劉爐英， 湯春琪， 吳家婷， 謝麗君

(廣東第二師范學(xué)院化學(xué)系，廣東廣州 510303)

核黃素又稱維生素B2，為體內(nèi)黃酶類輔基的組成部分，當(dāng)缺乏時(shí)會(huì)影響機(jī)體的生物氧化，造成代謝障礙，可產(chǎn)生口角炎、唇炎、舌炎、眼結(jié)膜炎和陰囊炎等癥狀[1,2]。目前核黃素的檢測方法有電化學(xué)檢測法[3,4]、酶聯(lián)免疫法[5]、毛細(xì)管電泳法[6]、比色檢測法[7]、高效液相色譜法[8,9]以及熒光檢測法[10,11]。

碳量子點(diǎn)(CDs)具有優(yōu)異的水溶性、良好的光穩(wěn)定性和生物相容性等特性[12-15]，但CDs作為熒光傳感器最大的挑戰(zhàn)是對目標(biāo)物的選擇性不高，在復(fù)雜的樣品中很難特異性識(shí)別目標(biāo)分子。因此為了提高CDs的選擇性、抗干擾性、靈敏度，在CDs表面包裹一層分子印跡層，大大提高熒光傳感器的特異性識(shí)別能力和熒光穩(wěn)定性，擴(kuò)大CDs在樣品前處理技術(shù)中的應(yīng)用范圍[16 - 18]。單發(fā)射特性的熒光傳感器會(huì)受到光漂白、背景干擾和儀器波動(dòng)等因素影響，其定量和定性能力受到一定的限制。因此使用比率熒光傳感器并引入雙發(fā)射波長，可以消除這些因素帶來的不利影響[13,19,20]。近年來分子印跡聚合物(MIPs)被廣泛用于與CDs結(jié)合以提高熒光傳感器的選擇性。本工作采用溶膠-凝膠原位聚合法，利用3-氨基丙基三乙氧基硅烷為功能單體，正硅酸乙酯為交聯(lián)劑，形成分子印跡層包裹CDS，核黃素作為模板分子印跡在聚合物層形成嵌入式的CDS@MIPS材料，洗去模板分子后可對核黃素進(jìn)行特異吸附檢測。此方法將CDS固定在印跡層內(nèi)，使得CDS與核黃素分子之間能量傳遞被印跡層分子阻隔難以發(fā)生能量共振轉(zhuǎn)移，所以CDs的熒光信號不受核黃素的影響。因此，將碳量子點(diǎn)在460 nm波長處的熒光作為參考信號，目標(biāo)物核黃素在520 nm波長處的熒光作為變量信號，利用I520/I460的熒光比值隨著核黃素的濃度變化而變化，形成比率型熒光傳感器檢測食品中的核黃素。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F97pro熒光光譜儀(中國上海，棱光技術(shù)有限公司)；Tensor27紅外光譜分析儀(德國，布魯克公司)；MIRA3場發(fā)射掃描電鏡(捷克，泰思肯有限公司)；JEM-2100F透射電子顯微鏡(日本，電子株式會(huì)社)。

無水檸檬酸、N-(β-氨乙基-γ-氨丙基)甲基二甲氧基硅烷(AEAPMS)、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、正硅酸乙酯(TEOS)、核黃素購于阿拉丁試劑公司，其它試劑均為分析純試劑。實(shí)驗(yàn)用水均來自于超純水機(jī)純化的超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 CDs合成

稱取0.5 g無水檸檬酸分散在10 mL AEAPMS中后，轉(zhuǎn)入聚四氟乙烯內(nèi)襯里氮?dú)饷摎?0 min，然后將高壓釜在240 ℃下保持2 h。反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，用圓筒過濾膜濾器(0.22 μm)過濾溶液，最后用石油醚洗滌濾液三次。將獲得的CDs分散在250 mL無水乙醇中，并在4 ℃下避光保存以供下一步使用。

1.3 CDs@MIPs熒光傳感器的合成

燒瓶中加入40 μL上述制備的CDs和100 mg核黃素，繼續(xù)加入350 μL APTES和1.5 mL TEOS，200 μL NH3·H2O和800 μL超純水組成的混合溶液，超聲分散20 min，在室溫下避光反應(yīng)24 h，通過離心收集產(chǎn)物[16]。用洗脫溶劑洗脫模板分子，直至用熒光分光光度計(jì)從洗脫溶劑中檢測不到模板分子。最后在60 ℃下真空干燥12 h，得到一種核黃素印跡的乳白色粉末CDs@MIPs。同時(shí)，不加入核黃素采用相同的方法制備無印跡CDs@NIPs材料。

1.4 CDs@MIPs檢測核黃素

熒光測量條件：激發(fā)波長為370 nm，激發(fā)和發(fā)射縫寬度均為10 nm，激發(fā)電壓為750 V，分別記錄460 nm、520 nm處的熒光強(qiáng)度。將CDs@MIPs的粉末溶于超純水中，制作CDs@MIPs工作溶液(2.5 mg/mL、25 mg/mL)。核黃素的檢測:1 mL CDs@MIPs上述儲(chǔ)備液與1 mL核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.3～20 μmol/L)混合渦旋1 min后離心分離，用超純水沖洗3次后溶解至2 mL后檢測熒光。對照組CDs@NIPs的實(shí)驗(yàn)條件與CDs@MIPs的相同。

2 結(jié)果與討論部分

2.1 表征CDs@MIPs

CDs@MIPs的形貌通過掃描電鏡(SEM)、透射電鏡(TEM)表征如圖1A、1B所示，從圖中可以看出其呈現(xiàn)的是球形顆粒狀，直徑大致為50 nm，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于CDs粒徑，說明多個(gè)CDs是嵌在印跡層里，并非單核殼結(jié)構(gòu)，且顆粒之間出現(xiàn)交聯(lián)。

圖1 CDs@MIPs的表征:(A)掃描電鏡圖；(B)透射電鏡圖。Fig.1 Characterization of CDs@MIPs:(A) SEM;(B) TEM.

FT-IR光譜如圖2A所示，比較CDs@MIPs洗脫前后與CDs@NIPs之間的差異，以及與核黃素進(jìn)行對比。從圖中可以看出為洗脫前CDs@MIPs存在核黃素2 375 cm-1特征峰，洗脫后的CDs@MIPs此峰消失，證明核黃素洗脫干凈。而CDs@MIPs洗脫前與后、CDs@NIPs三者都出現(xiàn)792 cm-1Si-O振動(dòng)峰，1 061 cm-1為Si-O-Si的不對稱伸縮振動(dòng)峰，1 667 cm-1為仲酰胺羰基(C=O)的拉伸振動(dòng)峰，2 937 cm-1為C-H拉伸振動(dòng)峰，說明成功合成CDs@MIPs。

圖2B所示為CDs、CDs@MIPs、CDs@MIPs+核黃素、核黃素以及CDs@MIPs+核黃素的熒光發(fā)射光譜圖(右上圖分別對應(yīng)各個(gè)溶液的發(fā)光顏色)。從圖中可以看出CDs的熒光強(qiáng)度最大，發(fā)射峰位置在465 nm，并且右上角對應(yīng)的圖中發(fā)出明亮的藍(lán)光(a)；CDs@MIPs的熒光強(qiáng)度相對于CDs減弱，可能由于分子印跡層阻擋部分熒光的發(fā)射，但發(fā)射峰依然在465 nm且發(fā)藍(lán)光(b)。CDs@MIPs+核黃素?zé)晒鈴?qiáng)度相對CDs@MIPs有一定增強(qiáng)且發(fā)射峰在460 nm，溶液發(fā)綠光(c)。核黃素溶液發(fā)黃光，發(fā)射峰在520 nm處(d)。CDs@MIPs+核黃素(c)與CDs@MIPs+核黃素光譜理論加和(e)進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)兩者幾乎重合，進(jìn)一步說明CDs與核黃素之間的熒光相互不干擾，熒光傳感器的熒光光譜為CDs@MIPs和核黃素兩者的熒光峰疊加而成。因此此傳感器可利用CDs熒光作為參考信號，核黃素?zé)晒庾鳛樽兞啃盘?。CDs@MIPs在紫外光連續(xù)照射12 h后熒光強(qiáng)度幾乎不變，說明合成的CDs@MIPs熒光穩(wěn)定。

圖2 (A) CDs@NIPs(a)、CDs@MIPs(b)、CDs@MIPs +核黃素(c)和核黃素(d)的傅里葉紅外(FT-IF)光譜；(B)CDs(a)、25 mg/L CDs@MIPs(b)、25 mg/L CDs@MIPs+1.0 μmol/L 核黃素(c)、核黃素(d)、CDs@MIPs+核黃素理論加和熒光光譜圖(e)Fig.2 (A) FT-IR spectra of CDs@NIPs(a),CDs@MIPs(b),CDs@MIPs+riboflavin(c) and riboflavin(d);(B) Fluorescence spectra of CDs(a),CDs@MIPs(b),CDs@MIPs+ riboflavin(c),riboflavin(d) and theoretical adduct diagrams of CDs@MIPs+ riboflavin(e)

2.2 優(yōu)化檢測條件

實(shí)驗(yàn)選用甲醇-乙酸(90∶10，V/V)、甲醇-水(90∶10，V/V)、甲醇、超純水4種溶劑洗脫印跡層中的核黃素分子。CDs@MIPs使用每種洗脫劑洗脫10次、20次、30次、40次后真空干燥。如圖3A所示，CDs@MIPs經(jīng)過超純水洗脫30次之后比值最小且沒有變化，說明印跡層中的核黃素被洗脫干凈，同時(shí)通過熒光檢測驗(yàn)證印跡層中的核黃素已經(jīng)被洗脫干凈。因此選擇超純水作為洗脫劑。

優(yōu)化1.25 mg/L CDs@MIPs與核黃素萃取時(shí)間如圖3B所示，1.5 μmol/L核黃素與CDs@MIPs渦旋1 min時(shí)達(dá)到最大熒光比值，后續(xù)隨著渦旋時(shí)間的增加熒光比值降低?？赡苡捎陔S著時(shí)間增加，吸附核黃素被重新溶解至溶液里，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中萃取時(shí)間選擇1 min。

圖3 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件:A)溶劑洗脫；B) 響應(yīng)時(shí)間 Fig.3 Optimization of experimental conditions:A) Solvent elution;B) Response time

2.3 CDs@MIPs檢測核黃素

選用CDs@MIPs兩個(gè)濃度分別為1.25 mg/L、12.5 mg/L，利用I520/I460與核黃素的濃度呈正比，對于低濃度CDs@MIPs檢測核黃素的濃度為0.15、0.25、0.40、0.50、1.0、1.5 μmol/L，線性方程為：Y=1.2661X+0.5984，R2=0.9948，利用3δ/k計(jì)算出檢出限為8.48 nmol/L。高濃度CDs@MIPs檢測核黃素的濃度為1.5、2.5、4.5、7.0 μmol/L，線性方程為：Y=0.05425X+0.7585，R2=0.9979，所以總的線性范圍為0.15～7.0 μmol/L。從圖4中可以看出，當(dāng)CDs@MIPs的濃度增加時(shí)，I520/I460兩者的比值反而減小，可能由于當(dāng)升高CDs@MIPs的濃度時(shí)，460 nm處的熒光增強(qiáng)。雖然在520 nm處的熒光也增強(qiáng)但是分母增大幅度更大使得比值減小。

圖4 CDs@MIPs的熒光光譜Fig.4 Fluorescence spectra of CDs@MIPs

選用CDs@NIPs兩個(gè)濃度分別為1.25 mg/L、12.5 mg/L，對于低濃度CDs@NIPs吸附核黃素的濃度為0.15、0.25、0.4、0.5、1.5 μmol/L進(jìn)行檢測，得出線性方程為:Y=1.0990X+0.8664，R2=0.9573；而高濃度CDs@NIPs與核黃素濃度不呈線性關(guān)系。通過比較CDs@MIPs與CDs@NIPs兩者線性關(guān)系可知，CDs@NIPs吸附能力小于CDs@MIPs，說明CDs@MIPs具有較好的特異性吸附能力。

與其它已報(bào)道的方法進(jìn)行對比，此方法的線性范圍或檢出限比其它的方法具有優(yōu)勢，如表1所示。

表1 比較不同檢測核黃素的方法

2.4 CDs@MIPs選擇性

圖7 CDs@MIPs的選擇性Fig.7 The selectivity of CDs@MIPs

將1 mL濃度2.5 mg/L CDs@MIPs溶液加入10 mL離心管中，然后加入1 mL 80 μmol/L的其它物質(zhì)。從圖5中可以看出CDs@MIPs、CDs@NIPs吸附核黃素的I520/I460熒光比值比吸附其它物質(zhì)高，因?yàn)楹它S素520 nm處有熒光信號，使得熒光增強(qiáng)從而比值增強(qiáng)，CDs@MIPs、CDs@NIPs吸附其它物質(zhì)的比值差不多。而且可以看出CDs@MIPs吸附核黃素的比值比CDs@NIPs的高，是因?yàn)镃Ds@MIPs利用空穴特異性吸附核黃素，使得核黃素濃度升高，說明CDs@MIPs選擇性好。

2.5 樣品測定

選擇市面上常規(guī)的果汁，取10 mL果汁過濾稀釋至100 mL。將1 mL的CDs@MIPs溶液加入到10 mL離心管中，然后分別加入0.5 mL果汁和0.5 mL不同濃度的核黃素。如表1所示，原果汁中沒有檢測出核黃素含量。選擇分別加入0.3、0.7、2.0、6.0 μmol/L 4個(gè)濃度的核黃素于樣品中。從表中可以看出回收率范圍為82.2%～90.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.88%～1.15%。

表2 果汁中核黃素的檢測

3 總結(jié)

本文成功制備核黃素印跡的CDs@MIPs材料，建立了對核黃素特異性吸附檢測的比率熒光傳感器，其線性范圍為0.15～7.0 μmol/L，檢出限為8.48 nmol/L。此熒光傳感器穩(wěn)定性好，靈敏度高，具有特異性，可以達(dá)到對樣品中核黃素特異性吸附檢測的效果，因此此傳感器有望在樣品前處理技術(shù)中得到進(jìn)一步應(yīng)用。