宋小蘭 ，王麗萍 ，趙寧娟 ，李建慧 ，楊 璐 ，王 諾 ，康文利 ，王小忠 ，張 偉 ，武全香

（1.甘肅農(nóng)墾藥物堿廠有限公司，甘肅 蘭州 730060；2.蘭州大學(xué) 功能有機(jī)分子化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 化學(xué)化工學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

罌粟殼為罌粟科植物罌粟（Papaveris somniferumL.）的干燥成熟果殼，始載于《本草拾遺》[1]，具有斂肺澀腸、固腎止痛之功效，主治久咳勞嗽、喘息和心腹及筋骨疼痛等[2].罌粟殼氣微、味酸、微寒，為鎮(zhèn)痛止咳之良藥，因其主要成分嗎啡、那可丁和可待因等生物堿具有成癮性，因此被國家列入麻醉精神類藥品目錄嚴(yán)格管制[3].罌粟中同時(shí)還含有大量揮發(fā)油成分[4]，有關(guān)其藥理作用鮮有報(bào)道.中藥揮發(fā)油成分具有芳香解表、行氣活血、無成癮性等特點(diǎn).現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明揮發(fā)油具有鎮(zhèn)咳平喘、抗炎祛痰、調(diào)節(jié)心血管、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等[5-7].罌粟中無成癮性的揮發(fā)油是否具有鎮(zhèn)咳祛痰平喘的作用，其作用機(jī)制和靶點(diǎn)有待進(jìn)一步研究.

紫斑罌粟為罌粟科的一種，由國家管控定點(diǎn)種植于甘肅地區(qū).為充分挖掘該藥材的藥用價(jià)值，擴(kuò)大其臨床應(yīng)用范圍，本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜（GCMS）聯(lián)用技術(shù)對紫斑罌粟殼揮發(fā)油成分進(jìn)行定性分析，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接對紫斑罌粟殼揮發(fā)油鎮(zhèn)咳祛痰、平喘的活性成分、潛在作用靶點(diǎn)和通路進(jìn)行預(yù)測，為后續(xù)研究提供理論參考.

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

GCMS-QP2020氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；N1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會(huì)社）；電加熱套（上海越眾儀器設(shè)備有限公司）；揮發(fā)油提取器（四川蜀玻有限公司）.無水硫酸鈉（天津廣復(fù)科技發(fā)展有限公司，2 015 714）；正己烷（賽默飛公司，色譜純，純度≥99.9%）；水為超純水.

1.2 藥材

紫斑罌粟殼由甘肅農(nóng)墾藥物堿廠有限公司提供，經(jīng)蘭州大學(xué)功能有機(jī)分子化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室武全香教授鑒定為罌粟科植物紫斑罌粟的干燥成熟果殼.

1.3 揮發(fā)油的提取

紫斑罌粟殼通風(fēng)處自然干燥，粉碎至可通過二號(hào)至三號(hào)篩（中國藥典標(biāo)準(zhǔn)篩）.揮發(fā)油提取方法參考2020年版《中國藥典》（四部）通則“2204揮發(fā)油測定法（甲法）”進(jìn)行.稱取500 g藥粉置于圓底燒瓶中，加水3 000 mL，浸泡1 h.置于電熱套中緩緩加熱至微沸大約5 h得揮發(fā)油，罌粟揮發(fā)油得率為0.002 mL/g.采用適量無水硫酸鈉干燥后備用.

1.4 GC-MS分析

1.4.1 氣相色譜條件

色譜柱：HP-5MS石英毛細(xì)管柱（0.25 mm×30 m，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度220 ℃，輔助區(qū)280 ℃；程序升溫，起始溫度60 ℃，保持3 min，升溫（5 ℃/min）至240 ℃，改變升溫速率，升溫（10 ℃/min）至260 ℃，恒溫10 min；樣品進(jìn)樣量1.0 μL，分流比為11∶1；載氣量：氦氣（0.9 mL/min）.

1.4.2 質(zhì)譜條件

電子轟擊（EI）離子源，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍30～500 u.

1.4.3 紫斑罌粟殼揮發(fā)油成分潛在作用靶點(diǎn)

根據(jù)GC-MS定性分析獲得紫斑罌粟殼揮發(fā)油成分信息，通過化合物CAS號(hào)在PubChem數(shù)據(jù)庫中查詢成分相應(yīng)SMILES化學(xué)式.將獲得的化學(xué)式輸入Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstarget prediction.ch/）進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，以“Probability”大于中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)篩選藥物成分靶點(diǎn).

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 鎮(zhèn)咳化痰平喘靶點(diǎn)篩選

根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)“痰”和“氣道黏液高分泌”密切相關(guān)[8].選擇“phlegm”和“hypersecretion of airway mucus”為痰的關(guān)鍵詞，以“cough”和“asthma”為咳嗽和哮喘的關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）搜尋相關(guān)靶點(diǎn)，選擇“score”大于中位數(shù)靶點(diǎn)為疾病相關(guān)靶點(diǎn).

1.5.2 潛在活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選確定的活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niprot網(wǎng)站對基因名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化匹配.采用http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/工具對活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)取交集，篩選潛在調(diào)控基因并繪制Venn圖.利用Cytoscap 3.7.1軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖.

1.5.3 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

利用上步篩選的成分和疾病共有基因上傳至在線String 11.0數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）[9].選擇Multiple Proteins選項(xiàng)，輸入基因名稱，生物體以“Homo sapiens”作為背景條件.將獲得的proteinprotein interaction（PPI）數(shù)據(jù)利用R（version 3.6.2）（https://www.r-project.org/）進(jìn)行可視化，分析獲得核心靶點(diǎn)并繪制條形圖.

1.5.4 Gene ontology（GO）功能和Kyoto encyclopedia of genes and genomes（KEGG）富集分析

將獲得的鎮(zhèn)咳化痰、平喘潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù) 據(jù) 庫（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp）進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，以P≤0.05為顯著性篩選數(shù)據(jù).

1.5.5 分子對接驗(yàn)證

選擇紫斑罌粟殼揮發(fā)油核心成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證.利用AutoDock Vina 1.1.2軟件構(gòu)建對接模型，驗(yàn)證揮發(fā)油核心成分與鎮(zhèn)咳化痰平喘相關(guān)靶點(diǎn)的相互作用.具體過程如下：從PDB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中下載核心靶點(diǎn)的蛋白晶體結(jié)構(gòu)的pdb格式.核心成分通過SDF結(jié)構(gòu)Pubchem數(shù)據(jù)庫獲得，然后使用Chembio3D對其進(jìn)行能量最小化導(dǎo)出為mol2格式.最后將準(zhǔn)備的蛋白分子和化學(xué)小分子導(dǎo)入AutoDock Vina軟件進(jìn)行對接分析，整理所得結(jié)合評分.使用Discovery Studio 4.5軟件對代表性成分靶點(diǎn)結(jié)合復(fù)合物進(jìn)行相互作用分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 紫斑罌粟殼揮發(fā)油成分鑒定

紫斑罌粟殼揮發(fā)油經(jīng)GC-MS法測定后，獲得揮發(fā)油總離子流圖（如圖1所示），通過氣相色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫（NIST 2.0 數(shù)據(jù)庫）匹配分離、鑒定出28個(gè)化合物，占總峰面積68.39%，結(jié)果如表1所列.含量較高成分有2-甲氧基-4-乙烯基苯酚（12.92%）、n-棕櫚酸（8.68%）、2-甲基正庚烷（7.14%）、1-(1, 3a, 4,5, 6, 7-六環(huán)己-4-羥基-3, 8-二甲基薁-5-基)乙酰基（3.97%）、β-紫羅蘭酮（3.33%）、二環(huán)己基甲酮（3.29%）、油酸乙酯（2.77%）、植物酮（2.23%）、肉豆蔻酸（2.21%）、(10E, 12Z)-亞油酸（2.17%）、正十六烷（1.93%）、二十一烷醇（1.58%）和亞油酸乙酯（1.48%）等.

表 1 紫斑罌粟殼揮發(fā)油化學(xué)成分Table 1 Chemical composition of volatile oil from Papaver somniferum sp.hydbr.Ziban

圖1 紫斑罌粟殼揮發(fā)油總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of volatile oil from Papaver somniferum sp.hydbr.Ziban

2.2 揮發(fā)油成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)篩選

將從Pubchem數(shù)據(jù)庫獲得鑒定的揮發(fā)油中28種成分的SMILES化學(xué)式輸入Swiss Target Prediction網(wǎng)站進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測.(1R, 3R)1, 2, 3-三甲基環(huán)戊烷、2, 3, 4-三甲基戊烷、2, 4-葵二烯醛、香葉基丙酮、6-甲基-6-(5-甲基-2-庚酰呋喃、油酸乙酯、β-紫羅蘭酮和1-(1, 3a, 4, 5, 6, 7-六環(huán)己-4-羥基-3, 8-二甲基薁-5-基)乙酰基8種化合物未檢索到符合條件的靶點(diǎn).其余20種化合物的靶點(diǎn)經(jīng)過篩選去重后，最終得到與化學(xué)成分相關(guān)的259個(gè)靶點(diǎn)蛋白.以“cough”、 “asthma”、“hypersecretion of airway mucus”和“phlegm”為 關(guān) 鍵 詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫中篩選疾病的相關(guān)靶點(diǎn)，篩選去重后共獲得“咳嗽”相關(guān)靶點(diǎn)978個(gè)，“哮喘”相關(guān)靶點(diǎn)1 297個(gè)，“痰癥”相關(guān)的靶點(diǎn)10個(gè).通過在線韋恩圖獲得成分和疾病交集基因110個(gè)，并繪制Venn圖（如圖2所示）.

圖2 紫斑罌粟殼揮發(fā)油成分-疾病交集基因韋恩圖Fig.2 Venn diagram of composition of volatile oil of from Papaver somniferum sp.hydbr.Ziban-disease

2.3 構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

將20個(gè)化學(xué)成分和110個(gè)靶點(diǎn)通過Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖（如圖3所示）.網(wǎng)絡(luò)中共含有128個(gè)節(jié)點(diǎn)和189個(gè)邊.通過對網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)分析，度值排名前五且節(jié)點(diǎn)大于20的化合物分別為：亞油酸乙酯、己二酸、植物酮、共軛(10E,12Z)-亞油酸和棕櫚酸乙酯.

圖3 紫斑罌粟殼“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Network of 'ingredient-target-disease' of Papaver somniferum sp.hydbr.Ziban

2.4 PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將成分和疾病的110個(gè)共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫獲得靶點(diǎn)間的相互作用，設(shè)置參數(shù)默認(rèn)值，獲得蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（如圖4所示）.該網(wǎng)絡(luò)包含110個(gè)節(jié)點(diǎn)、832個(gè)邊.根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值采用R語言繪制排名前20的關(guān)鍵靶點(diǎn)柱狀圖（如圖5所示）.其中，腫瘤壞死因子（TNF），磷酸化蛋白激酶（AKT1），SRC蛋白激酶（SRC），表皮生長因子受體（EGFR）和絲裂原活化蛋白激酶 1（MAPK1）為調(diào)控疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn).

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Network of protein-protein interaction (PPI)

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)中核心靶點(diǎn)Fig.5 Key targets in PPI network

2.5 GO功能和KEGG通路

利用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能富集分析，共獲得627個(gè)條目.其中生物過程（BP）448條目，細(xì)胞成分（CC）66個(gè)條目，分子功能（MF）113個(gè)條目.以基因數(shù)為指標(biāo)進(jìn)行降序排列，選取各部分排名前15的條目進(jìn)行可視化作圖（如圖6所示）.生物過程結(jié)果顯示，紫斑罌粟揮發(fā)油鎮(zhèn)咳化痰、平喘的靶點(diǎn)主要與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程相關(guān).細(xì)胞成分結(jié)果表明揮發(fā)油作用于細(xì)胞膜、細(xì)胞溶質(zhì)、細(xì)胞漿、核和膜組成部分等.分子功能結(jié)果顯示葉椒揮發(fā)油鎮(zhèn)咳化痰、平喘作用主要與蛋白結(jié)合、ATP結(jié)合、同蛋白結(jié)合、酶結(jié)合和金屬離子結(jié)合等相關(guān).KEGG通路富集分析顯示110個(gè)共有靶點(diǎn)富集在133條通路上（P＜0.05）.選取基因數(shù)排名前十五的通路作富集氣泡圖（如圖7所示）.癌癥信號(hào)通路，神經(jīng)配體-受體相互作用、PI3K-Akt信號(hào)通路、肺癌蛋白多糖、化學(xué)致癌-受體激活和絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路等為揮發(fā)油調(diào)控鎮(zhèn)咳化痰、平喘的關(guān)鍵信號(hào)通路.

圖6 GO功能富集分析Fig.6 Enrichment analysis using GO function

圖7 KEGG通路富集分析Fig.7 Enrichment analysis using KEGG pathway

2.6 分子對接

篩選罌粟揮發(fā)油中的5個(gè)關(guān)鍵成分，分別于蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中的5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行半柔性對接，結(jié)合自由能范圍為（-3.9～ -7.0） kJ/mol（如表2所列）.以蛋白晶體復(fù)合物中原始配體作為對照藥物，以結(jié)合自由能為評價(jià)指標(biāo).一般認(rèn)為，結(jié)合自由能小于0表明受體和配體能夠自由結(jié)合，結(jié)合自由能越小活性越強(qiáng)[10].由結(jié)果可知，5個(gè)關(guān)鍵成分均能與核心靶點(diǎn)自由結(jié)合，其中共軛(10E, 12Z)-亞油酸與AKT1（-7.0 kJ/mol）、植物酮與EGFR（-5.3 kJ/mol）、亞油酸乙酯與MAPK1（-5.2 kJ/mol）、共軛(10E,12Z)-亞油酸與SRC（-5.5 kJ/mol）、己二酸與TNF（-5.2 kJ/mol）結(jié)合相對較好.分析結(jié)合較好的化合物對接情況，結(jié)果表明受體蛋白與小分子配體之間主要是以氫鍵、烷基和Pi-烷基等相互作用（如圖8所示）.

圖8 核心成分和靶點(diǎn)分子對接結(jié)合相互作用模式圖（3D和2D）（A）共軛(10E,12Z)-亞油酸-AKT1，（B）植物酮-EGFR，（C）亞油酸乙酯-MAPK1，（D）共軛(10E,12Z)-亞油酸-SRC，（E）己二酸-TNFFig.8 Diagrams (3D and 2D) of docking and binding interaction between core components and target molecules(A) 10(E),12(Z)-conjugated linoleic acid-AKT1, (B) 6, 10, 14-trimethyl-2-Pentadecanone-EGFR, (C) linoleic acid ethyl ester -MAPK1, (D) 10(E),12(Z)-conjugated linoleic acid-SRC, (E) hexanedioic acid -TNF

3 結(jié)論

罌粟殼中主要含有嗎啡、那可丁、罌粟堿和可待因等生物堿類化合物，而對其揮發(fā)油類研究較少.本研究采用GC-MS結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測紫斑罌粟殼揮發(fā)油類成分鎮(zhèn)咳化痰平喘的藥效物質(zhì)成分及作用機(jī)制，為更好的開發(fā)利用該資源提供參考.GC-MS共鑒定出紫斑罌粟殼揮發(fā)油中28種成分，通過化學(xué)成分靶點(diǎn)預(yù)測數(shù)據(jù)庫獲得20個(gè)活性成分，259個(gè)相關(guān)靶點(diǎn).通過與疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集獲得110種潛在基因.通過Cytoscape軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，度值前五的化合物為：亞油酸乙酯、己二酸、植物酮、共軛(10E,12Z)-亞油酸和棕櫚酸乙酯.PPI蛋白相互作用結(jié)果顯示TNF、AKT1、SRC、EGFR和MAPK1為罌粟殼揮發(fā)油調(diào)控咳嗽、痰多和哮喘等相關(guān)疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn).TNF及其介導(dǎo)炎癥因子與哮喘、氣道高反應(yīng)、肺功能和免疫功能等密切相關(guān)，研究表明哮喘患者的TNF-α和IL-2、IL-4、IL-6水平顯著升高[11].AKT1為絲氨酸/蘇氨酸激酶，與炎癥、自噬和細(xì)胞凋亡多種調(diào)控通路相關(guān).Akt 能夠激活HIF-1α蛋白表達(dá)，抑制肺泡表面活性物質(zhì)和肺上皮細(xì)胞的修復(fù)，進(jìn)而加重肺纖維化.而過度活化的AKT能夠激活NF-κB等炎癥反應(yīng)及下游凋亡因子等的表達(dá)[12-14].MAPK1是機(jī)體內(nèi)重要的炎癥和免疫調(diào)節(jié)因子，是調(diào)控痰液痰黏液分泌關(guān)鍵的通路.研究表明抑制該蛋白的表達(dá)能夠減輕小鼠肺組織炎癥因子水平，減少粘液分泌，抑制氣道重塑[15].GO功能富集分析結(jié)果也顯示紫斑罌粟揮發(fā)油鎮(zhèn)咳化痰平喘的靶點(diǎn)主要與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程相關(guān).KEGG通路富集到靶點(diǎn)最多的3條通路為腫瘤通路，神經(jīng)配體-受體相互作用、PI3K-Akt信號(hào)通路等.表明罌粟殼揮發(fā)油有效成分通過調(diào)控多條通路，共同協(xié)調(diào)作用發(fā)揮鎮(zhèn)咳平喘的作用.分子對接結(jié)果顯示紫斑罌粟殼揮發(fā)油核心成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)均能自由結(jié)合.表明揮發(fā)油關(guān)鍵成分與TNF、AKT1、SRC、EGFR和MAPK1等核心靶點(diǎn)具有一定的生物活性.

表 2 核心成分與核心靶蛋白對接結(jié)果Table 2 Docking results of core components and core target proteins

綜上所述，本研究通過GC-MS鑒別出紫斑罌粟殼揮發(fā)油中28種化學(xué)成分，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接預(yù)測紫斑罌粟殼揮發(fā)油中關(guān)鍵成分，通過調(diào)節(jié)TNF、AKT1、SRC、EGFR和MAPK1等關(guān)鍵靶點(diǎn)，進(jìn)而協(xié)同調(diào)控腫瘤通路，神經(jīng)配體-受體相互作用、PI3K-Akt信號(hào)通路等多條信號(hào)通路發(fā)揮鎮(zhèn)咳祛痰、平喘的治療作用.為闡明中藥通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路發(fā)揮治療疾病的作用提供依據(jù)，為后續(xù)試驗(yàn)研究罌粟殼揮發(fā)油的藥效物質(zhì)及作用機(jī)制提供參考.