劉文軒，岳子婷，潘 壇，陳 沖，范德成，李 聰*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

作為最早被人類利用的動(dòng)物奶，山羊奶因其營養(yǎng)全面、容易消化等特點(diǎn)越來越受到消費(fèi)者青睞。西農(nóng)薩能奶山羊具有遺傳性穩(wěn)定、體格雄壯、泌乳性能好、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，常作為改良國內(nèi)奶山羊的父本。隨著生活質(zhì)量的不斷提高，人們對(duì)山羊奶品質(zhì)尤其是其中蛋白質(zhì)含量的要求也不斷提高。因此，為選育出乳品質(zhì)優(yōu)異的奶山羊，挖掘參與調(diào)控乳蛋白合成代謝的關(guān)鍵基因，進(jìn)而解析蛋白質(zhì)合成代謝的機(jī)制通過分子設(shè)計(jì)育種實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)是有效策略。

絲氨酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor, SERPIN)家族由Hunt等于1980年根據(jù)卵清蛋白和人抗凝血酶等蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)保守性提出。14(serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 14)是絲氨酸蛋白酶抑制劑家族的重要成員，主要在孕酮的作用下在牛、羊、豬等動(dòng)物的子宮內(nèi)膜分泌。與SERPIN家族中多數(shù)成員不同，SERPINA14未保留抗蛋白水解活性，且在不同物種中所表達(dá)的蛋白質(zhì)功能各異。目前對(duì)14基因的研究主要集中在豬和綿羊上，在山羊上的研究十分有限。在綿羊體內(nèi)SERPINA14主要起免疫調(diào)節(jié)作用，防止胎兒同種異體排斥反應(yīng)等；在豬體內(nèi)SERPINA14通過結(jié)合并穩(wěn)定鐵結(jié)合蛋白，參與由母體子宮向胎兒的鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)。

本試驗(yàn)室前期對(duì)6只極端高低乳蛋白率的奶山羊乳腺組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，鑒定到14基因(log2Foldchange=-2.44，p-value=3.85E-03)是影響奶山羊乳蛋白合成的關(guān)鍵候選基因。綿羊SERPINA14蛋白可抑制與妊娠相關(guān)的糖蛋白、天冬氨酸蛋白酶同生長因子的結(jié)合。以上研究均表明14基因在奶畜乳蛋白合成中發(fā)揮潛在的重要作用。

本研究擬克隆西農(nóng)薩能奶山羊14基因CDS序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過qPCR(Quantitative Real-time PCR)技術(shù)檢測(cè)基因在不同組織和不同泌乳時(shí)期的表達(dá)水平，為深入探究14基因調(diào)控奶山羊乳蛋白合成與代謝的分子機(jī)制奠定前提基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選擇3歲齡健康西農(nóng)薩能奶山羊一只，屠宰后采集其肝臟、脾臟、乳腺組織、腎臟、瘤胃、小腸等組織1.5 g左右；選擇3只3歲齡健康西農(nóng)薩能奶山羊，在其不同泌乳時(shí)期進(jìn)行活體采集乳腺組織各0.5 g左右，使用DEPC水對(duì)組織漂洗進(jìn)行簡單處理(除去外層薄膜及殘余血跡)，迅速置于液氮中保存，以用于組織總RNA提取。

1.2 主要試劑及材料

本研究中所用主要試劑與材料如表1所示。

表1 主要試劑與材料Table 1 Main reagents and materials

1.3 SERPINA14基因CDS區(qū)克隆

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI中山羊14基因序列(登錄號(hào)：XM_013973196.2)，采用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)克隆PCR引物(片段全長1 311 bp)。F-引物(5'-3')：CGGGGTACCATGTCCCACGGGAGAATGAA；R-引物(5'-3')：CCCAAGCTTCTACTCAACTTGGGGGTTGAG。上下游引物分別帶有KpnⅠ和HindⅢ 酶切位點(diǎn)。

1.3.2 西農(nóng)薩能奶山羊乳腺組織總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 取乳腺組織0.1 g充分研磨，向研磨液中加入1 mL Trizol試劑裂解細(xì)胞，按照試劑說明書提取總RNA，對(duì)提取的總RNA用30 μL RNase-free HO進(jìn)行溶解，經(jīng)濃度和純度(OD/OD≈1.8)測(cè)定符合要求后，根據(jù)PrimeScript RT Reagent Kit使用說明書，對(duì)RNA反轉(zhuǎn)錄使其成為cDNA。

1.3.3 西農(nóng)薩能奶山羊14基因克隆與測(cè)序 以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增以得到14基因。PCR反應(yīng)體系為 (20 μL) ：0.2 μL的cDNA模板；F-引物、R-引物 (10 μmol/L) 各1 μL；10 μL 的Prime Star MAX(含聚合酶、dNTPs等)；7.8 μL 的ddHO。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋侯A(yù)變性(98 ℃，3 min)、變性(98 ℃，10 s)、退火(60 ℃，5 s)、延伸(72 ℃，10 s)，按上述程序進(jìn)行34個(gè)循環(huán)，之后72 ℃延伸3 min；12 ℃終止反應(yīng)。配置1%瓊脂糖凝膠，電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物長度，利用上海生工膠回收試劑盒純化目的片段。構(gòu)建pMD19T-SERPINA14克隆載體，連接PMD-19T載體(16 ℃，12 h)。連接體系：脫氧核糖核酸片段(膠回收產(chǎn)物) 7 μL，Solution Ⅰ 5 μL，PMD-19T載體0.5 μL。將克隆載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，經(jīng)氨芐霉素 (Amp) 抗性篩選后挑取陽性菌落，對(duì)菌液進(jìn)行PCR鑒定 (PCR反應(yīng)體系和程序同上)，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 SERPINA14基因的生物信息學(xué)分析

如表2所示，采用生物信息學(xué)分析軟件和數(shù)據(jù)庫對(duì)14基因及其表達(dá)的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.5 SERPINA14基因組織表達(dá)譜

基于對(duì)瘤胃、肝臟、脾臟、乳腺、小腸、腎等9種組織以及處于不同泌乳時(shí)期乳腺組織提取的總RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)14基因的mRNA表達(dá)水平。qPCR反應(yīng)體系(10 μL)為：SYBRPremix EX Taq(2×) 5 μL，模板cDNA (1 000 μg/μL) 0.8 μL，F(xiàn)-引物、R-引物(10 μmol/L)各0.4 μL，ddHO 3.4 μL。qPCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性(95 ℃，30 s)、變性(95 ℃，10 s)、延伸(55 ℃，30 s)，循環(huán)45次。內(nèi)參基因?yàn)閁XT(F：TGTGGCCCTTGGATATGGTT；R: GGTTGTCGCTGAGCTCTGTG)，定量引物SERPINA14(片段全長221 bp)F：CTGCCTAATTTGGAGGCCCTG；R:TCAACTTGGGGGTTGAGGAC；SERPINA14的組織相對(duì)表達(dá)量用2法定量，用GraphPad Prism v7.0.4進(jìn)行繪圖。

表2 生物信息學(xué)分析所用軟件及數(shù)據(jù)庫Table 2 Software and databases used in bioinformatics analysis

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 17.0軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行One-way ANOVA顯著性檢驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。當(dāng)數(shù)值<0.05時(shí)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著；當(dāng)數(shù)值<0.01時(shí)，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶山羊SERPINA14基因CDS序列克隆

利用乳腺組織提取的總RNA，經(jīng)擴(kuò)增獲得目的基因SERPINA14片段為1311 bp (登錄號(hào)：XM_013973196.2)，如圖1所示。測(cè)序后進(jìn)行NCBI Blast比對(duì)，確定其為14基因CDS區(qū)，堿基含量分別為： A=30.0%，T=23.2%，C=26.3%，G=20.5%。

圖1 SERPINA14基因擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖譜M. marker DL2 000; 1為PCR產(chǎn)物Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of SERPINA14gene amplification productM. marker DL2 000; 1 is the PCR product

2.2 同源性比對(duì)

將各個(gè)物種14基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)西農(nóng)薩能奶山羊14基因核苷酸序列與山羊()、綿羊()、牛()、狗()和馬()的同源性分別為100.00%、98.55%、90.08%、70.33%和69.78%；由系統(tǒng)進(jìn)化樹分析(圖2)可得，西農(nóng)薩能奶山羊SERPINA14基因序列與山羊同源性最高，其次是綿羊，所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹可直觀地顯示不同物種間的分子水平差異。

圖2 SERPINA14蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 SERPINA14 protein phylogenetic tree

2.3 生物信息學(xué)分析

2.3.1 理化性質(zhì) 西農(nóng)薩能奶山羊SERPINA14蛋白質(zhì)含有氨基酸436個(gè)(表3)，氨基酸分子量49.89 ku；理論等電點(diǎn)為9.25；總分子式為CHNOS。分析可知不穩(wěn)定系數(shù)為37.05，屬于穩(wěn)定蛋白一類。其中Leu和Lys含量占比相對(duì)較高，分別占15.1%和10.6%。Trp和Tyr含量占比相對(duì)較低，均為0.2%。Asp+Glu(帶負(fù)電殘基總數(shù))為45個(gè)；Arg+Lys(帶正電殘基總數(shù))為 55個(gè)；推測(cè)SERPINA14為堿性蛋白質(zhì)，總平均親水性為-0.113，是一種親水蛋白。

2.3.2 SERPINA14蛋白磷酸位點(diǎn)分析 如圖3所示，西農(nóng)薩能奶山羊SERPINA14蛋白共檢測(cè)出30個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中14個(gè)Serine(絲氨酸)磷酸化位點(diǎn)，16個(gè)Threonine(蘇氨酸)磷酸化位點(diǎn)。

表3 西農(nóng)薩能奶山羊SERPINA14蛋白的氨基酸組成Table 3 Amino acids composition of SERPINA14 protein in Xinong Saanen dairy goats

圖3 SERPINA14蛋白磷酸化位點(diǎn)圖Fig. 3 Distribution of phosphorylation sites of SERPINA14 protein

2.3.3 SERPINA14蛋白的亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域分析 根據(jù)SignalP 4.1 Server分析顯示，SERPINA14蛋白沒有信號(hào)肽存在(0.4260)。而通過TargetP 2.0 Server預(yù)測(cè) SERPINA14 蛋白存在信號(hào)肽(0.6057)，且信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)位于第32和33號(hào)氨基酸之間(0.9294)，表明該蛋白可能屬于分泌型蛋白。SERPINA14蛋白主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(55.6%)、高爾基體(11.1%)、線粒體(11.1%)、細(xì)胞核(11.1%)、細(xì)胞外，包括細(xì)胞壁(11.1%)。通過TMHMM預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域得知SERPINA14 蛋白為具有2段跨膜螺旋的跨膜蛋白(圖4)，smart結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)其有SERPIN域(圖5)。

圖4 西農(nóng)薩能奶山羊SERPINA14蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)Fig. 4 Transmembrane region prediction of SERPINA1 protein in Xinong Saanen dairy goats

圖5 西農(nóng)薩能奶山羊SERPINA14蛋白smart結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig. 5 Prediction of the smart domain of SERPINA14 protein in Xinong Saanen dairy goat

2.3.4 SERPINA14蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)通過在線蛋白分析系統(tǒng)分析顯示，西農(nóng)薩能奶山羊SERPINA14蛋白質(zhì)中，237個(gè)氨基酸形成α螺旋狀聚合物，48個(gè)氨基酸形成延伸鏈，151個(gè)氨基酸形成無規(guī)則卷曲聚合物，三者氨基酸含量占比分別為54.36%、11.01%和34.63%。SERPINA14蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分別如圖6和圖7所示。

圖6 SERPINA14蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig. 6 Prediction of secondary structure of SERPINA14 protein

圖7 SERPINA14蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig. 7 Prediction of tertiary structure of SERPINA14 protein

2.3.5 SERPINA14蛋白相互作用預(yù)測(cè)圖 通過分析，得到SERPINA14蛋白相互作用預(yù)測(cè)圖如圖8所示，發(fā)現(xiàn)SERPINA14與SLC2A5、STC1、CTSL2、PAG4等10種蛋白存在互作關(guān)系。

圖8 SERPINA14蛋白質(zhì)相互作用預(yù)測(cè)圖Fig. 8 Prediction diagram of SERPINA14 protein interaction

2.4 SERPINA14基因組織表達(dá)譜分析

組織表達(dá)譜分析可以更好的為14基因在奶山羊不同組織內(nèi)的功能研究提供前提基礎(chǔ)。如圖9所示，14基因以肌肉為對(duì)照組，其在腎臟組織中表達(dá)量最高(<0.01)；其次是乳腺；在小腸和脾臟中表達(dá)含量較低。如圖10所示，對(duì)14基因在不同泌乳時(shí)期乳腺組織表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，以空懷為對(duì)照組，14基因在干奶期的乳腺組織表達(dá)量最高(<0.01)，其次是盛期和后期。

圖9 SERPINA14在不同組織中相對(duì)表達(dá)量**代表P<0.01，差異極顯著。下同。Fig. 9 Relative expression of SERPINA14 in different tissues** represents P<0.01, the difference is highly significant.The same below.

圖10 SERPINA14在不同泌乳時(shí)期乳腺組織的相對(duì)表達(dá)量Fig. 10 Relative expression of SERPINA14 inmammary gland tissue at different lactation stages

3 討 論

14基因?qū)儆赟ERPIN超家族，但是其與該家族中大部分成員不同，其表達(dá)的蛋白功能因物種而異。研究表明,綿羊上SERPINA14蛋白是由腺上皮分泌產(chǎn)生的，而牛上是由妊娠子宮內(nèi)膜分泌產(chǎn)生。本研究通過TargetP 2.0 Server預(yù)測(cè)西農(nóng)薩能奶山羊SERPINA14蛋白存在信號(hào)肽，可能為分泌型蛋白，結(jié)合亞細(xì)胞定位的結(jié)果，其主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上(55.6%)，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要發(fā)揮著合成分泌型蛋白和多種膜蛋白的作用，且在分泌型細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中十分發(fā)達(dá)，揭示了SERPINA14可能在蛋白合成中起重要作用。組織表達(dá)譜揭示14基因在乳腺中表達(dá)量高于除腎臟外的其他組織，不同泌乳時(shí)期14基因在乳腺組織的表達(dá)為在干奶期表達(dá)量最高，其次是泌乳盛期和后期，推測(cè)14基因可能在奶山羊處于干奶期的乳腺組織發(fā)揮重要作用，調(diào)控乳蛋白的合成與分泌。研究結(jié)果為進(jìn)一步通過基因編輯技術(shù)，敲除、干擾、過表達(dá)該基因，在細(xì)胞水平驗(yàn)證其調(diào)控乳蛋白合成與分泌的機(jī)制奠定基礎(chǔ)；以期應(yīng)用于改善羊乳品質(zhì)，提高奶山羊泌乳性能。

對(duì)蛋白相互作用預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)SERPINA14蛋白與SLC2A5、STC1、CTSL2、PAG4等10種蛋白存在互作關(guān)系。SLC2A5蛋白(GLUT5)是糖酵解關(guān)鍵蛋白，是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中特有的果糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。糖酵解是哺乳動(dòng)物體內(nèi)最重要的生化過程之一，也是為機(jī)體供能的主要途徑。研究表明，通過SLC2A5蛋白(GLUT5)調(diào)控糖酵解過程，進(jìn)一步影響癌細(xì)胞的生命進(jìn)程，可以輔助肺癌治療。山羊泌乳階段會(huì)消耗大量能量，SLC2A5蛋白(GLUT5)通過加速糖酵解過程，為泌乳生理階段快速提供大量能量，以滿足泌乳需要，同時(shí)與SERPINA14蛋白互作，促進(jìn)乳蛋白的合成，增加羊奶中蛋白質(zhì)的含量。也有研究表明，孕酮和雌激素合用會(huì)減少腺上皮中SERPINA14 mRNA的表達(dá)，而1基因的表達(dá)會(huì)抑制牛的黃體細(xì)胞和FSH、LH和hCG刺激的大鼠顆粒細(xì)胞合成孕酮進(jìn)而抑制SERPINA14蛋白的合成。An等發(fā)現(xiàn)1基因的表達(dá)可影響PI3K-AKT-mTOR通路，此信號(hào)通路已成為醫(yī)學(xué)上癌癥研究的熱點(diǎn)，因此預(yù)測(cè)STC1蛋白(斯鈣素1)在抗腫瘤與抗癌方面也有重要作用，而多項(xiàng)研究也證明了上述結(jié)果。CTSL2(組織蛋白酶L2)蛋白在山羊上尚未有報(bào)道，而Del等研究發(fā)現(xiàn)，在肉雞上2基因的表達(dá)與蛋白質(zhì)的分解有關(guān)，這對(duì)于乳品質(zhì)的改善是一種不利因素，因此，要利用好SERPINA14蛋白與CTSL2蛋白的互作關(guān)系，降低2基因的表達(dá)。Gomes等提出SERPIN超家族的成員SERPINB3可能與CTSL2共同進(jìn)化的假說，從側(cè)面進(jìn)一步驗(yàn)證了SERPINA14蛋白與CTSL2蛋白存在互作關(guān)系。PAGs(妊娠相關(guān)糖蛋白)是偶蹄類動(dòng)物胎兒胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞合成、分泌的一類糖蛋白，且具有免疫調(diào)節(jié)和維持妊娠的作用，PAG4作為其中的一員，同樣具有此功能?；诘鞍谆プ黝A(yù)測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)與SERPINA14蛋白有互作關(guān)系的蛋白均直接或間接具有影響蛋白質(zhì)合成或降解的功能，揭示其可能通過間接作用參與蛋白質(zhì)的合成與降解過程。此外，有研究表明SERPINA14蛋白參與機(jī)體免疫與妊娠。Ulbrich等對(duì)14基因在牛各個(gè)發(fā)情時(shí)期和著床前早孕子宮內(nèi)膜中的表達(dá)進(jìn)行了全面定量分析，揭示了其在牛妊娠期間發(fā)揮關(guān)鍵作用；在體外SERPINA14的存在降低了絲裂原刺激的淋巴細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制了腫瘤細(xì)胞系的生長，這也與蛋白互作預(yù)測(cè)的結(jié)果相符合。

14基因在奶畜泌乳中發(fā)揮的作用尚未報(bào)道，薩能奶山羊是世界上公認(rèn)主要生產(chǎn)羊奶的優(yōu)秀品種之一，隨著人們對(duì)羊奶制品需求量的增多及羊乳品質(zhì)要求的提高，改善羊奶品質(zhì)顯得尤為重要。本研究分析了14基因的初步功能，為從分子育種角度提高羊奶中乳蛋白含量提供了潛在新方向，為闡明羊乳蛋白合成與代謝調(diào)控機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究克隆得到西農(nóng)薩能奶山羊14基因CDS序列1 311 bp(登錄號(hào)：XM_013973196.2)，編碼436個(gè)氨基酸，蛋白分子量為49.89 ku，為穩(wěn)定的堿性蛋白質(zhì)，為跨膜親水蛋白，具有SERPIN結(jié)構(gòu)域，與SLC2A5、STC1、CTSL2、PAG4等10個(gè)蛋白存在互作關(guān)系。14基因在腎臟和乳腺組織中高表達(dá)，在干奶期高表達(dá)。