180 U/g。其變化趨勢(shì)與淀粉酶的變化趨勢(shì)相近，可能是由于在發(fā)酵中后期，發(fā)酵體系中的碳源不足以維持菌種的生命活動(dòng)，促使產(chǎn)酶微生物代謝產(chǎn)生了糖類(lèi)水解酶，使得纖維素酶得以快速累積。并且前期研究也發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過(guò)程中能產(chǎn)生纖維素酶的曲霉屬相對(duì)豐度也有所增加，這與纖維素酶活力的遞增形成相互佐證。

圖2 纖維素酶活力變化Fig.2 Change of cellulase activity

2.3 番茄酵素自然發(fā)酵過(guò)程中果膠酶活力的變化

果膠酶作為一類(lèi)分解果膠質(zhì)的酶，它可以協(xié)同纖維素酶破壞植物的細(xì)胞壁，促進(jìn)有效成分的溶出。由圖3 可知，果膠酶活力在番茄酵素自然發(fā)酵的不同階段存在顯著性差異（＜0.05），隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活呈先上升后下降的趨勢(shì)，且均高于發(fā)酵前（＜0.05），并于20 d 達(dá)到了最大值（3.733 U/g）。本團(tuán)隊(duì)在前期研究發(fā)現(xiàn)，能夠產(chǎn)生果膠酶的青霉屬與假單胞菌屬為發(fā)酵前的優(yōu)勢(shì)菌屬，其在適宜的環(huán)境大量產(chǎn)生果膠酶，使得果膠酶在發(fā)酵前期具有較高的酶活力。而隨著發(fā)酵進(jìn)行，發(fā)酵環(huán)境發(fā)生改變，微生物之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，使其產(chǎn)果膠酶相關(guān)微生物的數(shù)量減少，且在發(fā)酵過(guò)程中，隨著體系pH 逐漸降低，通過(guò)引起細(xì)胞膜電荷的變化，從而影響著微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，使得代謝過(guò)程中酶活發(fā)生了改變，因此在發(fā)酵30 d 后體系中果膠酶活力出現(xiàn)了降低的現(xiàn)象。微生物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中會(huì)不斷向外分泌胞外酶，用以分解外界復(fù)雜的有機(jī)物，從而獲取有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。其中較重要的是與多糖降解相關(guān)的酶，如淀粉酶、纖維素酶和果膠酶等。本研究發(fā)現(xiàn)，淀粉酶、纖維素酶和果膠酶活力都較發(fā)酵前高，因此酵素體系中的微生物可以很好的將大分子糖類(lèi)進(jìn)行水解，而某些微生物可以利用低分子糖類(lèi)生成醇和酸，從而使得體系的酒精度和pH 發(fā)生變化。

圖3 果膠酶酶活力變化Fig.3 Change of pectinase activity

2.4 番茄酵素自然發(fā)酵過(guò)程中脂肪酶活力的變化

番茄自然發(fā)酵過(guò)程中脂肪酶活性變化如圖4 所示。番茄酵素自然發(fā)酵過(guò)程中脂肪酶活力最大值為0.856 U/g，活力較其他酶活低，該結(jié)果與蘋(píng)果酵素、水果酵素等一致。這可能因?yàn)檫@些酵素的發(fā)酵原料為脂肪含量較少的果蔬，以至于微生物代謝產(chǎn)生的脂肪酶較少。番茄酵素發(fā)酵過(guò)程中脂肪酶活力在0～60 d 呈現(xiàn)較平穩(wěn)的上升趨勢(shì)，并在第60 d 取得最大值，其原因可能是發(fā)酵過(guò)程中番茄酵素的發(fā)酵體系適宜產(chǎn)脂肪酶微生物進(jìn)行生長(zhǎng)代謝，使得發(fā)酵后的脂肪酶活力提高。然而隨著發(fā)酵進(jìn)行到90 d 時(shí)，其活性顯著下降（＜0.05）。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)番茄酵素在發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌種，使得體系pH 下降至3.3，整體呈酸性，而脂肪酶的最適pH 在中性或堿性范圍內(nèi)。因此，在發(fā)酵后期，其活性顯著降低。

圖4 脂肪酶活力變化Fig.4 Change of lipase activity

2.5 番茄酵素自然發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶活力的變化

蛋白酶是一類(lèi)具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)并能夠催化蛋白質(zhì)水解生成多肽及小分子氨基酸的酶，來(lái)源廣泛，在動(dòng)植物細(xì)胞及微生物的新陳代謝和調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用。由圖5 可知，番茄酵素自然發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶活力變化規(guī)律較為復(fù)雜，在發(fā)酵0～60 d 時(shí)呈波動(dòng)變化，在發(fā)酵90 d 時(shí)其活力驟然上升至45.6 U/g（＜0.05）。有研究發(fā)現(xiàn)，蘋(píng)果酵素自然發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶活力隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸升高趨勢(shì)，并于發(fā)酵60 d 后趨于穩(wěn)定，香蕉酵素自然發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶活力呈先上升后下降的趨勢(shì)，由此可知酵素采用不同原料進(jìn)行發(fā)酵時(shí)蛋白酶活力的變化規(guī)律存在一定差異。番茄酵素在發(fā)酵前期呈波動(dòng)變化，可能原因是0～60 d 酵素中產(chǎn)生蛋白酶的微生物和其他菌種之間存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，并且發(fā)酵前期菌種不斷產(chǎn)酸，pH 的下降對(duì)蛋白酶活性存在影響，但在60 d 之后，體系逐漸形成了優(yōu)勢(shì)菌種且環(huán)境趨于穩(wěn)定，使得蛋白酶活力迅速增加。

圖5 蛋白酶活力變化Fig.5 Change of protease activity

2.6 番茄酵素自然發(fā)酵過(guò)程中超氧化物歧化酶活力的變化

番茄酵素不同發(fā)酵階段的SOD 酶活力變化規(guī)律如圖6 所示。SOD 酶活力在0～20 d 時(shí)呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)（＜0.05），隨后變化緩慢，在發(fā)酵60 d 時(shí)趨于最大。賈麗麗等發(fā)現(xiàn)，SOD 酶活力與生物量變化之間呈現(xiàn)顯著正相關(guān)。由此推測(cè)，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，微生物增加，有利于SOD 酶的產(chǎn)生。但是在發(fā)酵后期，發(fā)酵產(chǎn)物和菌種之間存在競(jìng)爭(zhēng)或者菌種可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)變化趨于穩(wěn)定，使得SOD 酶活力也漸漸趨于穩(wěn)定。由于SOD 酶具有清除自由基和過(guò)氧化氫等抗氧化能力，是細(xì)胞防御系統(tǒng)中的主要抗氧化酶。基于本團(tuán)隊(duì)前期對(duì)番茄酵素抗氧化能力變化的分析，將本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的SOD 酶活力變化規(guī)律與抗氧化指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)性分析（表1），發(fā)現(xiàn)SOD 酶活力與ABTS自由基清除率、DPPH 自由基清除率呈極顯著正相關(guān)（＜0.01）。這表明，發(fā)酵體系中具有能夠產(chǎn)生SOD 酶的微生物，從而可以增加發(fā)酵體系的抗氧化活性，并且SOD 也是番茄酵素抗氧化活性功效酶的來(lái)源之一。而SOD 與還原力之間無(wú)顯著相關(guān)性（＞0.05），這可能是由于番茄酵素中的SOD 不是主要參與體系的還原能力，并且也說(shuō)明對(duì)番茄自然發(fā)酵酵素功效物質(zhì)與抗氧化能力之間的全面評(píng)價(jià)需多種測(cè)定方法體系和多種活性物質(zhì)共同進(jìn)行，這有待于進(jìn)一步研究。

表1 SOD 酶活力與抗氧化活性指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis between SOD enzyme activity and antioxidant activity index

圖6 超氧化物歧化酶活力變化Fig.6 Change of superoxide dismutase activity

3 結(jié)論

本文通過(guò)對(duì)番茄酵素自然發(fā)酵過(guò)程中淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、脂肪酶、蛋白酶和超氧化物歧化酶的變化進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，隨著番茄酵素自然發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，淀粉酶和纖維素酶活力逐漸增加，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，其酶活分別為79.289、38.180 U/g；而果膠酶、脂肪酶整體呈先上升后下降的趨勢(shì)，分別于發(fā)酵20、60 d 達(dá)最大酶活力；蛋白酶活力則在發(fā)酵前期呈波動(dòng)變化，隨后顯著上升；表明自然發(fā)酵后的番茄酵素，體系中功效酶的活性均有著明顯變化。另外，SOD 酶活力呈先迅速上升后趨于平緩，于60 d達(dá)到了最大值；并與ABTS自由基清除率、DPPH 自由基清除率呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），這為番茄酵素抗氧化能力的主要功效物質(zhì)探究奠定了基礎(chǔ)。綜上所述，發(fā)酵不僅可以提高酵素的酶活性，還能促進(jìn)體系中物質(zhì)轉(zhuǎn)換和活性物質(zhì)生成，從而提升酵素的品質(zhì)；研究結(jié)果可為番茄酵素的發(fā)酵機(jī)理以及產(chǎn)品的綜合開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論指導(dǎo)。