馬東曉，衣姜樂，夏方詮，田 棟，周長利

（濟南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東 濟南 250022）

農(nóng)藥對提高農(nóng)作物質(zhì)量和產(chǎn)量方面發(fā)揮著重要作用，隨著農(nóng)藥的普遍應(yīng)用，人們對農(nóng)藥殘留的問題越來越重視，所以快速、精確地檢測農(nóng)藥殘留是目前研究的熱門課題。啶蟲脒作為一種常見的氯煙堿類農(nóng)藥，具有著較強的抗蟲性和較低的哺乳動物毒性，被廣泛的應(yīng)用于生態(tài)防害。然而，啶蟲脒的過量使用也會對水、農(nóng)產(chǎn)品及土壤造成污染，對人類健康構(gòu)成威脅。目前，農(nóng)殘檢測方法有多種，如高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)。這些技術(shù)提供了豐富的定性和定量信息，具有高度準(zhǔn)確性。然而由于操作復(fù)雜性，繁雜的樣品預(yù)處理，較高分析成本和時間消耗，極大的限制了這些方法在實際農(nóng)殘檢測中的應(yīng)用。電化學(xué)方法因微型化、操作簡便、成本低、響應(yīng)時間較快受到廣泛關(guān)注。特別是生物電化學(xué)傳感器在食品安全分析檢測等領(lǐng)域顯示出巨大優(yōu)勢。但是，在構(gòu)建傳感器過程中信號探針大都被固定于電極表面，電極的打磨、清洗、活化耗時且操作繁瑣，重現(xiàn)性不高。其次，信號探針與靶的識別作用發(fā)生在電極與溶液之間的界面上，使得空間位阻作用增強、作用效率降低，這些不足在一定程度延長了完全作用時間，限制了傳感器的實際分析應(yīng)用。在均相電化學(xué)開展了一系列相關(guān)研究，利用免電極修飾傳感策略實現(xiàn)了對目標(biāo)物的高靈敏檢測。Yang Limin等利用As（V）與CeO的結(jié)合力強于磷酸根與CeO之間的相互作用這一特性，發(fā)展了競爭配位的免電極修飾生物傳感器用于As（V）的分析測定。利用亞甲基藍(lán)標(biāo)記的短鏈DNA（methylene blue-short strand DNA，MB-ssDNA）為信號探針，由于短DNA尺寸小且?guī)в休^少負(fù)電荷，可以自由擴散到帶負(fù)電的銦錫氧化物電極表面，電化學(xué)信號增強。免電極修飾的傳感策略避免了常規(guī)電極修飾的繁瑣且耗時、核酸探針與目標(biāo)物的作用效率低等缺陷，具有簡單、快速、高特異性和高效率等優(yōu)點。然而，在免電極修飾傳感策略中，為了提高探針傳質(zhì)速率，往往需要在探針與目標(biāo)物反應(yīng)后，將探針分子與核酸復(fù)合物分離，這就會面臨均相分離的難題。

有序介孔二氧化硅的磁性復(fù)合材料由于獨特的磁性、生物相容性及反應(yīng)活性，使其在生物磁分離、靶向藥物的運輸，免疫檢測等方面受到特別關(guān)注。Wang Yanyan等通過在磁性介孔二氧化硅（magnetic mesoporous silica，MMS）內(nèi)外殼中包裹CdTe量子點和羅丹明6G受體，構(gòu)成多功能無機-有機納米復(fù)合物，構(gòu)建高選擇性、可再生比率熒光傳感器，用于高效測定、快速吸附及磁性分離去除Hg。盛偉通過對FeO@SiO進行氨基化改性，制備得到的FeO@SiO@EDPS經(jīng)計算對DNA的最大吸附容量可達(dá)到210.22 μg/mg，表現(xiàn)出良好的DNA分離及純化性能。

本實驗利用具有優(yōu)良磁性的MMS構(gòu)建了免電極修飾的電化學(xué)適配體傳感器，用于快速檢測啶蟲脒。通過在MMS表面氨基化改性并修飾金納米粒子，使其與啶蟲脒適配體結(jié)合，并通過雜交反應(yīng)與標(biāo)記有二茂鐵（ferrocene，F(xiàn)c）的cDNA反應(yīng)，制備磁性復(fù)合物氨基化磁性介孔二氧化硅@納米金-適配體-核酸互補鏈-二茂鐵（amino magnetic mesoporous silica@gold nanoparticlesaptamer-complementary DNA-ferrocene，NH-MMS@Au NPs-Apt-cDNA-Fc）。在分析測定過程中，磁性復(fù)合物與啶蟲脒在磷酸緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）中發(fā)生均相反應(yīng)，釋放出核酸探針cDNA-Fc。利用磁場效應(yīng)將反應(yīng)后的磁性復(fù)合物與釋放出的探針分離，溶液中游離的cDNA-Fc探針傳質(zhì)到電極表面，產(chǎn)生電化學(xué)信號。根據(jù)加入啶蟲脒前后電化學(xué)信號差值，實現(xiàn)啶蟲脒的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲酸二茂鐵（ferrocenecarboxylic acid，F(xiàn)c-COOH）（純度98%）、(3-氨基丙基)-三乙氧基硅烷（(3-aminopropyl)triethoxysilane，APTES）（純度99%）、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）（純度99%）、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（-(3-dimethylaminopropyl)-’-ethylcarbodiimide hydrochloride，EDC）（純度98%）、-羥基琥珀酰亞胺（-hydroxysuccinimide，NHS）（純度98%） 阿拉丁試劑（上海）有限公司；六水合三氯化鐵（FeCl·6HO）（純度99%）、正硅酸乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS）（純度98%）、乙二醇（分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；實驗中所用水為超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm）；所用PBS均為0.1 mol/L且pH 7.4，啶蟲脒適配體及適配體互補鏈購自生工生物工程（上海）股份有限公司，序列如下：啶蟲脒適配體：5’-NH-(CH)-TGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTTGATCGCTGACACC ATATTATGAAGA-3’；啶蟲脒適配體的互補鏈：5’-NH-(CH)-CATAATATGGTGTCAGCG-3’。

1.2 儀器與設(shè)備

電化學(xué)工作站 上海辰華儀器公司；傅里葉變換紅外光譜儀 德國布魯克公司；透射電子顯微鏡 日本電子株式會社。

1.3 方法

1.3.1 材料制備

1.3.1.1 MMS的制備

稱取1.35 g FeCl·6HO，3.60 g NaAc及0.33 g檸檬酸鈉溶解于40 mL乙二醇中，充分?jǐn)嚢韬筠D(zhuǎn)移至高壓反應(yīng)釜，在200 ℃反應(yīng)16 h。磁性分離得到FeO納米粒子，用水和乙醇洗滌3 次，60 ℃真空干燥。

將0.05 g FeO充分分散在乙醇（20 mL）、超純水（10 mL）及濃氨水（0.5 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)28%）混合溶液中，超聲處理30 min。向溶液中逐滴加入40 μL TEOS，機械攪拌6 h，進行磁性分離，得到單層SiO包裹的FeO。向以上產(chǎn)物中加入0.3 g CTAB、超純水（40 mL）、濃氨水（0.6 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)28%）和乙醇（30 mL）的混合溶液，超聲處理30 min后滴加400 μL TEOS，在機械攪拌下保持反應(yīng)6 h以涂覆第2層介孔二氧化硅，反應(yīng)完成后收集產(chǎn)物。將產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至含有50 mL乙醇、0.50 g NHNO的三口燒瓶中，N保護條件下，80 ℃冷凝回流5 h，重復(fù)此洗滌過程3 次以上以除去CTAB，分離得到MMS，60 ℃真空干燥。

1.3.1.2 MMS的氨基化

將0.03 g MMS加入到圓底燒瓶中，再加入50 mL乙醇、40 μL APTES。在80 ℃通入N保護并持續(xù)攪拌，反應(yīng)12 h后，將制備的沉淀物用乙醇和水進行洗滌以洗去硅烷試劑，分散至10 mL超純水中，制得氨基功能化介孔材料NH-MMS。

1.3.1.3 NH-MMS@Au NPs的制備

在持續(xù)攪拌下依次將氯金酸（170 μL、0.25 mmol/L）、冰NaBH溶液（0.6 mL、0.1 mol/L）按順序加入到檸檬酸鈉（19.40 mL、0.25 mmol/L）溶液中，于4 ℃的冰箱中靜置老化6 h，成功制得Au NPs。

取400 μL 3 mg/mL氨基化介孔二氧化硅置于離心管中，加入12 mL金納米粒子后在振蕩器上振蕩12 h，在9 000 r/min離心5 min，除去上清液，得NH-MMS@Au NPs復(fù)合物，分散在4 mL超純水中，充分振蕩均勻后備用。

1.3.1.4 二茂鐵-DNA互補鏈（ferrocene-complementary DNA，F(xiàn)c-cDNA）探針的制備

稱取0.23 g Fc-COOH（0.001 mol），在持續(xù)攪拌下加入到16.0 mL的超純水中，后加入2.0 mL EDC（4.0 mmol/L）和NHS（1.0 mmol/L）混合溶液，攪拌過夜以活化Fc-COOH的羧基基團，超聲分散均勻后9 000 r/min離心5 min，后分散在10 mL超純水中，取1 mL上述溶液稀釋10 倍備用。

將150 μL 10 μmol/L cDNA與100 μL 0.01 mol/L的上述溶液混合振蕩均勻，在4 ℃環(huán)境下孵育12 h。

1.3.1.5 NH-MMS@Au NPs-Apt-cDNA-Fc的制備及純化

將200 μL 10 μmol/L啶蟲脒適配體與200 μL NH-MMS@Au NPs復(fù)合物充分混合均勻，在4 ℃環(huán)境下孵育12 h，制備得到NH-MMS@Au NPs-Apt復(fù)合物。將其與Fc-cDNA溶液混合，振蕩均勻，于37 ℃孵育2 h。利用磁性分離，以PBS洗滌3 次以除去多余的Fc-cDNA探針。最后得到的NH-MMS@Au NPs-Apt-cDNA-Fc分散于10 mL PBS溶液中，備用。

1.3.2 傳感器的制備與表征

準(zhǔn)確移取2 mL NH-MMS@Au NPs-Apt-cDNA-Fc分散液于電解池中，加入不同濃度的啶蟲脒標(biāo)準(zhǔn)液，攪拌下常溫孵化30 min。將磁鐵置于電解池底部，分離后，以處理好的裸玻碳電極為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑電極為輔助電極，利用方波伏安（square wave voltammetry，SWV）法在0.1～0.5 V電位區(qū)間內(nèi)掃描，記錄所得數(shù)據(jù)。傳感器構(gòu)建過程如圖1所示。

圖1 免電極修飾適配體傳感器構(gòu)建過程Fig. 1 Flow chart for the construction of modification-free electrode aptasensor

1.3.3 電化學(xué)研究

分別在單獨含有Fc、Fc-cDNA、NH-MMS@Au NPs-Apt-cDNA-Fc和NH-MMS@Au NPs-Apt-cDNA-Fc+啶蟲脒的PBS溶液中用SWV法測其氧化峰電位及電流。

1.3.4 實際樣品測定

為進一步考察構(gòu)建的傳感器在實際樣品的分析性能，將制備好的傳感器應(yīng)用到實際樣品的檢測中。對超市購買的芹菜進行測試，首先分別準(zhǔn)確稱量100 g芹菜，用榨汁機榨成汁后，將樣品分散在100 mL PBS中，離心樣品并獲得上清液，后按照所構(gòu)建傳感體系檢測芹菜中啶蟲脒。

2 結(jié)果與分析

2.1 材料表征

利用透射電子顯微鏡對FeO、MMS、NH-MMS@Au NPs材料進行形貌表征。由圖2A可以看出，磁性FeO粒徑為200 nm左右，分散均勻，大小勻稱。由圖2B可知，F(xiàn)eO包覆二氧化硅后，粒徑變大，約為400 nm，有明顯介孔結(jié)構(gòu)。MMS氨基功能化后形貌無明顯變化。NH-MMS@Au NPs的TEM如圖2C所示，可明顯看到金納米粒子成功修飾在NH-MMS上，且結(jié)合良好。圖2內(nèi)插圖表明FeO、MMS、NH-MMS@Au NPs均具有良好磁性。

圖2 Fe3O4（A）、MMS（B）和NH2-MMS@Au NPs（C）的TEM圖Fig. 2 TEM images of Fe3O4 (A), MMS (B) and NH2-MMS@Au NPs (C)

進一步對FeO、FeO@SiO、NH-FeO@SiO進行傅里葉紅外光譜表征，如圖3所示。三者均在583 cm出現(xiàn)了由Fe—O鍵振動引起的特征峰，MMS和NH-MMS的Fe—O鍵振動峰有所減弱，這是由于二氧化硅包裹或FeO部分氧化引起。由圖3B可知，635、806、1 090 cm處Si—O—Si的特征峰可知，二氧化硅包覆成功。圖3C中879、1 645 cm與N—H鍵彎曲振動和面外變形振動有關(guān)，在3 415、3 489 cm處產(chǎn)生的吸收峰則由N—H鍵對稱與不對稱的伸縮振動引起，表明MMS氨基化改性成功。

圖3 Fe3O4（A）、Fe3O4@SiO2（B）和NH2-Fe3O4@SiO2（C）紅外光譜圖Fig. 3 FTIR spectra of Fe3O4 (A), Fe3O4@SiO2 (B) and NH2-Fe3O4@SiO2 (C)

2.2 探針電化學(xué)行為

眾所周知，F(xiàn)c在玻碳電極上可發(fā)生可逆的氧化還原反應(yīng)。在0.1 mol/L的PBS中，用SWV法測定Fc的電化學(xué)行為，結(jié)果如圖4曲線a所示，其氧化峰電位為0.3 V。以Fc標(biāo)記短鏈cDNA，形成核酸探針cDNAFc后，其峰電流略有降低（圖4曲線b）。但是，將其與NH-MMS@Au NPs-Apt雜交形成磁性復(fù)合物NH-MMS@Au NPs-Apt-cDNA-Fc后，峰電流明顯降低（圖4曲線c）。這是由于磁性復(fù)合物傳質(zhì)速率緩慢所致。當(dāng)加入啶蟲脒后，啶蟲脒與NH-MMS@Au NPs-Apt-cDNA-Fc上適配體結(jié)合，而將cDNA-Fc探針釋放出來游離在溶液中，峰電流升高（圖4曲線d）。游離的cDNA-Fc探針產(chǎn)生峰電流的大小與啶蟲脒濃度密切相關(guān)，據(jù)此可建立啶蟲脒快速分析方法。

圖4 Fc（a）、Fc-cDNA（b）、NH2-MMS@Au NPs-Apt-cDNA-Fc（c）和c＋啶蟲脒（d）的SWV曲線Fig. 4 SWV curves of Fc (a), Fc-cDNA (b), NH2-MMS@Au NPs-AptcDNA-Fc (c) and c + acetamiprid (d)

2.3 孵化時間的選擇

在其他條件不變情況下，向電解池中加入10 μL（10mol/L）啶蟲脒，攪拌下常溫孵化一定時間后，將磁鐵置于電解池底部，測量SWV曲線氧化峰電流，結(jié)果如圖5所示。在30 min之前，隨孵化時間延長，越來越多的啶蟲脒與適配體發(fā)生特異性結(jié)合，原有的雙螺旋結(jié)構(gòu)解開，釋放出的cDNA-Fc探針增多，峰電流變大。當(dāng)孵化時間超過30 min后，電化學(xué)信號無明顯變化，說明30 min孵化反應(yīng)完全，因此選擇30 min為最佳孵化時間。

2.4 線性范圍與檢出限結(jié)果

測定不同濃度的啶蟲脒時的SWV曲線，結(jié)果如圖6所示。峰電流隨啶蟲脒濃度增大而升高，說明釋放出的cDNA-Fc探針增加。當(dāng)啶蟲脒濃度達(dá)到5.6×10mol/L時，電化學(xué)信號不再變化。啶蟲脒加入前后峰電流差Δ與濃度的對數(shù)（lg）呈良好的線性關(guān)系，線性方程為Δ= 0.041lg+0.535（=0.988），線性范圍為0.055 pmol/L～5.5 nmol/L，檢出限為3.2 fmol/L，與其他測定啶蟲脒的傳感器相比（表1），該傳感器具有較高的靈敏度和較低的檢出限。

圖6 不同啶蟲脒濃度的SWV曲線Fig. 6 SWV curves of acetamiprid at different concentrations

表1 各種啶蟲脒傳感器分析性能的比較Table 1 Comparison of analytical performance of various acetamiprid sensors

2.5 傳感器的選擇性

為考察制備免電極修飾傳感器的選擇性，分別使用5.6×10mol/L的草甘膦、多菌靈、毒死蜱、氯氰菊酯及含有啶蟲脒的混合農(nóng)藥作為干擾物，并對溶液中加入各種農(nóng)藥后的電化學(xué)信號進行測定。由圖7可以看出，加入啶蟲脒和混合農(nóng)藥的峰值最大，這是由于傳感體系中所用的啶蟲脒適配體與啶蟲脒發(fā)生特異性結(jié)合，而與其他農(nóng)藥不作用，所以當(dāng)加入其他農(nóng)藥后，電化學(xué)信號幾乎無變化。另外當(dāng)加入混合農(nóng)藥時，結(jié)果表明其他農(nóng)藥對傳感體系沒有影響，說明該傳感器對啶蟲脒選擇性好。

圖7 傳感器選擇性Fig. 7 Selectivity of electrochemical aptasensor

2.6 實際樣品的測定結(jié)果

為考察構(gòu)建的傳感器實際測定效果，以芹菜作為試劑樣品進行測試。結(jié)果表明，啶蟲脒回收率在101%～116%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于9.4%。該方法可作為實際樣品中啶蟲脒測定的參考方法，在環(huán)境和食品領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

表2 芹菜樣品中啶蟲脒的檢測（n=3）Table 2 Recoveries of acetamiprid spiked in celery samples (n = 3)

3 結(jié) 論

構(gòu)建了一種基于MMS的免電極修飾電化學(xué)適配體傳感器，用于快速檢測啶蟲脒。MMS不僅提供了更多的靶結(jié)合位點，使得傳感效率增強；而且其優(yōu)良磁性實現(xiàn)了DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)的純化、分離，提高了測試準(zhǔn)確性。免電極修飾電化學(xué)適配體傳感器避免了繁瑣的電極修飾過程，縮短了測定時間，為食品中的農(nóng)殘快速檢測提供了一種新思路，有著廣闊的應(yīng)用前景。