劉子蔚，楊少民，陳海雄，郭保亮，張榕，周翠銣，李曉虹，胡秋根*

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是肝臟最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升，是導致全球癌癥主要死亡的原因之一。目前HCC在我國常見的惡性腫瘤中居于第4位，在癌癥導致死亡病因中居于第2位[1]。手術(shù)切除是HCC國內(nèi)外公認的早期根治性的治療方式，但手術(shù)切除術(shù)后5年的復發(fā)率高達60%～70%，術(shù)后高復發(fā)率是影響HCC患者術(shù)后遠期生存狀況的重要因素[2-3]。Ki-67是一種與細胞增殖活性有關(guān)的核抗原，它是反映細胞增殖水平的常用指標，一些學者認為Ki-67是評估HCC患者術(shù)后復發(fā)及不良預后的重要生物學標志物[4-5]。目前Ki-67檢測依賴于病理學檢查，穿刺活檢是獲取病理組織的常用方法，但它是一種侵入性的檢查，具有一定的局限性[6-7]。術(shù)前使用無創(chuàng)的定量方法來評估Ki-67的表達對術(shù)前臨床治療方案的制訂具有積極作用。肝臟特異性對比劑釓塞酸二鈉（gadolinium-ethoxybenzyl-diethylenetriamine pentaacetic acid, Gd-EOB-DTPA）能被正常肝細胞攝取，越來越被應(yīng)用于肝臟疾病的診斷及評估。既往研究表明信號強度（signal intensity, SI）可以定量評估HCC 的腫瘤特性[8-10]，然而SI 常受到掃描參數(shù)的影響且與Gd-EOB-DTPA 濃度不成比例[11-12]。T1 mapping 技術(shù)是一種無創(chuàng)的定量分析組織T1 值的方法，它能夠與Gd-EOB-DTPA良好結(jié)合，更準確、客觀地提供攜帶功能信息的MRI定量圖像。兩者結(jié)合能夠定量反映HCC 攝取有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白多肽（organic anion transporting polypeptide, OATP）的能力，從而反映HCC的腫瘤特征。既往研究在評估HCC的病理分化[13]、微血管侵犯[14]、切除復發(fā)[15]等方面取得了一定的研究成果。這為術(shù)前精準無創(chuàng)地評估Ki-67表達提供了依據(jù)。迄今，國內(nèi)利用Gd-EOB-DTPA 增強MRI T1 mapping 定量參數(shù)評估HCC Ki-67 表達相關(guān)性的研究報道少見。本研究旨在探討Gd-EOB-DTPA增強MRI T1 mapping定量參數(shù)與HCC Ki-67表達的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本研究屬于回顧性研究，經(jīng)南方醫(yī)科大學順德醫(yī)院（佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院）倫理委員會批準，免除受試者知情同意，批準文號：科研倫審20201124。本研究回顧性分析2019年7月至2020年12 月南方醫(yī)科大學順德醫(yī)院（佛山市順德區(qū)第一人民醫(yī)院）因單發(fā)HCC行根治性手術(shù)的患者資料。納入標準：（1）術(shù)后病理診斷為單發(fā)HCC并行根治性手術(shù)；（2）術(shù)前2 周內(nèi)行Gd-EOB-DTPA 增強MRI T1 mapping檢查；（3）病理標本均行Ki-67 免疫組化染色。排除標準：（1）術(shù)后病理診斷為其他肝臟腫瘤或多發(fā)性（＞2 個）HCC；（2）各種原因?qū)е碌腗RI 圖像存在嚴重偽影不適合診斷；（3）術(shù)前接受任何腫瘤治療。

1.2 MRI檢查方法

所有患者均使用3.0 T MRI（西門子，Skyra 3.0 T MR）掃描儀、腹部專用線圈（體部相控陣線圈，18 通道），采用膈肌導航技術(shù)進行掃描，檢查范圍自肝臟上緣至肝臟下緣。先行軸位T1WI容積內(nèi)插法體部檢查（volume interpolated body examination, VIBE）序列及軸位T1 mapping平掃，接著采用Gd-EOB-DTPA進行軸位增強掃描，注射對比劑后20～30 s行動脈期掃描，60 s、150 s分別行門脈期、平衡期掃描，再行軸位T2WI 刀鋒（BLADE）序列掃描，20 min 后行軸位肝膽期成像及軸位T1 mapping 掃描。增強掃描使用Gd-EOB-DTPA（Primo-vist; Bayer Schering Pharma AG, Berlin, Germany）對比劑，采用高壓注射器自肘靜脈注入，劑量0.1 mL/kg，流速1.0 mL/s，然后以相同速率注射30 mL 生理鹽水沖管。T1 mapping采用T1Map-雙翻轉(zhuǎn)角VIBE 序列，并進行B1 mapping 勻場校正，序列掃描完后自動生成mapping 圖像，主要參數(shù)：TR 5.01 ms，TE 2.3 ms，層厚4 mm，雙翻轉(zhuǎn)角3°、15°，視野（field of view, FOV）380 mm×285 mm，矩陣224×168；T1WI-VIBE 序列主要參數(shù)：TR 4.00 ms，TE 1.29、2.52 ms，層厚3 mm，F(xiàn)OV 380 mm×380 mm，矩陣320×240。

1.3 圖像分析與數(shù)據(jù)測量

將患者的影像數(shù)據(jù)從PACS 中以DICOM 格式導出，應(yīng)用RadiAnt DICOM Viewer 2020.2（https://www.radiantviewer.com）軟件進行閱片。由2名分別有12年和15年腹部專業(yè)診斷經(jīng)驗的放射科副主任醫(yī)師在不知曉患者臨床資料的前提下測量數(shù)據(jù)，測量前先進行培訓。感興趣區(qū)（region of interest, ROI）勾畫盡可能選取最大層面，盡可能保持各序列同一層面，ROI應(yīng)盡可能放置在病變動脈期強化區(qū)域，如果腫瘤較大（＞5 cm），則采用多個ROI取平均值的方法，避開出血、壞死液化、血管，采用復制、粘貼方法確保各序列ROI面積的一致性。設(shè)定測量正常肝組織及病灶選取的ROI面積范圍約為0.5～2.0 cm2，每個ROI測量3次后取平均值，用2名醫(yī)師測量結(jié)果的平均值作為最終測量值。測量以下數(shù)據(jù)：（1）平掃（pre-enhancement, pre）、動脈期（arterial phase, AP）、門脈期（the portal venous phase, PP）、平衡期（equilibrium phase, EP）及肝膽期（hepatobiliary phases, HBP）的腫瘤與同一肝段的正常肝組織的SI，計算腫瘤-正常肝實質(zhì)信號強度比[16-17]（tumor to liver contrast ratio, TLR）及對比強化比（contrast enhancement ratio, CER），TLR=SI腫瘤/SI肝臟，CER=（TLR增強后-TLR平掃）/TLR平掃。（2）在T1 mapping 測量病灶平掃T1 弛豫時間（T1 relaxation time, T1rt-Pre）、肝膽期T1弛豫時間（T1 relaxation time, T1rt-20min），計算T1 弛豫時間減低率（reduction rate of T1 relaxation time, rrT1rt），rrT1rt-20min=[（T1rt-Pre）-（T1rt-20min）]/T1rt-Pre。

1.4 病理分析

所有組織標本均在我院病理科進行切片、蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining, HE）以及免疫組化Ki-67 特殊染色。在不知道影像學征象的情況下，由兩名高年資病理科醫(yī)師獨立觀察，病理結(jié)果有異議時協(xié)商達成一致意見。對Ki-67的判定：在高倍顯微鏡（×400）下取5 個FOV，每個FOV 計數(shù)100 個細胞，并計數(shù)腫瘤內(nèi)的熱點區(qū)域[細胞核出現(xiàn)棕褐（黃）色顆粒]，Ki-67 認定為陽性細胞占總細胞的百分比，取其平均值。由于Ki-67的表達多為同質(zhì)性，故以陽性染色細胞的百分比進行評分[18-19]，并分為兩組：≤25%為Ki-67 低表達組、＞25%為Ki-67 高表達組。

1.5 統(tǒng)計學分析

使用Windows 的SPSS 22.0 版進行統(tǒng)計學分析，采用Kolmogorov-Smirnov 方法檢測樣本是否符合正態(tài)分布。符合正態(tài)分布的計量資料以（xˉ±s）表示，不符合正態(tài)分布的計量資料用中位數(shù)（四分位間距）表示。采用組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（inter-class correlation coefficient, ICC）評價2 名醫(yī)師測量結(jié)果的一致性（ICC＞0.75認為具有良好的一致性，0.65～0.75認為一致性一般，ICC＜0.65則認為一致性差）。MRI各定量參數(shù)與Ki-67 之間相關(guān)性比較采用Spearman 相關(guān)系數(shù)。Ki-67高、低表達組間比較采用獨立樣本t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗。根據(jù)受試者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲線下面積（area under the curve, AUC），敏感度、特異度、Youden指數(shù)（特異度+敏感度-1）、臨界值（cut-off值）評估各參數(shù)在Ki-67高、低表達組間的診斷效能。采用DeLong 檢驗比較各參數(shù)曲線下面積AUC 值的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 病例入組及分組

最終納入74 例患者病例，男65 例、女9 例，年齡30～84（59.69±10.57）歲。Ki-67≤25%組男33 例，女7 例，年齡（60.9±11.2）歲，肝功能Child-Pugh 評分A 級36 例、B 級4 例；Ki-67＞25%組男32 例，女2例，年齡（58.2±9.7）歲，肝功能Child-Pugh評分中A 級32 例，B 級2 例。本研究中性別、年齡、肝功能Child-Pugh評分在兩組間的差異無統(tǒng)計學意義（P值分別為0.166、0.278、0.518）。

2.2 2名醫(yī)師測量結(jié)果的一致性

2 名 醫(yī) 師 測 量T1rt-Pre、T1rt-20min、TLR-Pre、TLR-AP、TLR-PP、TLR-EP、TLR-HBP 的ICC 分別為0.839（95%CI：0.717～0.912）、0.849（95%CI：0.732～0.917）、0.817（95%CI：0.681～0.899）、0.781（95%CI：0.623～0.878）、0.796（95%CI：0.647～0.887）、0.831（95%CI：0.702～0.907）、0.807（95%CI：0.662～0.887）。2名醫(yī)師測量間的一致性較好。

2.3 Gd-EOB-DTPA 增強MRI 定量參數(shù)與Ki-67 的相關(guān)性分析

T1rt-Pre、T1rt-20min 與Ki-67 呈 強 正 相 關(guān)[r=0.668（95%CI：0.515～0.780），r=0.659（95%CI：0.494～0.784），P均＜0.001]（圖1）；TLR-Pre、TLR-HBP與Ki-67呈中等程度負相關(guān)[r=-0.495（95%CI：-0.647～-0.300），r=-0.497（95%CI：-0.670～-0.288），P均＜0.001]；TLR-PP、TLR-EP與Ki-67呈弱負相關(guān)[r=-0.272（95%CI：-0.483～-0.035）,P=0.019；r=-0.362（95%CI：-0.568～-0.142），P=0.002]。其余參數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

圖1 T1 弛豫時間（T1rt-Pre、T1rt-20min）與Ki-67 相關(guān)性散點圖。 圖2 男，48 歲，肝細胞癌（2 級），Ki-67 低表達。2A：T1rt-Pre 橫斷面，T1rt-Pre=（958.0±43.5）ms；2B：T1rt-20min 橫斷面，T1rt-20min=（513.3±21.4）ms；2C：Ki-67 免疫組化染色（×400），Ki-67 約為10%。 圖3 男，47 歲，肝細胞癌（3 級），Ki-67 高表達。3A：T1rt-Pre 橫斷面，T1rt-Pre=（1504.6±90.5）ms；3B：T1rt-20min 橫斷面，T1rt-20min=（854.9±36.6）ms；3C：Ki-67 免疫組化染色（×400），Ki-67約為50%。T1rt-Pre：MRI T1 mapping平掃T1弛豫時間；T1rt-20min：釓塞酸二鈉增強MRI T1 mapping肝膽期T1弛豫時間。Fig. 1 Scatter plot of correlation between T1 relaxation time (T1rt-Pre, T1rt-20min) and Ki-67. Fig. 2 Male, 48-year-old, hepatocellular carcinoma grade 2, low expression of Ki-67. 2A: Cross section of T1rt-Pre, T1rt-Pre=(958.0±43.5) ms; 2B: Cross section of T1rt-20min, T1rt-20min=(513.3±21.4) ms; 2C: Pathological immunohistochemical Ki-67 (×400), Ki-67 was about 10%. Fig. 3 Male, 47-year-old, hepatocellular carcinoma grade 3, high expression of Ki-67. 3A: Cross section of T1rt-Pre,T1rt-Pre=(1504.6±90.5)ms;3B:Cross section of T1rt-20min,T1rt-20min=(854.9±36.6)ms;3C:Pathological immunohistochemical Ki-67(×400), Ki-67 was about 50%. T1rt-Pre: T1 relaxation time of unenhanced MRI T1 mapping; T1rt-20min: T1 relaxation time in the hepatobiliary phase with Gd-EOB-DTPA enhanced MRI T1 mapping.

表1 釓塞酸二鈉增強MRI定量參數(shù)與Ki-67相關(guān)性Tab.1 Correlation between quantitative parameters of Gd-EOB-DTPA MRI and Ki-67

2.4 Ki-67低、高表達組間比較及診斷效能分析

本研究中Ki-67 低、高表達組間T1rt-Pre、T1rt-20min、TLR-Pre、TLR-AP、TLR-EP、TLR-HBP 差異均具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），其他參數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）（表2）。研究所示Ki-67低表達組表現(xiàn)為較小的T1rt-Pre、T1rt-20min（圖2），Ki-67 高表達組表現(xiàn)為較大的T1rt-Pre、T1rt-20min（圖3）。T1rt-Pre、T1rt-20min、TLR-Pre、TLR-AP、TLR-EP、TLR-HBP的AUC值分別為0.868（95%CI：0.769～0.936）、0.890（95%CI：0.795～0.951）、0.717（95%CI：0.670～0.869）、0.646（95%CI：0.527～0.754）、0.680（95%CI：0.561～0.784）、0.782（95%CI：0.670～0.869）（P均＜0.05）（表3）。結(jié)果表明T1rt-Pre、T1rt-20min具有較高的診斷效能，臨界值分別為1278.73、724.5 ms（圖4），利用DeLong檢驗兩兩比較結(jié)果表明T1rt-Pre、T1rt-20min 分別與TLR-Pre、TLR-AP、TLR-EP的AUC值差異具有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05），而與TLR-HBP 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表4）。

圖4 T1rt-Pre、T1rt-20min、TLR-Pre、TLR-AP、TLR-EP、TLR-HBP 的ROC曲線。T1rt-Pre：MRI T1 mapping平掃T1弛豫時間；T1rt-20min：釓塞酸二鈉增強MRI T1 mapping肝膽期T1弛豫時間；TLR：腫瘤-正常肝實質(zhì)信號強度比；Pre：平掃；AP：動脈期；EP：平衡期；HBP：肝膽期。Fig.4 ROC curves of T1rt-Pre,T1rt-20min,TLR-Pre,TLR-AP,TLR-EP,TLR-HBP. T1rt-Pre: T1 relaxation time of unenhanced MRI T1 mapping;T1rt-20min: T1 relaxation time in the hepatobiliary phase with Gd-EOB-DTPA enhanced MRI T1 mapping; TLR: tumor to liver contrast ratio; Pre: pre-enhancement; AP: arterial phase; EP: equilibrium phase;HBP:hepatobiliary phases.

表2 兩組間定量參數(shù)比較分析Tab.2 Comparative analysis of quantitative parameters between two groups

表3 兩組間定量參數(shù)診斷效能分析Tab.3 Analysis of diagnostic efficacy of quantitative parameters between two groups

表4 各參數(shù)間AUC值兩兩比較（Z/P值）Tab.4 Pairwise comparison of AUC values between parameters(Z/P value)

3 討論

本研究探討了Gd-EOB-DTPA T1 mapping 定量參數(shù)與Ki-67的相關(guān)性，并將Ki-67為分高、低表達組進行組間比較，分析各參數(shù)的診斷效能及曲線下面積的差異。研究表明Gd-EOB-DTPA 增強MRI T1 mapping所測的T1rt-Pre、T1rt-20min與HCC Ki-67表達具有較強的正相關(guān)性，且T1rt-Pre、T1rt-20min 對HCC Ki-67 表達具有較高的評估價值，要優(yōu)于基于信號強度比的定量參數(shù)。本研究結(jié)果證明T1 mapping具有術(shù)前無創(chuàng)地預測Ki-67表達的潛在價值，能為HCC患者術(shù)前手術(shù)方案的制訂起到積極的作用。

3.1 各定量參數(shù)與Ki-67的相關(guān)性

本研究結(jié)果表明T1rt-Pre、T1rt-20min與Ki-67具有較強的正相關(guān)性，TLR-Pre、TLR-HBP 與Ki-67 呈中等程度負相關(guān)，TLR-PP、TLR-EP 與Ki-67 呈弱負相關(guān)，而CER 參數(shù)差異無統(tǒng)計學意義。Chen等[20]研究結(jié)果中的T1rt-Pre、T1rt-20min與Ki-67相關(guān)性與本研究結(jié)果相一致，但其研究結(jié)果中的SI-Pre、SI-HBP與Ki-67相關(guān)性高于本研究的TLR-Pre、TLR-HBP。為了使所測數(shù)值相對準確，本研究采用TLR=SI腫瘤/SI肝臟的方法測量，該方法可以降低肝臟背景的干擾，因此，本研究結(jié)果更具可靠性。而且，T1 mpping反映的是組織的固定特征，不受掃描序列參數(shù)限制，且與組織中的釓對比劑的濃度成正性相關(guān)[21-22]。而SI 是相對數(shù)值，機器與掃描參數(shù)的不同均會影響SI的大小，且與對比劑濃度不呈線性關(guān)系。因此，T1 mapping 值比信號強度比值更加準確[23-24]。

3.2 Ki-67高、低表達組間比較及診斷效能分析

本研究多期增強掃描得出的TLR-Pre、TLR-AP、TLR-EP組間比較差異具有統(tǒng)計學意義，但診斷效能偏低，而肝膽期TLR-HBP診斷效能相對較高。該結(jié)果與既往相關(guān)研究結(jié)果相一致。姜虹等[25]研究表明基于動脈期得出的SI的診斷效能偏低，而肝膽期得出的信號強度增強比診斷效能較高。同樣，Ye等[16]研究也表明肝膽期的TLR具有較高的診斷效能。胡夢潔等[26]的研究也得出肝膽期的信號強度比是Ki-67高表達的獨立預測因子。導致這一現(xiàn)象的可能原因在于Gd-EOB-DTPA是一種肝膽特異性MRI對比劑，可通過OATP途徑被肝細胞吸收，具有雙重的細胞外和肝膽特性，可以提供功能性和結(jié)構(gòu)性的肝膽期信息[27-29]。不同于上述研究，本研究還發(fā)現(xiàn)，Gd-EOB-DTPA 結(jié)合T1 mapping（T1rt-Pre、T1rt-20min）具有更高的診斷價值，其AUC值與TLR-Pre、TLR-AP、TLR-EP差異具有統(tǒng)計學意義，其中T1rt-20min診斷效能最高，AUC 值與TLR-HBP 差異雖然無統(tǒng)計學意義，但其特異度有明顯的提高。T1rt-Pre 的診斷效能與T1rt-20min 相仿，同樣具有較高的敏感度及特異度，可見Ki-67 高表達的HCC 組織中具有更長的T1弛豫時間[16,20]。導致這一結(jié)果的可能原因在于：其一，當腫瘤細胞增殖越活躍，其單位體積內(nèi)腫瘤細胞排列更緊密，從而導致T1rt-Pre 值越大；其二，當腫瘤細胞增殖越活躍，腫瘤中含有的正常肝細胞比例越低，那么Gd-EOB-DTPA 吸收也隨之減少，從而導致T1rt-20min值越大。

3.3 本研究的局限性

本研究具有一些局限性。（1）本研究為回顧性研究且樣本量相對較少，可能存在選擇性偏倚；（2）目前Ki-67 分組仍未有統(tǒng)一標準，各研究存在差異，故需要多中心大樣本研究不同分組的差異，比較不同分組的診斷效能；（3）ROI 為手動勾畫，可能存在測量誤差；（4）本研究未考慮肝內(nèi)多發(fā)病灶的影像圖像與病理圖像一一對應(yīng)，而多發(fā)性肝癌臨床并不少見，因此，在后續(xù)前瞻性研究中，我們將聯(lián)合肝膽外科、病理科進一步精準匹配病理影像結(jié)果。

綜上所述，本研究表明Gd-EOB-DTPA 增強MRI T1 mapping 所測的T1rt-Pre、T1rt-20min 與HCC Ki-67 表達具有較強的正相關(guān)性，且T1rt-Pre、T1rt-20min 在Ki-67高、低表達組間的診斷效能較高，對HCC Ki-67表達具有較好的評估能力。

作者利益沖突聲明：全部作者均聲明無利益沖突。