曹功勛， 劉翠娥， 滿 珊， 鄭鳳英,2， 劉鳳嬌,2， 黃永俊，駱嘉燚， 黃昭景， 李順興*,2

(1.閩南師范大學(xué)化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，閩南師范大學(xué)，福建漳州 363000；2.現(xiàn)代分離分析科學(xué)與技術(shù)福建省重點實驗室&污染監(jiān)測與控制福建省高校重點實驗室，閩南師范大學(xué)，福建漳州 363000)

由于治療細(xì)菌感染的廣譜性，抗生素被過度使用，以致環(huán)境中其濃度水平不斷升高[1]，對生態(tài)系統(tǒng)和人類健康產(chǎn)生潛在危害，目前抗生素污染監(jiān)測已成為全球關(guān)注熱點[2]。我國是抗生素生產(chǎn)和使用大國，抗生素已成為我國水環(huán)境優(yōu)先檢出新興污染物。據(jù)《中國抗菌藥物管理和細(xì)菌耐藥現(xiàn)狀報告(2018)》，左氧氟沙星(Levofloxacin,LEV)在2017年抗菌藥物消耗量(DDDs)排名前三位，是目前臨床常用喹諾酮類抗菌藥物。因此，開發(fā)有效、快捷、成本適宜的LEV檢測法至關(guān)重要。目前LEV常用檢測法有熒光光譜分析法[3]、核磁共振法[4]、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)法[5]、高效液相色譜(HPLC)法[6]等。但這些方法設(shè)備昂貴，且存在樣品前處理復(fù)雜、成本高、分析時間長等不足，而電化學(xué)方法具有快速，便捷，成本低[7,8]等優(yōu)點。

碳納米材料作為新型催化劑或催化劑載體，具有優(yōu)異導(dǎo)電、化學(xué)穩(wěn)定性和大的比表面積等優(yōu)勢；Au納米材料具有抗氧性和生物相容性等特點。由于金/碳納米復(fù)合物具有兩者雙重特性，單分散摻雜石墨烯量子點包覆金納米粒子兼具穩(wěn)定和優(yōu)異的生物相容性[9]，Au納米簇/碳量子點骨架復(fù)合材料表現(xiàn)出過氧化物酶活性和單激發(fā)/雙重發(fā)射特性[10]，親水型Au@CDs納米復(fù)合物可作為抗真菌劑[11]，但基于Au/CDs納米復(fù)合材料電催化活性和底物親合性的傳感器研究迄今未見報道。

本文利用氮摻雜碳點(N-CDs)的還原性原位合成Au納米粒子(AuNPs)，制備Au@N-CDs納米復(fù)合材料，利用該材料對LEV的親合選擇性和電催化性能，定量測定LEV。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和試劑

Dimension Edge原子力顯微鏡(德國，布魯克)；JEM-2100F場發(fā)射透射電子顯微鏡(日本，JEOL公司)；ESCALAB 250 Xi型X射線光電子能譜儀(美國，Thermo Fisher Scientific公司)；Nicolet iS10傅立葉變換紅外光譜儀(美國，Thermo Fisher Scientific公司)；X射線粉末衍射儀(日本，Rigaku公司)；SPECORD?200 PLUS型紫外-可見分光光度計(德國，耶拿分析儀器股份公司)；Cary Eclipse熒光分光光度計(美國，Agilent公司)；Nano ZS90 Zeta電位分析儀(英國，馬爾文儀器有限公司)；CHI 660E電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)。

牛血清白蛋白(BSA)(≥98%，澳大利亞)；NaOH、H3PO4、H3BO3、KCl、一水合檸檬酸、無水Na2HPO4、KH2PO4均購買于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；HAc(≥98%,色譜純)、利福平、羅紅霉素、左氧氟沙星、紅霉素均購買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；實驗用水為美國Millipore超純水儀器制備的超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 Au@N-CDs的制備

參照文獻報道[12]，對N-CDs合成方法稍作修改：將0.0300 g BSA溶于15 mL超純水，快速混合,加入15 mL無水乙醇，冰水浴中超聲30 min，轉(zhuǎn)至50 mL聚四氟乙烯內(nèi)襯中，于高壓釜中180 ℃恒溫加熱12 h，冷卻至室溫，0.22 μm濾膜過濾后，轉(zhuǎn)入3 500 D透析袋透析48 h，冷凍干燥，得固體粉末N-CDs。

將5.0 mg N-CDs超聲溶于Britton-Robinson(B-R)緩沖溶液(pH=4.0,100.0 mL)，逐滴加入HAuCl4(12 mmol/L,2.0 mL)溶液，將混合溶液在37 ℃水浴恒溫振蕩器上孵育12 h，再置于4 ℃環(huán)境中24 h，11 000 r/min離心20 min，經(jīng)超純水洗滌3次，冷凍干燥，得黑色粉末Au@N-CDs，置于4 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩Ｖ苽淞鞒桃妶D1。

圖1 制備Au@N-CDs的流程圖Fig.1 Preparation of Au@N-CDs with water bath incubation

1.3 Au@N-CDs修飾電極制備

N-CDs和Au@CDs修飾液：將1.5 mg的N-CDs或Au@N-CDs超聲分散于0.05% Nafion溶液中，分別得到1.5 mg/mL的淺褐色N-CDs修飾液和黑色Au@N-CDs修飾液。依次用超純水、無水乙醇和超純水超聲清洗用麂皮拋光的玻碳電極(GCE)，用高純氮氣吹干，分別滴涂10 μL修飾液，于常溫下自然干燥，分別制得N-CDs修飾電極(N-CDs/GCE)和Au@N-CDs修飾電極(Au@N-CDs/GCE)。

1.4 左氧氟沙星的檢測

在室溫下，分別以N-CDs/GCE(或Au@N-CDs/GCE)、Ag/AgCl電極、鉑絲電極為工作、參比和輔助電極，于含有不同濃度LEV的磷酸鹽緩沖液(PBS)或人體尿液(pH=6.0)樣品中，在電位0.4 V作用下，富集125 s，在0.6～1.3 V電位范圍內(nèi)，通過微分脈沖伏安法繪制工作曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 Au@N-CDs制備及其形貌與組成

在N-CDs(0.05 mg/mL,5 mL)的不同pH值B-R緩沖溶液中，添加HAuCl4溶液(20 mmol/L,50 μL)，用快速混勻器快速振蕩，于37 ℃孵化12 h，置于4 ℃條件下陳化24 h，當(dāng)pH=4.0時，反應(yīng)液底部有一定量的黑色沉淀生成。由于N-CDs等電點在pH=4.0附近，在等電點時，顆粒凈電荷為零，沒有相同電荷的排斥作用，分子間作用力弱，顆粒易碰撞而凝聚沉淀。N-CDs為淺褐色，而沉淀為黑色，對照組未生成黑色沉淀，這表明N-CDs和HAuCl4發(fā)生反應(yīng)。N-CDs可作為還原劑原位還原HAuCl4，并在合成過程中吸附包裹生成的AuNPs，從而形成Au@N-CDs。

在pH=4.0，含N-CDs(0.05 mg/mL，5 mL)的B-R緩沖溶液中，添加不同濃度HAuCl4(0、6、8、10、12、14、16、18、20 mmol/L，100 μL)溶液，制備Au@N-CDs，通過紫外-可見和熒光發(fā)射光譜測試制備效果。紫外吸收在520～560 nm處均出現(xiàn)Au吸收峰，吸光強度先增后減，這是由于HAuCl4濃度過高，初生AuNPs較多，N-CDs不能及時還原，體系高比表面能使得AuNPs團聚，因此在12 mmol/L的HAuCl4濃度時，吸光值最大(圖2(a))，此時生成的AuNPs濃度最高，而N-CDs由于同AuNPs結(jié)合引起N-CDs熒光猝滅(圖2(b))。

圖2 (a)HAuCl4不同濃度下Au@N-CDs紫外-可見吸收光譜；(b)Au@N-CDs的熒光發(fā)射光譜Fig.2 (a) Influence of HAuCl4 concentrations on ultraviolet-visible absorption spectra;(b) Fluorescence emission spectra of Au@N-CDs

由高分辨透射電鏡(HR TEM)圖3(a)可知，熒光黃橢圓圈內(nèi)圖像具有0.20 nm晶格條紋間距與Au(200)晶面相吻合[13,14]；晶格條紋間距0.32 nm與層間石墨烯(002)晶面相一致[15,16]，這表明Au3+已被N-CDs還原。XRD(圖3(b))圖譜同檢索JCPDS no.1-1172對比，寬衍射峰2θ=23.16°對應(yīng)碳的石墨化結(jié)構(gòu)[17,18]，2θ=38.04°、44.24°、64.53°、77.50°均為Au特征衍射峰[9]，分別對應(yīng)晶面(111)、(200)、(220)、(311)[19]。上述結(jié)果證明成功合成Au@N-CDs。原子力顯微鏡(AFM)圖及3D模式圖3(c)表明,Au@N-CDs厚度約2 nm，AuNPs和N-CDs組裝在二維平面，第三維度超薄[20]，便于負(fù)載于GCE。元素映射分析圖4中，材料由Au、C和N組成，N和C分布密實，Au分散于C和N中，即AuNPs嵌套在N-CDs基質(zhì)中，構(gòu)成Au@N-CDs。

圖3 (a)Au@N-CDs的透射電鏡(TEM)圖(插圖為HRTEM圖)；(b) X射線衍射圖；(c)原子力顯微鏡圖和相應(yīng)粒子高度分布圖Fig.3 (a) HR TEM image of Au@N-CDs;(b) X-ray diffraction pattern of Au@N-CDs;(c) Atomic force microscope pattern and corresponding particle height distribution pattern of Au@N-CDs

圖4 (a)Au@N-CDs的C、N、Au元素映射分析疊加圖；(b、c、d)C、N元素和Au元素的映射分析圖Fig.4 (a)Overlay of C,N,Au element mapping analysis of Au@N-CDs;(b,c,d)Mapping analysis diagram of C,N and Au

傅立葉紅外(FTIR)光譜測試N-CDs和Au@N-CDs官能團，結(jié)果如圖5所示。N-CDs在3 290 cm-1、2 962 cm-1、1 664 cm-1和1 101 cm-1處有顯著的吸收峰，這與N-H[21]，C-H[22]，C=O[23,24]和C-O[25,26]振動相關(guān)；Au@N-CDs相應(yīng)紅外吸收峰發(fā)生移動，N-H、C-H、C=O、C-O分別移至3 421 cm-1、2 925 cm-1、1 647 cm-1和1 084 cm-1，說明N-CDs和AuNPs間有交互作用。

圖5 Au@N-CDs和N-CDs的傅立葉變換紅外光譜圖Fig.5 Fourier transform infrared spectra of Au@N-CDs and N-CDs

X射線光電子能譜(XPS)表征Au@N-CDs全掃描圖譜表明，樣品由C、N、O、S和Au組成，元素含量分別為C 62.01%、N 12.4%、O 22.32%、S 0.63%及Au 2.64%。XPS高分辨C 1s譜(圖6(a))中3個峰結(jié)合能分別為283.93 eV、285.03 eV和286.88 eV，歸于C=C/C-C、C-C/C-S/C-N和C=O[17,18]。N 1s譜(圖6(b))在399.38 eV和401.33 eV處的峰歸于C-N、N-H[27]。O 1s譜(圖6(c))顯示兩個相對氧態(tài)，COO-(530.98 eV)、C-OH或C-O-C(532.38 eV)[28]。Au 4f譜(圖6(d))分別在84.23eV和87.88eV處的兩峰為Au04f7/2和Au04f5/2的光電子作用[16]。

圖6 Au@N-CDs的X射線光電子能譜(XPS)表征Fig.6 XPS of Au@N-CDs(a) C 1s spectrum;(b) N 1s spectrum;(c) O 1s spectrum;(d) Au 4f spectrum.

2.2 Au@N-CDs/GCE的電化學(xué)表征

在含0.1×10-3mol/L KCl的5.0×10-3mol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中，電化學(xué)阻抗譜(EIS)測試結(jié)果如圖7(a)所示。結(jié)果表明，裸GCE、N-CDs/GCE、Au@N-CDs/GCE的EIS中R2的值分別為118.7 Ω、4 023 Ω和15 270 Ω，電荷轉(zhuǎn)移效率越來越低，同時低頻區(qū)斜線傾斜率減小，電極離子導(dǎo)電率越來越小。在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中測試GCE、N-CDs/GCE和Au@N-CDs/GCE的循環(huán)伏安圖，得圖7(b)。GCE、N-CDs/GCE和Au@N-CDs/GCE的氧化還原峰電流依次減小，N-CDs和Au@N-CDs在GCE上修飾，降低了電極的電子轉(zhuǎn)移速率，這與EIS分析結(jié)果一致，表明材料成功修飾在電極上。

圖7 (a)GCE、N-CDs /GCE和Au@ N-CDs /GCE的電化學(xué)阻抗譜(EIS)；(b)GCE、N-CDs/GCE和Au@N-CDs/GCE的循環(huán)伏安圖Fig.7 (a) EIS of GCE,N-CDs/GCE and Au@N-CDs/GCE； (b) Cyclic voltammograms of GCE,N-CDs/GCE and Au@N-CDs/GCE

2.3 Au@N-CDs/GCE測定LEV條件及性能

在0.01 mol/L的PBS(pH=6.0)測試體系中，以循環(huán)伏安法檢測Au@N-CDs/GCE在10～300 mV/s掃描速率范圍內(nèi)對LEV的電化學(xué)響應(yīng)，將不同掃描速率的CV曲線疊加，得圖8(a)。LEV氧化峰電流隨CV掃描速率增加而增大，Ip與掃速呈良好線性關(guān)系，如圖8(b)，其線性回歸方程為：Ip=3.969×10-7v+2.078×10-5(R=0.9935)，表明LEV在Au@N-CDs/GCE上的反應(yīng)為表面吸附控制的電極反應(yīng)過程。

圖8 (a)不同掃速下1 mmol/L LEV在Au@CDs/GCE上的循環(huán)伏安圖；(b)不同循環(huán)伏安掃描速率和LEV氧化峰電流Ip之間的關(guān)系圖Fig.8 (a) Cyclic voltammogram of LEV(1 mmol/L) on Au@N-CDs/GCE under different scanning rate;(b) Relationship between different cyclic voltammetry scan rates and LEV oxidation peak current Ipscan rate:10,30,60,90,120,150,180,210,240,270,300 mV/s.

在0.1～0.8 V富集電位范圍內(nèi)，隨電位值增大，LEV的氧化峰電流Ip先增后減。當(dāng)富集電位為0.4 V時，Ip最大(圖9(a))。隨富集時間增加，Ip增大，但當(dāng)富集時間超過125 s，Ip增幅微小且趨于穩(wěn)定(圖9(b))，可見電極對LEV的表面吸附富集已達飽和，因此選擇富集時間為125 s。

圖9 (a)富集電位、(b)富集時間對Au@N-CDs/GCE測定LEV的影響Fig.9 (a)Influence of enrichment potential and (b)enrichment time on the determination of LEV with Au@N-CDs/GCE

當(dāng)pH值從4.0增至7.0，電流Ip呈現(xiàn)先增后減(圖10(a))，在pH=6.0時Ip達到最高值。此外，Ep隨pH值增大而發(fā)生電位負(fù)移，與石墨烯/金納米復(fù)合材料修飾GCE結(jié)果相似[29]，這主要是電極反應(yīng)過程有氫離子的參與因此發(fā)生移動，其具體反應(yīng)機理如圖10(b)所示。

圖10 (a)不同pH的PBS中LEV在Au@N-CDs/GCE上的循環(huán)伏安圖；(b)檢測LEV的反應(yīng)機理圖Fig.10 (a)Cyclic voltammogram of LEV on Au@N-CDs/GCE in phosphate buffer solution with different pH;(b)Reaction mechanism for detecting LEV

以Au@N-CDs/GCE為工作電極，以差分脈沖伏安法(DPV)測定LEV，結(jié)果如圖11(a)和11(b)。在2.5×10-6～1.0×10-4mol/L內(nèi)，LEV的Ip值與濃度c呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：Ip(μA)=0.08455c(μmol/L)+4.102(R=0.9907)，檢出限(3σ/k)為1.0×10-6mol/L。

圖11 (a) Au@N-CDs/GCE測定2.5、3.5、6.0、8.0、10、16、20、30、40、60、80、100 μmol/L LEV的差分脈沖伏安法圖；(b)不同LEV濃度和LEV氧化峰電流Ip之間的關(guān)系圖Fig.11 (a) Differential pulse voltammogram of LEV(0.25 - 100 μmol/L) on Au@N-CDs/GCE;(b)Relationship between concentrations and oxidation peak current Ip for LEV

同樣制備6根電極考察Au@N-CDs/GCE對LEV檢測的重現(xiàn)性，測定1.0×10-5mol/L的LEV，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.98%，因此Au@N-CDs/GCE對LEV檢測有較好的重現(xiàn)性。

同時也研究了其他抗生素作為干擾物質(zhì)對于LEV電化學(xué)信號的影響。先檢測LEV濃度為5.0×10-5mol/L的氧化峰電流，后再向LEV溶液中加入相同含量的利福平、羅紅霉素、紅霉素。上述物質(zhì)對LEV電化學(xué)行為無明顯影響，這表明Au@CDs/GCE對檢測LEV具有一定的抗干擾能力。這可能是利福平電化學(xué)檢測氧化還原電位差較大[30]，因此利福平不干擾左氧氟沙星的電化學(xué)信號。羅紅霉素、紅霉素因其無-COOH，故其吸附力較小，對LEV干擾也較小。

2.4 人體尿液樣品分析

LEV在血漿和尿液中的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，人體對LEV的代謝量很低，主要從尿中排出。因此，對稀釋處理后購置的高濃度質(zhì)控人體尿液采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，測試Au@N-CDs/GCE對LEV電化學(xué)檢測的實際應(yīng)用能力，計算LEV的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。實驗結(jié)果如表1所示，所獲得的樣品回收率為93.0%～107.4%，且RSD在6.8%之內(nèi)，因此Au@N-CDs/GCE具有應(yīng)用于人體尿樣和廢水中LEV測定的可行性。

表1 樣品中LEV的檢測結(jié)果

3 結(jié)論

本研究制備的Au@N-CDs納米復(fù)合材料，在pH=6.0的PBS中測定LEV的含量，在電位0.4 V下富集125 s后測試效果較好，Au@N-CDs/GCE檢測LEV線性范圍為2.5×10-6～1.0×10-4mol/L，檢出限為1.0×10-6mol/L。Au@N-CDs/GCE檢測LEV同時，對利福平，羅紅霉素、紅霉素有抗干擾作用，對人工尿液采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，證明了Au@N-CDs/GCE在尿液和廢水中LEV檢測的可行性。