付超群 周大標(biāo) 石 全

(1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)， 湖北 武漢 430065； 2. 湖北中醫(yī)藥大學(xué) 附屬湖北省中醫(yī)院 皮膚科， 湖北 武漢 430061； 3. 湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院， 湖北 武漢 430015)

帶狀皰疹是由水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zostervirus, VZV)引起的感染性皮膚疾病，常表現(xiàn)為受累區(qū)域疼痛及單側(cè)周圍神經(jīng)簇狀水泡聚集，年齡增長(zhǎng)和免疫抑制是VZV再激活的兩個(gè)主要誘發(fā)因素。帶狀皰疹最常見(jiàn)的并發(fā)癥是帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛，其復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。目前西醫(yī)主要采取抗病毒、鎮(zhèn)痛、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)及疫苗接種等對(duì)癥治療，但西藥會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)[2]。

中醫(yī)藥是祖國(guó)醫(yī)學(xué)的瑰寶，在帶狀皰疹治療方面具有豐富經(jīng)驗(yàn)并取得較好的臨床效果?，F(xiàn)代藥理研究表明紫草、白鮮皮具有抗炎、鎮(zhèn)痛及抗氧化等特性，可以改善帶狀皰疹患者生活質(zhì)量，促進(jìn)皮疹愈合，在減輕疼痛以及預(yù)防相關(guān)并發(fā)癥方面療效明確[3-4]。然而，由于中藥成分的復(fù)雜多樣性，目前有關(guān)紫草、白鮮皮治療帶狀皰疹的確切機(jī)制仍不清楚。因此本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)紫草-白鮮皮治療帶狀皰疹的可能機(jī)制進(jìn)行探討，為臨床治療帶狀皰疹提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 紫草-白鮮皮有效成分篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)檢索紫草-白鮮皮有效成分，按照口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%，類藥性(drug-likeness, DL)≥0.18的條件篩選[5]。

1.2 疾病靶點(diǎn)獲取

使用OMIM、Disgenet、GeneCards以“herpeszoster”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得相關(guān)疾病作用靶點(diǎn)。

1.3 藥物疾病靶點(diǎn)篩選

在Venny 2.1在線軟件將上述獲得的藥物與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得紫草-白鮮皮治療帶狀皰疹的潛在作用靶點(diǎn)。

1.4 構(gòu)建藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

使用Cytoscape 3.8.2軟件，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入藥物-疾病靶點(diǎn)并進(jìn)行檢索，設(shè)置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為0.4，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)。

1.6 GO和KEGG富集分析

基于R軟件使用Bioconductor生物信息軟件包進(jìn)行關(guān)鍵靶基因的基因本體(gene ontology, GO)與京都基因和基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)功能富集分析。

2 結(jié)果

2.1 中藥、疾病化學(xué)成分篩選

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)白鮮皮-紫草的有效成分進(jìn)行篩選，獲得紫草潛在活性成分11個(gè)(見(jiàn)表1)，白鮮皮活性成分18個(gè)(見(jiàn)表2)。在OMIM、Disgenet、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，篩選出645個(gè)藥物靶點(diǎn)，去重后獲得疾病靶點(diǎn)473個(gè)。繪制韋恩圖，取交集后獲得中藥疾病共同靶點(diǎn)52個(gè)(見(jiàn)圖1)。

表1 TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中保留的紫草藥物活性成分表

表2 TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中保留的白鮮皮藥物活性成分表

圖1 白鮮皮-紫草與帶狀皰疹靶點(diǎn)韋恩圖

2.2 中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

將中藥紫草、白鮮皮中29個(gè)活性成分與52個(gè)藥物-疾病靶點(diǎn)輸入Cytoscape軟件中，繪制“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖2)。靶點(diǎn)關(guān)系顯示白鮮皮、紫草主要有芋茵素、乙酰紫草素、谷甾醇、黃芩素及槲皮素等成分可發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化及營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)的作用，達(dá)到治療帶狀皰疹的目的。

注：紫色代表中藥紫草-白鮮皮，綠色代表中藥24種活性成分，藍(lán)色代表52個(gè)共同靶點(diǎn)，紅色代表帶狀皰疹疾病

2.3 PPI蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將上述52個(gè)共同靶點(diǎn)輸入到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，獲取靶點(diǎn)關(guān)系數(shù)據(jù)，將其導(dǎo)入Cytoscape軟件，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖3A)。其中主要靶點(diǎn)有腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)、絲氨酸激酶(serine/threonine-protein kinase, AKT1)、絲裂原活化蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3, MAPK3)、雌激素受體1(estrogen receptor 1, ESR1)、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, MTOR)等(見(jiàn)圖3B)，這些靶點(diǎn)與免疫調(diào)節(jié)、炎癥、病毒基因復(fù)制、細(xì)胞增殖分化相關(guān)。

注：A：蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(節(jié)點(diǎn)的大小、顏色及其深淺變化代表degree值的大小)；B：基于PPI拓?fù)浞治龅暮诵陌悬c(diǎn)排序(degree排名前30)

2.4 GO與KEGG功能富集分析

使用R語(yǔ)言將中藥紫草-白鮮皮與帶狀皰疹疾病的52個(gè)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO與KEGG分析。GO通路獲得1 465條生物學(xué)過(guò)程(如圖4A)、50條細(xì)胞組分(如圖4B)及79個(gè)分子功能(如圖4C)，這三部分涉及細(xì)胞凋亡、物質(zhì)合成轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝等方面。KEGG功能富集獲得146條通路，主要有人乳頭瘤病毒感染、愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒感染、PD-L1在癌癥中的表達(dá)和PD-1檢查點(diǎn)通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、AGE-RAGE信號(hào)通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用，其中排名前20的結(jié)果形成KEGG功能富集的條形圖(如圖4D)。藥紫草-白鮮皮主要是通過(guò)這些通路增強(qiáng)免疫、抑制病毒復(fù)制，達(dá)到抗炎、止痛的作用。

注：A：GO富集分析生物學(xué)過(guò)程； B：GO富集分析細(xì)胞組分； C：GO富集分析分子功能； D：KEGG富集分析

3 討論

針對(duì)帶狀皰疹的常規(guī)治療，臨床主要目標(biāo)是緩解急性期疼痛、縮短皮損持續(xù)時(shí)間、防止皮損擴(kuò)散、預(yù)防或減輕帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛等并發(fā)癥，主要藥物有阿昔洛韋、膦甲酸鈉、普瑞巴林及糖皮質(zhì)激素等對(duì)癥治療，但是對(duì)癥治療過(guò)程中，有相對(duì)較多的禁忌癥并且遠(yuǎn)期效果不甚理想[6]。近年來(lái)中藥由于具有療效顯著、服用安全等特點(diǎn)，受到持續(xù)關(guān)注?；诰W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，本研究表明紫草-白鮮皮含有的芋茵素、乙酰紫草素、谷甾醇、黃芩素及槲皮素等成分。研究表明，芋茵素抑制促炎細(xì)胞因子水平[7]；乙酰紫草素通過(guò)自噬途徑使病毒顆粒失活顯示出抗病毒活性及抗氧化特性[8]；谷甾醇通過(guò)抑制白介素-6和TNF發(fā)揮抗炎作用及免疫調(diào)節(jié)特性[9]；槲皮素能夠阻止病毒進(jìn)入或抑制病毒聚合酶復(fù)制[10]；黃芩素降低單純皰疹病毒誘導(dǎo)的NF-κB和MAPK通路激活，減少病毒復(fù)制[11]。因此紫草-白鮮皮的中藥成分主要是限制病毒復(fù)制對(duì)神經(jīng)的損傷和降低炎癥因子的釋放，修復(fù)受損皮膚，從而達(dá)到抗病毒、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化及營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)等效果，以此達(dá)到治療帶狀皰疹的作用[12]。

PPI構(gòu)建靶點(diǎn)分析表明，紫草-白鮮皮治療帶狀皰疹的主要靶蛋白是TNF、STAT3、AKT1、MAPK3、ESR1及MTOR等。TNF是反映機(jī)體免疫功能的重要細(xì)胞因子，參與機(jī)體內(nèi)微環(huán)境的生理平衡，發(fā)生失衡就會(huì)誘發(fā)相關(guān)的免疫紊亂和異常，如TNF-α在帶狀皰疹病毒引起神經(jīng)性疼痛的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮著極其重要的作用[13]。STAT3蛋白在VZV感染的細(xì)胞中表達(dá)豐富，并且可通過(guò)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-6來(lái)調(diào)節(jié)通路中的自噬因子[14]。AKT1是一種參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和增殖的多功能蛋白，在G1/S進(jìn)展中起作用。AKT1參與細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)，通過(guò)下游底物刺激細(xì)胞增殖，對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程和調(diào)解具有多重影響；同時(shí)通過(guò)控制新陳代謝和蛋白質(zhì)合成，AKT可確保細(xì)胞生長(zhǎng)與細(xì)胞周期相協(xié)調(diào)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖[15]。MAPK的激活可上調(diào)自噬激活激酶1以控制線粒體自噬，除去功能失調(diào)的線粒體并減輕細(xì)胞氧化；MAPK和減數(shù)分裂有關(guān)，抑制基因表達(dá)及細(xì)胞增殖[16]。ESR是一種核受體超家族的轉(zhuǎn)錄因子，介導(dǎo)雌激素配體促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和存活，是細(xì)胞增殖相關(guān)生理過(guò)程的重要調(diào)節(jié)劑[17]。MTOR蛋白激酶協(xié)調(diào)細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境條件；MTOR還抑制CD8+和CD4+效應(yīng)T細(xì)胞的分化和擴(kuò)增[18]。這些關(guān)鍵核心蛋白分子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥、降低病毒基因控制、調(diào)控細(xì)胞增殖分化和周期，從而達(dá)到改善VZV帶來(lái)的不利影響。

GO生物功能富集分析表明紫草-白鮮皮藥物成分的靶點(diǎn)蛋白對(duì)應(yīng)基因分子功能主要涉及蛋白酶活性、磷酸酶及細(xì)胞因子受體等方面，生物過(guò)程涉及細(xì)胞膠質(zhì)生成和酶活性的正向調(diào)節(jié)，細(xì)胞組分涉及膜筏、膜微域及膜區(qū)等，上述靶點(diǎn)蛋白主要與細(xì)胞凋亡、物質(zhì)合成轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝有關(guān)，其中酶活性在紫草-白鮮皮治療帶狀皰疹中發(fā)揮重要作用。KEGG表明紫草-白鮮皮主要涉及的信號(hào)通路包括人乳頭瘤病毒感染、愛(ài)潑斯坦-巴爾病毒感染、PD-L1在癌癥中的表達(dá)和PD-1檢查點(diǎn)通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、AGE-RAGE信號(hào)通路在糖尿病并發(fā)癥中的作用。Epstein-Barr病毒和卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒為了確保病毒基因組在細(xì)胞分裂過(guò)程中不會(huì)丟失，通過(guò)蛋白質(zhì)中間體將病毒基因組連接到宿主有絲分裂染色體上[19]。PD-1的表達(dá)與T細(xì)胞功能受損、病毒載量增加和細(xì)胞凋亡敏感性增加有關(guān)。T細(xì)胞感染VZV會(huì)誘導(dǎo)PD-1表達(dá)，并且?guī)畎捳罨颊咴谠偌せ钇陂gT細(xì)胞中的PD-1表達(dá)也會(huì)升高，PD-1通過(guò)與程序性死亡配體或PD-L2結(jié)合來(lái)引發(fā)其免疫抑制功能，大大降低免疫系統(tǒng)清除病毒的有效性。在VZV感染期間阻斷PD-L1，將增強(qiáng)CD8+T細(xì)胞效應(yīng)功能，導(dǎo)致IFNγ分泌水平顯著升高，可以逆轉(zhuǎn)VZV介導(dǎo)的免疫抑制，從而減弱與VZV相關(guān)的病毒傳播和多系統(tǒng)疾病[20]。VZV再激活會(huì)產(chǎn)生血管病變和巨噬細(xì)胞升高，巨噬細(xì)胞中的AGE-RAGE相互作用誘導(dǎo)其向炎癥表型激活，導(dǎo)致促炎介質(zhì)過(guò)度產(chǎn)生，這是神經(jīng)炎癥和神經(jīng)變性的主要原因。氧化應(yīng)激參與AGE-RAGE的形成，AGEs激活RAGE和toll樣受體，通過(guò)下游信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)揮其炎癥作用，活化的巨噬細(xì)胞與一些代謝和炎癥疾病的進(jìn)展有關(guān)[21]。AGEs可與RAGE相互作用，導(dǎo)致某些信號(hào)通路的激活及細(xì)胞趨化因子和其他炎癥介質(zhì)的過(guò)量產(chǎn)生，最終誘發(fā)炎癥，RAGE的過(guò)表達(dá)會(huì)觸發(fā)NF-κB激活，進(jìn)而介導(dǎo)炎癥、細(xì)胞凋亡和增殖等細(xì)胞過(guò)程[22]。

綜上所述，中藥紫草-白鮮皮所含槲皮素、谷甾醇、乙酰紫草素、芋茵素、黃芩素等成分主要是通過(guò)病毒、PD-L1、AGE-RAGE信號(hào)通路控制TNF、蛋白激酶、激素受體等核心蛋白，使其跨過(guò)膜筏、膜區(qū)細(xì)胞膜，發(fā)揮抗氧化、抗炎、控制細(xì)胞自噬凋亡及抑制病毒復(fù)制的作用，從而達(dá)到治療帶狀皰疹的目的。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)表明中藥治療皮膚病有一定的優(yōu)勢(shì)，紫草-白鮮皮可通過(guò)多靶點(diǎn)及多途徑作用于疾病的治療中，本研究預(yù)測(cè)了紫草-白鮮皮治療帶狀皰疹的潛在機(jī)制。但是需要更多的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為臨床使用提供更多新的證據(jù)支持。