高嫣珺，王美紅，聶 雅，王 震，卜仕金

(揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創(chuàng)新中心，揚州 225009)

危害養(yǎng)雞業(yè)的細菌性疾病主要是大腸桿菌病與沙門菌病，在育雛期通過適當途徑給予抗革蘭陰性菌的抗菌藥物防治此類疾病已成為養(yǎng)雞業(yè)的慣例。氟喹諾酮類藥物是世界上最有價值、使用最廣泛的一類抗菌藥，恩諾沙星為第三代氟喹諾酮類抗菌藥，對革蘭陰性菌具有良好的抗菌活性，在獸醫(yī)臨床廣泛用于防控大腸桿菌、沙門菌和支原體等引起的家禽腸道和呼吸道感染。相比于歐美等發(fā)達國家，我國目前大腸桿菌()和沙門菌()等革蘭陰性菌臨床分離株對氟喹諾酮類耐藥水平較高，山西省部分地區(qū)分離的20株致病性雞源大腸桿菌耐藥性檢測結果顯示，試驗菌對恩諾沙星耐藥率為85%。秦春芝等于山東省分離的93株致病性大腸桿菌，對恩諾沙星耐藥率為88.63%。高強等于甘肅省肉仔雞中分離得到的大腸桿菌、沙門菌均對恩諾沙星耐藥。氟喹諾酮類抗菌藥使用情況與細菌耐藥有一定相關性，Guo等報道983株從河北省1日齡雛雞分離的大腸桿菌對恩諾沙星的平均耐藥率高達75%，隨著恩諾沙星的使用，耐藥率逐漸提高至100%；而徐耀輝等報道的從河南省三黃種雞場死胚中分離的173株沙門菌對恩諾沙星、環(huán)丙沙星均敏感。在未批準使用氟喹諾酮類藥物的美國，大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物的耐藥率低于5%，而在氟喹諾酮類藥物使用合法化的巴西、中國和歐盟，大腸桿菌的平均耐藥率超過40%。我國大腸桿菌和沙門菌臨床分離株的高耐藥率是否與養(yǎng)禽業(yè)長期使用此類藥物較低濃度混飲或混飼給藥有關？目前，尚無這方面的研究。中國是世界上最大的抗菌藥生產和使用國，動物占總消費量的一半以上，《2020年中國獸用抗菌藥使用情況報告》中指出，2020年，中國境內使用的全部獸用抗菌藥總量約為3.2萬t，較 2019 年增長 6.06%。臨床批準使用的抗菌藥物耐藥性增加對這些藥物在未來的使用構成重大威脅，動物生產在很大程度上仍然依賴于抗菌藥的廣泛使用，立即徹底禁止食品動物使用抗菌素將對動物健康、生產力和福利以及食品價格造成嚴重后果。在全球細菌耐藥性增加的同時新型抗菌藥物的發(fā)現率顯著下降， PK/PD模型提供了防止細菌耐藥的策略和方法，最佳的治療方案既能達到最佳殺菌效果，又能最大限度抑制耐藥菌株的出現。Drusano等建立了將PK/PD研究與Monte Carlo模擬(Monte Carlo simulation，MCS)結合以確定最佳給藥方案的方法，MCS是一種計算機建模過程，它結合了藥代動力學參數的可變性和細菌種群內的自然MIC分布，該技術可用于建立細菌的PK/PD折點，此方法已被FDA、EMEA等多個新藥審批機構提倡和鼓勵，并廣泛應用于新藥研發(fā)中，同時在國內外也廣泛應用于抗菌藥物的臨床研究中。本研究利用恩諾沙星在1、7和14日齡雛雞混飲給藥的藥動學特征與美國臨床和實驗室標準協會(CLSI)關于禽大腸桿菌對恩諾沙星的敏感性折點值(0.25 μg·mL)構建PK/PD模型，結合MCS綜合評價恩諾沙星可溶性粉在雞給藥方案的合理性，不僅能為監(jiān)管部門對這類制劑上市后再評價提供參考依據，且對延長抗菌藥使用壽命、指導育雛期間合理用藥具有實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 恩諾沙星與鹽酸環(huán)丙沙星對照品(純度≥99.8%)，批號分別為H0081505、H0101310，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；恩諾沙星可溶性粉，規(guī)格：10%(以恩諾沙星計)，批號：E9K191202，購自河北遠征禾木藥業(yè)有限公司；乙腈、甲醇、色譜純購自美國TEDIA公司；85%濃磷酸分析純購自德國CNW公司；氫氧化鈉、三乙胺、分析純購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設備 高效液相色譜儀(Waters2695，配Waters2475熒光檢測器)購自美國Waters公司；電子分析天平(BSI24S)購自德國賽多利斯天平公司；高速冷凍離心機(5180R)、微量移液器購自德國Eppendorf公司；純水儀(UPH-11-20T)購自四川優(yōu)普超純科技有限公司；水浴氮吹儀(N-EVAP)購自美國Organomation公司；微型旋渦混合儀(WH-3)購自上海滬西分析儀器廠有限公司；KS-250D超聲儀購自寧波科生儀器廠；有機針式濾器(0.22 μm)購自上海安譜科技有限公司。

1.1.3 試驗動物 健康白羽肉雞，購自江蘇八達畜禽公司；1日齡雛雞給藥第0天平均體重為(42.0±2.5)g；給藥第4天為(109.0±1.6)g。7日齡雛雞給藥第0天平均體重為(163.0±2.1)g；給藥第4天為(300.0±1.8)g。14日齡雛雞給藥第0天平均體重為(402.0±2.2)g；給藥第4天為(524.0±2.6)g。飼料為雛雞全價飼料，由揚州旺旺飼料廠提供。試驗期間，雛雞飼養(yǎng)環(huán)境溫度1日齡為34～37 ℃；7日齡為31～36 ℃；14日齡為28～32 ℃。飼養(yǎng)環(huán)境濕度為42%～68%。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與給藥 600只1日齡雛雞隨機分為3組，每組200只。第1組處理組于1日齡時即混飲給藥，第2組處理組飼養(yǎng)至7日齡時始混飲給藥，第3組處理組飼養(yǎng)至14日齡時開始混飲給藥。3個處理組給藥方案均為恩諾沙星可溶性粉臨床推薦劑量的最高限量即75 mg·L(以恩諾沙星計)混飲，連用5 d(第1日記為給藥第0天，第5日記為給藥第4天)。另設一平行對照組，根據其日飲水量和雛雞體重換算為24 h藥物攝入量。

混飲藥液現配現用，每日第一次給藥時間均為上午08：00，根據雛雞的飲水量及時補充或更換。

1.2.2 給藥后血樣采集及血漿中恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星含量測定 在混飲給藥的第0天開始采集血樣，時間點分別為0 (給藥前)、0.5、1、2、3、4、6、8、12 h；第1、2天混飲給藥期間每日采集血樣時間點分別為0(給藥前)、3、6、8和12 h；第3天采集血樣時間點分別為0(給藥前)、0.5、1、2、4、6、8和12 h；第4天采集血樣時間點分別為0(給藥前)、0.5、1、2、4、6、8、12和24 h。各時間點隨機取5只雛雞，通過頸靜脈采集血樣，每只雞一次性采血1～2 mL，置于含有肝素鈉的離心管中，4 000 r·min離心10 min分離血漿，于-20 ℃冰箱中凍存待用。

血漿中恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星的含量采用經驗證的HPLC方法檢測。色譜參考條件：色譜柱為Agilent HP-C(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為0.05 mol·L磷酸/三乙胺(pH=3.0)，乙腈(820 mL·L)；流速：0.8 mL·min；柱溫：35 ℃；進樣量：10 μL；熒光檢測器，激發(fā)波長278 nm，發(fā)射波長450 nm。準確度和精密度通過空白血漿樣品添加標準工作液的回收率和變異系數進行評價，測定結果帶入當日隨行標準曲線，計算血漿中恩諾沙星和環(huán)丙沙星的含量。

1.2.3 Monte Carlo模擬 使用Crystal ball 11.1軟件進行MCS，置信區(qū)間為95%，模擬恩諾沙星對大腸桿菌的/估值，模擬10 000次。模擬過程中AUC選擇1、7和14日齡雛雞給藥第4天實測值，遵循對數正態(tài)分布；MIC遵循自定義分布，大腸桿菌分布來源于文獻[24]；以/≥100的估值作為靶值，達標率(target attainment rate,)≥90%表明當前給藥方案預期可獲得滿意療效，并防止細菌產生耐藥性。

1.2.4 數據處理及分析 使用Phoenix WinNonlin 8.1軟件處理平均血藥濃度-時間數據，采用非房室模型分析方法計算相關藥動學參數；使用SPSS 26.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結 果

2.1 雞血漿中恩諾沙星和環(huán)丙沙星含量測定的HPLC方法驗證

空白基質、空白基質添加標準品及1日齡雛雞給藥第4天實測色譜圖分別見圖1～3。在本試驗所建立的色譜條件下，恩諾沙星的出峰時間在8.9 min左右，環(huán)丙沙星的出峰時間在7.0 min左右，待測組分能夠與溶劑峰及基質組分完全分開，且峰形良好。在0.02～2.5 μg·mL濃度，恩諾沙星和環(huán)丙沙星藥物濃度與峰面積呈良好的線性關系(≥0.999)，檢測限()和定量限()分別為0.01和0.02 μg·mL。在定量限(0.02 μg·mL)和低、中、高3個添加濃度(0.05、0.5、2.5 μg·mL)恩諾沙星的平均回收率為95.16%～105.02%，批內變異系數<5.65%，批間變異系數<5.84%；環(huán)丙沙星的平均回收率為88.42%～100.8%，批內變異系數<5.16%，批間變異系數<6.58%。

圖1 空白血漿色譜圖Fig.1 Blank plasma chromatogram

A.環(huán)丙沙星色譜峰；B.恩諾沙星色譜峰A. The chromatographic peak of ciprofloxacin; B. The chromatographic peak of enrofloxacin圖2 空白血漿添加混合標準液色譜圖(0.02 μg·mL-1)Fig.2 Blank plasma added with mixed standard solution chromatogram (0.02 μg·mL-1)

A.環(huán)丙沙星色譜峰；B.恩諾沙星色譜峰A. The chromatographic peak of ciprofloxacin; B. The chromatographic peak of enrofloxacin圖3 1日齡雛雞給藥第4天血漿色譜圖Fig.3 Plasma chromatogram of one day old chicks on the 4th day after administration

2.2 恩諾沙星可溶性粉在雛雞混飲給藥的藥動學參數

1、7和14日齡雛雞處理組在給藥第0～4天平均血藥濃度分別為0.458～0.629、0.435～0.714和0.391～0.561 μg·mL，給藥第0和第4天的恩諾沙星平均血藥濃度-時間曲線分別見圖4、5，整個給藥期間的恩諾沙星平均血藥濃度-時間曲線見圖6。除1和7日齡雛雞處理組在給藥第1天以及1和14日齡雛雞處理組在給藥第4天的平均血藥濃度有顯著差異外(<0.05)，給藥期間其他時間段不同日齡雛雞恩諾沙星平均血藥濃度均無顯著差異(≥0.05)。

圖4 1、7和14日齡雛雞處理組在給藥第0天的恩諾沙星平均血藥濃度-時間曲線Fig.4 The mean plasma drug concentration-time curve of 1, 7 and 14 day olds chicks on day 0 of administration

圖5 1、7和14日齡雛雞處理組在給藥第4天的恩諾沙星平均血藥濃度-時間曲線Fig.5 The mean plasma drug concentration-time curves of 1, 7 and 14 day-olds chicks in treatment groups on the 4th day of administration

圖6 1、7和14日齡雛雞處理組在整個給藥期間的恩諾沙星平均血藥濃度-時間曲線Fig.6 Mean plasma concentration-time curves of 1, 7 and 14 day-olds chicks in treatment groups during the whole administration period

對1、7和14日齡雛雞處理組第0和4天平均血藥濃度-時間數據處理獲得相關藥動學參數，見表1。

表1 1、7和14日齡雛雞處理組在給藥第0和4天的藥動學參數Table 1 Pharmacokinetic parameters of 1, 7 and 14 day-olds chicks on day 0 and day 4 of administration

鑒于環(huán)丙沙星在雛雞血漿濃度過低，選擇恩諾沙星作為PK計算標志物。

2.3 PK/PD參數折算值

將本試驗所得藥動學參數與恩諾沙星對禽大腸桿菌敏感性折點值(0.25 μg·mL)進行比值計算，1、7和14日齡雛雞處理組給藥第4天的/分別為2.40、2.20和1.95，/分別為2.05、1.97和1.73，/分別為49.24、47.28和41.48。

2.4 Monte Carlo模擬結果

不同日齡雛雞恩諾沙星可溶性粉混飲給藥第4天在大腸桿菌臨床分離株不同范圍內的TAR見圖7。恩諾沙星對≤0.25 μg·mL的大腸桿菌臨床分離株，給藥第4天TAR分別為76.11%、75.21%和75.01%，敏感度為27%～30%；在≤0.12 μg·mL的菌株≥90%。

A. 1日齡雛雞給藥第4天；B. 7日齡雛雞給藥第4天；C. 14日齡雛雞給藥第4天A. Day 4 of administration for 1 day-old chicks; B. Day 4 of administration for 7 day-old chicks; C. Day 4 of administration for 14 day-old chicks圖7 恩諾沙星可溶性粉75 mg·L-1混飲給藥對大腸桿菌臨床分離株在不同MIC范圍內的TARFig.7 The TAR of enrofloxacin at 75 mg·L-1 mixed drinks within different MIC ranges of Escherichia coli clinical isolates

3 討 論

3.1 恩諾沙星可溶性粉混飲給藥在不同日齡雛雞的藥動學特征

恩諾沙星可溶性粉在1、7和14日齡雛雞連續(xù)混飲5 d，在給藥第0天藥物攝入量分別為42.86、54.86和36.24 mg·kg，在給藥第4天藥物攝入量分別為54.52、38.07和35.43 mg·kg。與Kang等報道恩諾沙星10 mg·kg在肉雞口服給藥(為0.65 h；為3.82 μg·mL)相比，藥物攝入量更多，同時1、7和14日齡雛雞給藥第0天的與其相比更晚，且更低。1、7和14日齡雛雞首次給藥后，分別于12、24和12 h檢測出環(huán)丙沙星，整個試驗期間所有雛雞體內環(huán)丙沙星的血藥濃度均未超過0.1 μg·mL。3個日齡處理組雛雞在首次給藥24 h和之后各時間點的血藥濃度均相對接近；除1日齡和7日齡雛雞處理組在給藥第1天以及1和14日齡雛雞處理組在給藥第4天的平均血藥濃度有顯著性差異外，其他時間段不同日齡雛雞處理組的平均血藥濃度均無顯著性差異。結果表明，恩諾沙星可溶性粉在健康雛雞混飲給藥，雛雞日齡對恩諾沙星血藥濃度無明顯影響；按推薦給藥方案混飲給藥12 h后才能在雛雞體內檢測出代謝物環(huán)丙沙星，且檢出量很低。

3.2 PK/PD參數與TAR對臨床用藥的指導意義

氟喹諾酮類藥物屬于濃度依賴型抗菌藥，評估此類藥物的主要 PK/PD 參數為/和/。氟喹諾酮類藥物的PK/PD參數與療效密切相關，一般認為/>8或/>100時，抗菌效果良好。同時，/和/也可用于預測治療過程中耐藥性出現的可能性，在Blaser等的研究中，只有/>8時，細菌才不易產生耐藥性；Tomas等研究表明，當/<100時，無論使用何種抗菌療法，大約50%的分離微生物在開始治療的4 d內獲得耐藥性，且在治療的最初24 h內，必須達到較高的/，才能有效殺滅病原體。Toutain等指出，應選擇達到穩(wěn)態(tài)時的構建抗菌藥物PK/PD模型，因此使用1、7和14日齡雛雞在給藥第4天的藥動學參數計算。CLSI給出的恩諾沙星對禽大腸桿菌敏感性折點值為0.25 μg·mL，以和與折點值的比值分別評價恩諾沙星混飲給藥方案對敏感菌的殺滅效果及誘導耐藥性的作用。依據本試驗獲得的PK參數值，得出 1、7和14日齡雛雞處理組給藥第4天/及/均接近或大于2，理論上對所有敏感性大腸桿菌均具有抑制或殺滅效果，但未達最佳比值，無法發(fā)揮最佳治療效果。給藥期間，/為41.48～49.24，亦未達最佳PK/PD比值，對部分恩諾沙星敏感性大腸桿菌易誘導耐藥性。將1、7和14日齡雛雞給藥第4天和值代入上述不等式計算范圍，顯示當前給藥方案對≤0.06 μg·mL的大腸桿菌具有最佳殺滅作用；可限制≤0.10 μg·mL的菌株產生耐藥性；對≤0.06 μg·mL的菌株發(fā)揮最佳殺菌效果的同時可避免誘導耐藥。

PK/PD模型對評價抗菌藥物給藥方案具有重要意義，將禽大腸桿菌對恩諾沙星敏感性折點值作為PK參數，能夠直接反映當前給藥方案對全部敏感菌的作用。同時，MCS將PK/PD模型與細菌自然分布結合，預測抗菌藥物對臨床感染菌株的療效，是科學評價給藥方案必不可少的環(huán)節(jié)。Booker等發(fā)現，氟喹諾酮類藥物的/能更好地反映PK與PD之間的關系，因此選用/作為PK/PD參數進行MCS。根據國內外的相關報道，選擇/≥100作為PK/PD靶值。某種細菌在某一特定下，≥90%時，提示該給藥方案對不高于該的感染菌株達到預期治療效果，且能防止耐藥性產生。歐洲藥敏委員會(EUCAST)MIC數據庫(https://mic.eucast.org/)中檢索得到恩諾沙星對3 039株大腸桿菌的分布中91%分布在0.06 μg·mL及以下，與中國大腸桿菌臨床分離株的分布有一定區(qū)別，選擇中國大腸桿菌臨床分離株的分布對指導臨床用藥更具實際意義。本研究選擇Sang等2016年于中國5個省份肉雞中分離得到的929株大腸桿菌臨床分離株分布，其中，310株大腸桿菌的≤0.25 μg·mL，230株≤0.06 μg·mL。結果顯示，恩諾沙星對大腸桿菌臨床分離株的≤0.25 μg·mL時，1、7和14日齡雛雞給藥期間在75.01%～76.11%，未達90%，即恩諾沙星可溶性粉按當前給藥方案給藥，無法對恩諾沙星敏感性大腸桿菌發(fā)揮最大殺菌作用，且易誘導產生耐藥性，僅能在≤0.12 μg·mL的大腸桿菌獲得預期療效。MCS結果中的敏感度指模擬過程中各變量的敏感程度，敏感度為27%～30%，表明當前給藥方案對模型存在一定影響。

4 結 論

本研究在不同日齡雛雞開展恩諾沙星可溶性粉混飲給藥的藥動學研究，獲得藥動學參數，采用PK/PD與MCS相結合的方法，評價恩諾沙星可溶性粉在雛雞混飲給藥方案對大腸桿菌的有效性。結果提示，恩諾沙星可溶性粉當前推薦給藥方案在雛雞對大腸桿菌殺菌效果有限，且易誘導部分敏感菌產生耐藥性，長期在育雛期使用當前給藥方案，將導致我國雞源大腸桿菌對氟喹諾酮類藥物的高水平耐藥加劇。給藥途徑的改變、新劑型的研發(fā)以及合理使用抗菌藥的科普等對延長恩諾沙星使用壽命、減少細菌耐藥性產生具有重要意義。