徐 昊，何偉偉，李大婧，包怡紅,*，羅 浩，王凡予，張鐘元

（1.東北林業(yè)大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.江蘇省農業(yè)科學院農產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014）

類胡蘿卜素是一類廣泛存在于高等植物中的烯萜類化合物，包括胡蘿卜素和葉黃素類。在植物的光合作用中，類胡蘿卜素能夠吸收過量的光能，保護光合作用的細胞器。在人體內，類胡蘿卜素具有很強的抗氧化活性，能保護細胞膜和脂蛋白免受氧破壞，延緩細胞衰老和預防癌癥。但人和動物不能在體內合成類胡蘿卜素，只能從飲食中攝取。

玉米籽粒中營養(yǎng)全面，含有碳水化合物、蛋白質、類胡蘿卜素外，還含有膳食纖維、維生素和微量元素等營養(yǎng)成分。玉米中類胡蘿卜素含量、總酚含量和總花青素含量在種子中較低，但在幼苗中很高。而玉米籽粒在萌發(fā)的過程中，類胡蘿卜素、氨基酸、維生素和鈣含量得到了顯著提高，并降低了制品黏度，改善口感形成特殊的風味。因此，玉米籽粒通過萌發(fā)處理后可成為功能性食品。已有研究表明，脫落酸（abscisic acid，ABA）處理后可以提高番茄中β-胡蘿卜素等類胡蘿卜素含量，增強玉米中抗氧化酶活性，然而鮮有關于ABA調控發(fā)芽玉米富集類胡蘿卜素的研究。

ABA是一種以異戊二烯為基本結構倍半萜類的植物生長激素，也是類胡蘿卜素代謝途徑中的下游產(chǎn)物。ABA具有抑制生長和促進休眠等作用，除此之外ABA可以有效啟動植物體內抗逆基因表達，有效激活植物體內抗逆免疫系統(tǒng)，增強植物綜合抗性。有研究表明ABA可以通過維持細胞膜穩(wěn)定性等多個方面增加植物的抗氧化能力。鎢酸鈉（NaWoO）可以抑制內源ABA合成并阻斷其信號傳遞，并抑制幼苗抗氧化能力。

因此，本實驗以不同質量濃度ABA浸泡處理玉米籽粒，研究ABA浸泡處理對發(fā)芽玉米籽粒生長、抗氧化及類胡蘿卜素含量的影響，旨在為開發(fā)一種快速有效富含類胡蘿卜素的發(fā)芽玉米功能食品提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試玉米‘蘇玉29’，2020年產(chǎn)，購于江蘇瑞華農業(yè)科技有限公司。

ABA、NaWoO上海阿拉丁有限公司；類胡蘿卜素標準品、2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）、Trolox 美國Sigma公司；甲基叔丁基醚（methyl tert-butyl ether，MTBE）、甲醇（色譜純）美國Tedia公司；酶聯(lián)免疫檢測試劑盒 南京建成生物研究所；多糖多酚植物總RNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；PrimeScriptMaster Mix試劑盒 北京寶日醫(yī)生物技術有限公司；Powerup SYBR Green Master Mix試劑盒 美國Thermo Fisher公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

BS224S電子分析天平 北京賽多利斯科學儀器公司；LBI-150生化培養(yǎng)箱 上海龍躍儀器設備有限公司；FD-1A-50真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；1260 Infinity II高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Agilent公司；Q3熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Thermo Fisher公司；A11分析研磨機德國IKA公司；5424R臺式高速離心機 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)芽玉米籽粒的培養(yǎng)

玉米籽粒用蒸餾水清洗去除雜質，置于0.5%次氯酸鈉溶液中浸泡25 min消毒處理，用蒸餾水清洗數(shù)次至pH值為中性。室溫25 ℃用ABA溶液（2.5、5、7.5 mg/L和10 mg/L）和8 g/L NaWoO溶液對玉米進行24 h浸泡處理。將浸泡好的玉米用蒸餾水清洗后轉入墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，以蒸餾水作為培養(yǎng)液，在25 ℃避光條件下恒溫培養(yǎng)。發(fā)芽過程中每6 h噴灑一次蒸餾水，以保持玉米表面濕潤，發(fā)芽72 h后，收獲發(fā)芽玉米，立即用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱中保存待用。

1.3.2 理化指標測定

發(fā)芽率根據(jù)國際種子試驗協(xié)會的公式確定；芽長用游標卡尺測定。

可溶性蛋白質含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定；游離氨基酸含量采用茚三酮顯色法測定；脯氨酸含量采用酸性茚三酮顯色法測定。內源激素ABA含量采用酶聯(lián)免疫檢測試劑盒測定。

1.3.3 VC和總酚含量的測定

VC測定：稱取2.5 g玉米粉末，加入少量4 ℃預冷的0.25%偏磷酸溶液浸提，冰浴條件下研磨后，用0.25%偏磷酸溶液定容至25 mL，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，上清液經(jīng)0.45 μm水系膜過濾后待HPLC測定。

HPLC條件：色譜柱為ZORBAX 300SB-C（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫25 ℃；流速0.8 mL/min；進樣量20 μL；檢測波長240 nm；流動相0.03 mol/L正磷酸溶液。

總酚測定：稱取4.0 g玉米粉末，用70%乙醇溶液定容至50 mL。取上述溶液1.0 mL，加入5 mL蒸餾水、1.0 mL福林試劑和3.0 mL 7.5% NaCO溶液。在765 nm波長處測定吸光度。總酚含量以沒食子酸毫克當量（mg/g）表示。

1.3.4 類胡蘿卜素的提取與測定

將收集冷藏保存的新鮮玉米籽粒真空冷凍干燥后，粉碎過40 目篩得到玉米粉。稱取3.0 g玉米粉置于磨口錐形瓶中，加入30 mL正己烷-乙醇-丙酮-甲苯（10∶6∶7∶7，V/V）混合萃取液，靜置3～4 h，加入2 mL 40% KOH-甲醇溶液，搖勻后置于暗處25 ℃皂化16 h，將皂化液轉入分液漏斗，加入30 mL正己烷，振蕩搖勻，再加入38 mL 10%硫酸鈉溶液，收集上層溶液，旋轉蒸發(fā)，氮氣吹干，用2 mL甲醇溶解，過0.45 μm有機濾膜后，待HPLC分析。

HPLC條件：色譜柱為YMC-C色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫25 ℃；流速0.6 mL/min；進樣量20 μL；檢測器：二極管陣列檢測器，檢測波長450 nm；流動相：A為水-MTBE-甲醇（5∶25∶75，V/V）；B為水-MTBE-甲醇（5∶85∶10，V/V）。梯度洗脫：0～4.5 min，95%～80% A、5%～20% B；4.5～12.5 min，80%～50% A、20%～50% B；12.5～18 min，50%～25% A、50%～75% B；18～24 min，25%～5% A、75%～95% B；24～30 min，5% A、95% B。

1.3.5 基因表達量分析

按照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書操作步驟提取發(fā)芽玉米總RNA，按照PrimeScriptMaster Mix試劑盒合成cDNA。根據(jù)NCBI上公布的各個基因序列設計引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。按Powerup SYBR Green Master Mix試劑盒配制real-time PCR體系。以玉米中的肌動蛋白基因（ACTIN）作為內參基因，用2法計算各個基因的相對表達量。

表1 real-time PCR所用引物序列Table 1 Primer sequences used for quantitative real-time PCR analysis

1.3.6 抗氧化酶活性的測定

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性通過其抑制50%硝基藍四唑的光還原能力確定。在25 ℃下反應30 min后，在560 nm波長處測定吸光度。對照組同時進行，不提取酶。比活力以每毫克蛋白質的活性單位表示。蛋白含量參照Lowry法蛋白濃度測定試劑盒測定。

過氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用愈創(chuàng)木酚氧化法測定。在470 nm波長下每隔1 min記錄一次吸光度的變化。以每分鐘吸光度變化0.01表示1 個過氧化物酶活性單位（U），最終酶活性以U/mg表示。

1.3.7 抗氧化能力的測定

采用Müller等的方法評價其清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、ABTS陽離子自由基的活性，分別在517 nm和405 nm波長處測定反應溶液的吸光度。結果以Trolox當量（mg/g和mmol/g）表示。鐵離子抗氧化能力（Ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）在593 nm波長處測定吸光度，用硫酸亞鐵當量表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 ABA處理對發(fā)芽玉米芽長和發(fā)芽率的影響

圖1 ABA處理對發(fā)芽玉米發(fā)芽率和芽長的影響Fig. 1 Effect of ABA treatment on the germination rate and sprout length of germinated maize

如圖1所示，玉米籽粒的發(fā)芽率和芽長隨著ABA質量濃度的增加呈現(xiàn)降低趨勢，當ABA質量濃度為2.5 mg/L時，發(fā)芽率和芽長分別較對照組降低3.9%和4.8%。ABA質量濃度增加則會抑制玉米籽粒的生長。而NaWoO處理后發(fā)芽率和芽長分別較對照組降低2.3%和3.8%。ABA有“休眠素”之稱，會促進種子休眠和抑制幼苗生長。Wang Zhiying等在研究中發(fā)現(xiàn)ABA會抑制甘藍芽的長度。這可能是因為添加外源ABA后玉米籽粒中ABA激素含量增高，而種子內ABA含量增加可能會導致種子生長趨勢緩慢。

2.2 ABA處理對發(fā)芽玉米可溶性蛋白、游離氨基酸、脯氨酸和內源ABA含量的影響

圖2 ABA處理對發(fā)芽玉米可溶性蛋白、游離氨基酸、脯氨酸和內源ABA含量的影響Fig. 2 Effect of ABA treatment on the contents of soluble protein, free amino acids, proline and endogenous ABA in germinated maize

如圖2所示，隨ABA質量濃度增加，發(fā)芽玉米籽粒中可溶性蛋白、游離氨基酸和脯氨酸的含量呈逐漸增加的趨勢，而NaWoO處理均低于對照組。在10 mg/L ABA處理組中，玉米籽粒中可溶性蛋白、游離氨基酸和脯氨酸含量分別較對照組提高9.9%、45.3%和47.0%。內源ABA含量隨外源ABA添加呈大幅度升高的趨勢。在7.5 mg/L ABA處理下內源ABA含量達到最高為47.16 ng/g，較對照組提高74.5%，當ABA質量濃度為10 mg/L時，內源ABA含量較7.5 mg/L ABA處理組略有下降（P＞0.05），但NaWoO較對照組下降43.6%。這說明外源ABA可以正調節(jié)內源ABA含量。脯氨酸是重要的滲透調節(jié)物質，可以起到膜穩(wěn)定劑的作用?？扇苄缘鞍卓商岣呒毎谋Ｋ芰?，從而保證細胞膜的穩(wěn)定性。王相敏等研究發(fā)現(xiàn)外源ABA可以提高玉米幼苗中可溶性蛋白和脯氨酸的含量。可溶性蛋白、游離氨基酸和脯氨酸含量的增加可以改善玉米籽粒的生理狀態(tài)，維持幼苗的正常生長。

2.3 ABA處理對發(fā)芽玉米VC和總酚含量的影響

圖3 ABA處理對發(fā)芽玉米中VC和總酚含量的影響Fig. 3 Effect of ABA treatment on the contents of vitamin C and total phenols in germinated maize

如圖3所示，隨著ABA質量濃度的增加發(fā)芽玉米籽粒中VC和總酚的含量呈先增加后降低趨勢?？偡雍吭? mg/L ABA處理下達到3.83 mg/g，較對照組提高51.4%，張一冉等發(fā)現(xiàn)ABA可以促進李果實中總酚含量的富集，其原因可能是ABA延緩果實多酚氧化酶的上升，并避免了多酚氧化酶和總酚的接觸。VC含量在7.5 mg/L ABA處理下達到最高，較對照組提高46.2%，可能是因為外源ABA處理通過影響AsA合成相關基因的表達從而促進VC含量的增加。而NaWoO處理后發(fā)芽玉米籽粒中總酚和VC含量較對照組有所降低，其原因可能是NaWoO間接抑制了ABA的合成，從而導致發(fā)芽玉米籽粒中VC和總酚含量有所降低。

2.4 ABA處理對發(fā)芽玉米富集類胡蘿卜素含量的影響

表2 不同質量濃度ABA處理下發(fā)芽玉米中類胡蘿卜素含量Table 2 Carotenoid contents in germinated maize treated with different concentrations of ABA μg/g

本研究在發(fā)芽玉米籽粒中檢測到6 種類胡蘿卜素，包括葉黃素、玉米黃質、α-隱黃質、β-隱黃質、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素。如表2所示，玉米籽粒中主要的類胡蘿卜素為葉黃素和玉米黃質，其他物質含量相對較低。經(jīng)過ABA處理后，發(fā)芽玉米籽粒6 種類胡蘿卜素含量隨ABA質量濃度增加呈現(xiàn)先升高而后降低的趨勢。經(jīng)過5 mg/L ABA處理后，6 種類胡蘿卜素含量均達到最大值，葉黃素、玉米黃質、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和β-隱黃質含量較對照組分別提高27.6%、20.1%、52.4%、71.7%和12.5%。而NaWoO處理后，葉黃素、玉米黃質、α-隱黃質和α-胡蘿卜素分別較對照組下降了10.6%、7.2%、6.6%和19%，β-隱黃質和β-胡蘿卜素較對照組差異不明顯。Barickman等發(fā)現(xiàn)外源ABA可以提高番茄中類胡蘿卜素含量，有效地保護葉黃素循環(huán)，并推測ABA可能通過增加PSY等關鍵酶的活性間接調控類胡蘿卜素途徑。

2.5 ABA處理對類胡蘿卜素合成酶基因表達量的影響

利用real-time PCR檢測ABA處理后類胡蘿卜素代謝相關基因表達的變化。如圖4所示，隨ABA質量濃度的增加，基因表達呈先上升后下降的趨勢。在5 mg/L ABA處理下，PSY、PDS、ZDS、LCYB、LCYE、BCH1和CYP97C的轉錄表達量最高，分別是對照組的1.95、2.02、1.70、1.65、1.96、1.71 倍和2.37 倍；NCED的轉錄表達在7.5 mg/L ABA處理下達到最高為1.65 倍。而NaWoO處理后關鍵酶基因表達量下調，其中NCED基因表達量下降最多。

圖4 ABA處理對類胡蘿卜素關鍵合成酶基因表達量的影響Fig. 4 Effect of ABA treatment on the expression of key genes associated with carotenoid synthase

在類胡蘿卜素途徑中，PSY主要決定反應速率和控制代謝通量。在擬南芥幼苗中，ABA可以正調控PSY基因表達從而導致類胡蘿卜素含量增加。Wu Qiong等發(fā)現(xiàn)ABA可以誘導番茄果實中PDS和ZDS基因表達上調，使類胡蘿卜素含量增加。而內源ABA可以通過調節(jié)基因表達刺激類胡蘿卜素的合成。本實驗發(fā)現(xiàn)ABA可以誘導PSY、PDS和ZDS基因表達量上調，這可能是促進類胡蘿卜素合成的原因。LCYB和LCYE可以催化番茄紅素產(chǎn)生α-胡蘿卜素或β-胡蘿卜素，BCH1可將β-胡蘿卜素轉化為β-隱黃質，BCH1和CYP97C可將α-胡蘿卜素轉化為葉黃素。因此，α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素和葉黃素含量的增加，可能與LCYB和LCYE基因表達上調有關；而β-隱黃質和葉黃素含量增加，可能是BCH1和CYP97C基因的上調原因。高等植物中ABA生物合成的關鍵酶是NCED。NCED基因過量表達可以促進ABA的合成。而NaWoO處理抑制類胡蘿卜素含量的富集，可能是NaWoO抑制了內源ABA的合成。

2.6 ABA處理對抗氧化酶活性的影響

ABA處理后顯著提高了發(fā)芽玉米籽粒中抗氧化酶活性（圖5）。5 mg/L ABA處理后SOD（48.36 U/mg）和POD（24.55 U/mg）較對照組分別提高40.0%和38.6%?？寡趸赶到y(tǒng)中的SOD、POD等抗氧化酶協(xié)同清除植物體內過量的活性氧，維持生理生化平衡。王相敏等發(fā)現(xiàn)添加外源ABA可以提高玉米在干旱環(huán)境中SOD和POD活性。這可能是因為ABA可以幫助清除植物體內的氧自由基，保護細胞盡量不受傷害，增強植物幼苗的抗氧化酶活性。而NaWoO抑制內源ABA的合成，可能是NaWoO處理后抗氧化酶活性降低的原因。

圖5 不同質量濃度ABA處理對發(fā)芽玉米中抗氧化酶活性的影響Fig. 5 Effect of different concentrations of ABA treatment on the antioxidant enzyme activity in germinated maize

2.7 ABA處理對抗氧化能力的影響

圖6 不同質量濃度ABA處理對發(fā)芽玉米中抗氧化能力的影響Fig. 6 Effect of different concentrations of ABA treatment on the antioxidant capacity of germinated maize

如圖6所示，隨著ABA質量濃度的升高，發(fā)芽玉米籽粒中總抗氧化能力呈先升高而后降低的趨勢。5 mg/L ABA處理后DPPH自由基清除能力（27.42 mg/g）、ABTS陽離子自由基清除能力（1.66 mmol/g）和FRAP（0.48 mmol/g）較對照組分別提高21.2%、12.2%和45.5%。DPPH和ABTS是基于單電子轉移反應機制的抗氧化評價方法，能夠反映體外清除自由基的能力。FRAP是通過氧化還原能力反映物質總抗氧化的活性。徐穎等在研究蘋果時發(fā)現(xiàn)，總酚與抗氧化之間存在顯著正相關性。本實驗結果與之相符合。

2.8 ABA處理下類胡蘿卜素含量與總酚、VC、抗氧化酶活性和抗氧化能力的相關性分析

圖7 ABA處理下類胡蘿卜素含量與總酚、VC、抗氧化酶活性和抗氧化能力的相關性分析Table 7 Correlation analysis between carotenoid content and total phenols, VC, antioxidant enzyme activity and antioxidant capacity in germinated maize with ABA treatment

如圖7所示，發(fā)芽玉米中抗氧化酶活性和抗氧化能力與總酚含量呈極顯著正相關（P＜0.01），與VC含量相關性較弱。Maisuthisakul等認為植物體內的抗氧化活性主要由酚類物質提供，酚類物質與抗氧化活性直接相關。同時葉黃素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素與抗氧化酶活性、抗氧化能力和總酚呈極顯著正相關（P＜0.01），玉米黃質和β-隱黃質與抗氧化酶活性、抗氧化能力和總酚呈顯著正相關（P＜0.05）。綜上，玉米籽粒中抗氧化能力和抗氧化酶活性的增強可能與總酚、葉黃素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素含量增加有關。

3 結 論

探究ABA對發(fā)芽玉米籽粒生長和類胡蘿卜素含量的影響。結果表明，ABA會抑制發(fā)芽玉米籽粒的發(fā)芽率和芽長。隨著ABA質量濃度升高，發(fā)芽玉米籽粒中可溶性蛋白、游離氨基酸、脯氨酸和內源激素ABA含量逐漸增加。ABA可以有效提高VC和總酚含量，但當ABA質量濃度過高時，則會出現(xiàn)降低的現(xiàn)象。5 mg/L ABA是發(fā)芽玉米籽粒富集類胡蘿卜素的最佳條件，這可能與ABA可以正調節(jié)合成類胡蘿卜素相關基因有關。而NaWoO抑制類胡蘿卜素含量的累積，這可能與NaWoO間接抑制內源激素ABA合成有關。5 mg/L ABA處理后，SOD、POD抗氧化酶活性和DPPH、ABTS、FRAP抗氧化能力達到最大值，并發(fā)現(xiàn)總酚、葉黃素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素含量與抗氧化能力和抗氧化酶活性呈顯著相關性。因此，5 mg/L ABA處理發(fā)芽玉米籽?？勺鳛樘岣甙l(fā)芽玉米類胡蘿卜素含量的一種方法，并為開發(fā)功能性發(fā)芽玉米提供理論參考。