羅云春 胡 軍 許 俊

(三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 肛腸科， 湖北 宜昌 443003)

結(jié)腸癌是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其在我國(guó)的發(fā)病率和死亡率均較高，且呈逐年上升趨勢(shì)[1]。隨著近年來(lái)靶向藥物的臨床應(yīng)用及外科手術(shù)的不斷進(jìn)步，結(jié)腸癌的臨床治療效果顯著改善，但患者的5年生存率仍保持在較低水平，其原因在于大部分患者確診時(shí)已處于晚期階段或腫瘤發(fā)生了轉(zhuǎn)移[2]。因此，深入研究結(jié)腸癌發(fā)生的分子機(jī)制，尋找新的結(jié)腸癌診治標(biāo)志物，對(duì)于提高結(jié)腸患者的生存周期和生活質(zhì)量具有重要的臨床意義。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)非編碼單鏈RNA分子，長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸，具有高度保守性[1]。通常情況下，miRNA可與特定基因mRNA的3’UTR區(qū)域進(jìn)行配對(duì)結(jié)合，抑制靶mRNA的翻譯過(guò)程或直接降解mRNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的調(diào)控。此外也有研究報(bào)道m(xù)iRNA可與某些mRNA的5’UTR區(qū)域進(jìn)行結(jié)合[2]。研究表明，miRNA參與了多種腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲等生物學(xué)過(guò)程，并與腫瘤的診斷、治療及患者預(yù)后密切相關(guān)。miR-138-5p是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中存在差異性表達(dá)的一種miRNA，并起到重要調(diào)控作用。已有研究證實(shí)，miR-138-5p參與肺癌[3]、宮頸癌[4]、乳腺癌[5]及胰腺癌[6]等惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。但在結(jié)腸癌中，關(guān)于miR-138-5p調(diào)控作用及機(jī)制的研究少有報(bào)道。

本研究檢測(cè)了結(jié)腸癌組織和細(xì)胞系中miR-138-5p的表達(dá)水平，并分析miR-138-5p與患者臨床病理特征的相關(guān)性，并觀察miR-138-5p對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，探討其可能的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集我院2018年1月～2019年6月收治的結(jié)腸癌患者72例，所有患者均行根治性切除手術(shù)，術(shù)中獲取新鮮腫瘤組織及癌旁正常組織(>5 cm)，取出后立即放入液氮保存，組織標(biāo)本均經(jīng)病理確診。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者未接受放化療等其他抗腫瘤治療；②患者均經(jīng)細(xì)胞學(xué)和病理學(xué)確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者合并有其他嚴(yán)重肝腎部位疾??；②患者臨床分期無(wú)法確定；③患者伴隨有其他腫瘤；④患者存在傳染性疾病。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人結(jié)腸癌細(xì)胞株(SW480、SW620、LOVO和HT29)及正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞(FHC細(xì)胞)均購(gòu)自于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。所有細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(Gibco，美國(guó))的RMPI 1640培養(yǎng)基(含雙抗)(Thermo，美國(guó))中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天更換1次培養(yǎng)基。采用LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Thermo，美國(guó))進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，根據(jù)轉(zhuǎn)染物質(zhì)的不同，將結(jié)腸癌細(xì)胞分為miR-138-5p組、陰性對(duì)照組(miR-NC組)及空白對(duì)照組(Blank組)，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.3 RT-PCR檢測(cè)

Trizol提取組織樣本及細(xì)胞中總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara，日本)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA。以cDNA為模板，后進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃、5 min；再40個(gè)循環(huán)的95℃、30 s，60℃、30 s，72℃、1 min。采用2-ΔΔCt法分析目的基因相對(duì)表達(dá)量。

miR-138-5p上游：5’-GGAGCTTCGGGAAGTTCA-3’，下游：5’-CAGTGCAGTGGTATTAGT-3’；U6上游：5’-CTCCAGGTAAGTGCACA-3’，下游：5’-AACCACACGTTGCGTGT-3’。SIRT1上游：5’-TAGGTCAAGCCTAGTGGACGGGA-3’，下游：5’-ACATTGCAGGGTACGTTCGTGT-3’；GAPDH上游：5’-ACCGACGTTACCGTCAACAC-3’，下游：5’-TCCAACGTACCGTTGGAGTA-3’。每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，胰蛋白酶消化后制成單細(xì)胞懸液，以2×103/孔接種于96孔板，放入CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，于檢測(cè)前1 h加入10 μL/孔的CCK-8試劑，酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞在0 h、24 h、48 h、72 h和96 h時(shí)450 nm波長(zhǎng)下的OD值，每孔設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.5 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

各組細(xì)胞用胰蛋白酶消化并制成單細(xì)胞懸液，以1×103/孔接種至6孔板，輕輕搖晃混勻后放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。約14天后肉眼可見(jiàn)克隆時(shí)終止培養(yǎng)，PBS緩沖液清洗，4%多聚甲醛固定10 min，再用1%結(jié)晶紫染色10 min，晾干后采集細(xì)胞克隆形成情況圖片，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.6 Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：收集各組生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，用不含血清的RPMI培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105個(gè)/mL，取100 μL加入Transwell小室的上室，下室中加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)液，常規(guī)培養(yǎng)24 h。用棉簽擦拭上室的細(xì)胞，PBS緩沖液清洗，再用0.1%的結(jié)晶紫進(jìn)行染色，置于倒置顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)觀察5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：將Matrigel膠用無(wú)血清的RPMI 1640培養(yǎng)基在冰上按1∶8比例稀釋?zhuān)?5 μL Matrigel膠均勻鋪設(shè)于Transwell上室，37℃無(wú)菌過(guò)夜晾干，加入100 μL細(xì)胞懸液，剩余步驟同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)。

1.7 雙熒光素酶驗(yàn)證miR-138-5p與沉默信息調(diào)節(jié)因子1的靶向作用關(guān)系

構(gòu)建沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1) 3’UTR野生型(WT)和突變型(MUT)質(zhì)粒，將細(xì)胞懸液密度調(diào)整為3×105個(gè)/mL，接種于24孔板中，再將SIRT1野生型和突變型質(zhì)粒與miR-138-5p和miR-NC共轉(zhuǎn)染，24 h后采用雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒對(duì)每組的熒光素酶活性進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.8 Western blot

采用RIPA細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳將蛋白分離，再經(jīng)轉(zhuǎn)PVDF膜、封閉后，加入鼠抗人SIRT1單抗(1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜，以GAPDH作為內(nèi)參，再加入辣根過(guò)氧化物歧化酶標(biāo)記的二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h，經(jīng)顯色后采用化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)，Quantity One軟件進(jìn)行圖像分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-138-5p在結(jié)腸癌組織和結(jié)腸癌細(xì)胞株中表達(dá)

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-138-5p在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與FHC細(xì)胞相比，miR-138-5p在4種結(jié)腸癌細(xì)胞株中表達(dá)均顯著降低(均P<0.05)，其中在SW480細(xì)胞的下調(diào)程度最大，如圖1所示。

注：A：miR-138-5p在腫瘤組織和癌旁正常組織中表達(dá)情況； B：miR-138-5p在結(jié)腸癌細(xì)胞株中表達(dá)情況。與Normal組或FHC組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.2 miR-138-5p與結(jié)腸癌患者臨床病理參數(shù)相關(guān)性分析

根據(jù)miR-138-5p在72例腫瘤組織中相對(duì)表達(dá)量的平均值，將結(jié)腸癌患者分為miR-138-5p高表達(dá)組和miR-138-5p低表達(dá)組。分析發(fā)現(xiàn)，miR-138-5p與患者的腫瘤浸潤(rùn)深度、TNM分期和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性(均P<0.05)，而與性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤分化程度無(wú)明顯相關(guān)性(均P>0.05)，如表1所示。

表1 miR-138-5p與結(jié)腸癌患者臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

2.3 miR-138-5p對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖活性的影響

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-138-5p組miR-138-5p的表達(dá)水平顯著高于miR-NC組，而miR-NC組與Blank組的miR-138-5p表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(P>0.05)，表明轉(zhuǎn)染成功，如圖2A所示。采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)的增殖活力，并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果繪制生長(zhǎng)曲線，結(jié)果顯示，從48 h開(kāi)始，miR-138-5p組細(xì)胞的增殖活性顯著低于Blank和miR-NC組(均P<0.05)，如圖2B所示。細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-138-5p可抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞克隆的形成數(shù)量(P<0.05)，如圖2C和2D所示。表明miR-138-5p可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖能力。

注：A：不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞miR-138-5p的相對(duì)表達(dá)量，以U6為內(nèi)參； B：CCK-8檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性； C、D：各組細(xì)胞克隆形成數(shù)量對(duì)比。與Blank或miR-NC組相比，*P<0.05

2.4 miR-138-5p對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-138-5p組發(fā)生遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)量顯著低于miR-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，表明miR-138-5p可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，如圖3所示。

注：A上半部分、B：Transwell法檢測(cè)SW480細(xì)胞的遷移能力； A下半部分、C：Transwell法檢測(cè)SW480細(xì)胞的侵襲能力。與miR-NC組相比，*P<0.05

2.5 miR-138-5p與SIRT1的靶向作用關(guān)系

采用生物信息學(xué)網(wǎng)站TargetScan和miRanda預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)SIRT1的3’UTR區(qū)與miR-138-5p存在結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-138-5p可降低共轉(zhuǎn)染SIRT1野生型的SW480細(xì)胞熒光素酶活性(P<0.05)，而對(duì)SIRT1突變型細(xì)胞的熒光素酶活性無(wú)顯著影響(P>0.05)。RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-138-5p后，結(jié)腸癌細(xì)胞中SIRT1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平均顯著降低(均P<0.05)，表明miR-138-5p可直接作用于SIRT1 mRNA的3’UTR從而抑制SIRT1的表達(dá)，如圖4所示。

注：A：miR-138-5p與SIRT1存在直接結(jié)合位點(diǎn)； B：雙熒光素酶驗(yàn)證miR-138-5p對(duì)SIRT1的直接靶向作用，WT為SIRT1野生型，Mut為SIRT1突變型； C、D：miR-138-5p對(duì)SIRT1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。與miR-NC組相比，*P<0.05

2.6 過(guò)表達(dá)SIRT1可逆轉(zhuǎn)miR-138-5p的調(diào)控作用

為進(jìn)一步證實(shí)miR-138-5p是通過(guò)靶向作用SIRT1發(fā)揮其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的調(diào)控作用，我們對(duì)miR-138-5p組細(xì)胞共轉(zhuǎn)染SIRT1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。CCK-8及Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，SW480細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力均得到顯著增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，表明SIRT1可在一定程度上逆轉(zhuǎn)miR-138-5p對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的調(diào)控作用，如圖5所示。

注：A：CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性； B～D：Transwell法檢測(cè)各組細(xì)胞遷移和侵襲能力。與miR-138-5p組相比，*P<0.05

3 討論

結(jié)腸癌的發(fā)生是一個(gè)涉及多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，常伴隨多種基因的表達(dá)失調(diào)，深入研究結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，對(duì)于提高結(jié)腸癌患者的早期診斷和改善預(yù)后具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，大部分miRNAs作用于與腫瘤進(jìn)展相關(guān)的染色體區(qū)域，這些miRNAs可對(duì)腫瘤相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期、增殖、凋亡及上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition, EMT)等過(guò)程[7]。在結(jié)腸癌細(xì)胞中，存在多種差異性表達(dá)的miRNAs，有研究發(fā)現(xiàn)，miR-143在結(jié)腸癌組織中表達(dá)水平顯著低于癌旁正常組織，過(guò)表達(dá)miR-143可抑制細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡[8]。Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-185在結(jié)腸癌細(xì)胞中可通過(guò)靶向抑制Wnt1的表達(dá)，從而發(fā)揮對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞粘附、侵襲、遷移能力的抑制作用。另有研究報(bào)道，miR-139-3p可靶向結(jié)合IGF1R，從而抑制結(jié)腸癌的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，并提高結(jié)腸癌細(xì)胞的化療敏感性[10]。以上研究表明miRNA在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要調(diào)控作用。

miRNA的表達(dá)具有組織特異性、保守性和時(shí)序性，這使得miRNA用于臨床結(jié)腸癌的診斷、治療評(píng)估、預(yù)后判斷上具有巨大的潛力。miR-138-5p是miR-138家族成員之一，定位于第16號(hào)染色體上[11]，在多種惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮類(lèi)似抑癌基因的功能。趙軍華等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-138-5p可靶向抑制HIF-1α的表達(dá)，從而阻滯腎癌細(xì)胞周期，抑制腎癌細(xì)胞的增殖。原偉偉等[13]發(fā)現(xiàn)，miR-138-5p在胃癌中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-138-5p可通過(guò)作用TCF3抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，并促進(jìn)其凋亡。另有研究報(bào)道，miR-138-5p在膀胱癌中可靶向作用于Survivin基因，抑制膀胱癌細(xì)胞的EMT過(guò)程及侵襲能力[14]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-138-5p在結(jié)腸癌組織和結(jié)腸癌細(xì)胞系中表達(dá)均顯著下調(diào)，且其表達(dá)水平與患者浸潤(rùn)深度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性，表明miR-138-5p參與了結(jié)腸癌的發(fā)生且影響腫瘤進(jìn)展程度。同時(shí)，過(guò)表達(dá)miR-138-5p后結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的增殖、遷移和侵襲能力均顯著降低，表明miR-138-5p可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。

SIRT1屬于去乙?；附M蛋白家族，其在哺乳動(dòng)物體內(nèi)主要定位于細(xì)胞核，在早期胚胎組織中含量豐富，是調(diào)節(jié)組織發(fā)育、代謝和衰老的重要蛋白[15-16]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1可通過(guò)去乙?；瘏⑴c多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。多項(xiàng)研究證實(shí)，SIRT1可通過(guò)抑制p53及某些DNA修復(fù)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)腸癌[17]、前列腺癌[18]和乳腺癌[19]等腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。為明確miR-138-5p在結(jié)腸癌中的調(diào)控機(jī)制，我們首先通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)SIRT1可能是miR-138-5p的下游靶基因，進(jìn)而采用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-138-5p可降低共轉(zhuǎn)染SIRT1野生型SW480細(xì)胞的熒光素酶活性，而對(duì)SIRT1突變型細(xì)胞的熒光素酶活性無(wú)顯著影響，表明miR-138-5p對(duì)SIRT1具有直接靶向作用。且過(guò)表達(dá)miR-138-5p可顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞中SIRT1 mRNA和蛋白水平，進(jìn)一步證實(shí)了miR-138-5p對(duì)SIRT1表達(dá)的抑制作用。我們?cè)趍iR-138-5p組細(xì)胞進(jìn)一步轉(zhuǎn)染SIRT1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的增殖、遷移和侵襲能力均得到顯著增強(qiáng)，表明過(guò)表達(dá)SIRT1可在一定程度上逆轉(zhuǎn)miR-138-5p對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的調(diào)控作用，進(jìn)一步證實(shí)了miR-138-5p是通過(guò)靶向作用SIRT1來(lái)發(fā)揮其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的調(diào)控作用。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)miR-138-5p在結(jié)腸癌中低表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤進(jìn)展程度密切相關(guān)。miR-138-5p可通過(guò)靶向作用SIRT1發(fā)揮對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的抑制作用。