劉旺景，唐德富*，敖長金

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070； 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

我國是羊肉生產(chǎn)大國，占全世界生產(chǎn)總量的24%，其次是澳大利亞(8%)和新西蘭(5%)。與其他畜產(chǎn)品(肉和奶)相比，綿羊、山羊肉及其相關(guān)制品因具有獨(dú)特營養(yǎng)成分、感官特性而深受消費(fèi)者市場的歡迎，但同時也具有特殊的風(fēng)味即膻味，致使部分消費(fèi)者難以接受而拒絕消費(fèi)。眾多研究結(jié)果指向，揮發(fā)性的4-烷基支鏈脂肪酸：4-甲基辛(MOA)、4-甲基壬酸(MNA)、4-乙基辛酸(EOA)被認(rèn)為是羊肉膻味的主要貢獻(xiàn)者。羊肉膻味受品種、性別、年齡以及日糧等諸多因素的影響，但日糧因素往往比遺傳因素更能直接對羊肉膻味產(chǎn)生影響。與放牧條件下采食黑麥草和三葉草的公羊羔羊相比，舍飼條件下采食濃縮飼料(苜蓿顆?；蛴衩?的公羊羔羊皮下脂肪中的MOA和MNA濃度更高，這也是舍飼肉羊風(fēng)味下降，膻味程度加劇的主要原因。舍飼條件下肉羊飼糧中谷物類等濃縮飼料的比例顯著增加，肉羊瘤胃微生物能夠發(fā)酵谷物中的淀粉產(chǎn)生大量的丙酸，正常情況下丙酸可被用于糖異生途徑，當(dāng)丙酸的產(chǎn)生量超過肝的代謝閾值時，過量的丙酸作為前體物合成丙二酰輔酶A和甲基-丙二酰輔酶A，脂肪酸合成酶通常情況下利用乙酰輔酶A為起始底物合成支鏈脂肪酸，同時也可利用甲基-丙二酰輔酶A合成支鏈脂肪酸。對于羊肉膻味的研究目前的瓶頸主要在于與膻味相關(guān)物質(zhì)在羊肉所占的比例僅以mg·kg來計(jì)量，用常規(guī)的檢測和分析方法很難對其進(jìn)行準(zhǔn)確分析，并且檢測成本較高。目前針對舍飼肉羊腎周脂肪膻味代謝組學(xué)的特征研究較少，因此本試驗(yàn)重點(diǎn)解析不同膻味水平舍飼肉羊腎周脂肪代謝組學(xué)特征，以期為膻味物質(zhì)代謝產(chǎn)物標(biāo)記物的篩選及進(jìn)一步研究沙蔥醇提物調(diào)控膻味的途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

沙蔥粉的制備流程：新鮮沙蔥采摘自甘肅省民勤縣，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室除去雜草，洗凈烘干(65 ℃)，粉碎備用。沙蔥水提物和沙蔥醇提物參照劉旺景等方法為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及動物飼養(yǎng)管理

選取3月齡體重相近((23.67±3.43)kg)，健康、體況良好的小尾寒羊公羔60只，隨機(jī)分為4組，每組15只。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧(CK)，試驗(yàn)組以每只羊計(jì)，每天分別在基礎(chǔ)日糧中添加沙蔥粉(AMR)10 g，沙蔥水提物(AWE)3.4 g和沙蔥醇提物(AFE)2.8 g。本試驗(yàn)中沙蔥粉添加量參考盧媛試驗(yàn)所得的舍飼肉羊最適沙蔥粉添加劑量，沙蔥水提物和沙蔥醇提物的添加劑量根據(jù)沙蔥水提物和沙蔥醇提物的提取率換算所得?；A(chǔ)日糧參照NRC(2007)營養(yǎng)需要量進(jìn)行配制，其組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)持續(xù)75 d，其中預(yù)試期15 d，正試期60 d，基礎(chǔ)日糧每日于07:00和19:00分兩次等量飼喂，根據(jù)剩料量調(diào)整飼喂量，控制每個圈舍剩料量為飼喂量的10%，飼喂期間保證羊只自由采食和飲水，期間4組肉羊的飼養(yǎng)條件和環(huán)境均一致。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (dry matter basis) %

1.3 樣品采集與測定

正試期結(jié)束后從每組挑選6只體重相近的小尾寒羊進(jìn)行屠宰(=24)，屠宰前24 h內(nèi)禁止采食，2 h內(nèi)禁止飲水。屠宰1 h后取背部皮下脂肪(6-7腰椎肌肉上方的脂肪組織)、尾部脂肪(中央位置)、腎周脂肪和大網(wǎng)膜脂肪(中央位置)20～30 g分裝于凍存管中放在-80 ℃條件下保存，用于3種支鏈脂肪酸(MOA、MNA和EOA)的含量及代謝組學(xué)特征的檢測。

1.3.1 3種支鏈脂肪酸的檢測 3種支鏈脂肪酸的定性主要由相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)物的保留時間進(jìn)行確定。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(gas chromatography-mass spectrometry analysis)檢測各脂肪組織中3種支鏈脂肪酸的含量，具體參照Kaffarnik等的方法。根據(jù)各組支鏈脂肪酸的含量選擇極高膻味水平組(HLOF)樣本和極低膻味水平組(LLOF)樣本，進(jìn)行后續(xù)的代謝組學(xué)特征分析。

1.3.2 代謝組學(xué)特征分析

1.3.2.1 樣品前處理：根據(jù)支鏈脂肪酸的檢測結(jié)果，選擇HLOF樣本和LLOF樣本進(jìn)行代謝組學(xué)特征分析，具體方法：將各組所屠宰的6只羊的組織樣本混合，每組制備6個重復(fù)樣本。分別從每個重復(fù)樣本中稱取60 mg，加入內(nèi)標(biāo)(L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg·mL；Lyso PC17:0，0.01 mg·mL，均為甲醇配置)各20 μL和600 μL的甲醇：水(V∶V=4∶1)；加入兩個小鋼珠，在-20 ℃放置2 min預(yù)冷，加入研磨機(jī)(60 Hz,2 min)；超聲提取10 min；-20 ℃靜置30 min；離心10 min(13 000 r·min，4 ℃)，用注射器吸取200 μL上清液，使用0.22 μm的有機(jī)相針孔過濾器過濾后，轉(zhuǎn)移到LC進(jìn)樣小瓶，-80 ℃下保存，直到進(jìn)行LC-MS分析。質(zhì)控樣本(QC)由所有樣本的提取液等體積混合制備而成，每個QC體積與樣本相同。

1.3.2.2 LC-MS分析條件：試驗(yàn)分析儀器為ACQUITY UPLC超高效液相串聯(lián)AB Triple TOF 5600高分辨質(zhì)譜儀組成的液-質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)。色譜條件，色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)；柱溫：45 ℃；流動相：A-水(含0.1%甲酸)，B-乙腈/甲醇(2/3)(/)(含0.1%甲酸)；流速：0.4 mL·min；進(jìn)樣體積：5 μL。質(zhì)譜條件：離子源，ESI；樣品質(zhì)譜信號采集分別采用正負(fù)離子掃描模式。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

對照組和試驗(yàn)組小尾寒羊各部位脂肪組織中支鏈脂肪酸的含量采用SAS 9.2軟件中的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，>0.1為差異不顯著，0.05≤<0.1有差異趨勢，<0.05為差異顯著，差異顯著時采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。UNIFI 1.8.1. 軟件用于原始數(shù)據(jù)的采集經(jīng)Progenesis QI v2.3 軟件處理后，利用偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法分析(OPLS-DA)來區(qū)分各組間代謝輪廓的總體差異，找到組間的差異代謝物。OPLS-DA 分析中，變量權(quán)重值(variable important in projection，VIP)可用來衡量各代謝物的表達(dá)模式對各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，一般以VIP>1的代謝物被認(rèn)為是差異代謝物。進(jìn)一步利用T檢驗(yàn)驗(yàn)證組間差異代謝物是否具有顯著性。篩選的標(biāo)準(zhǔn)為OPLS-DA模型第一主成分的VIP 值>41，T 檢驗(yàn)的值<0.05根據(jù)VIP值對差異代謝物表達(dá)量進(jìn)行可視化分析。利用差異代謝物的 KEGG ID 進(jìn)行通路富集分析，獲得代謝通路富集結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 日糧添加沙蔥及其提取物對舍飼肉羊各部位脂肪組織中3種支鏈脂肪酸的影響

由表2可知，AMR、AWE和AFE組腎周脂肪中MOA(<0.001)、MNA(=0.044)和EOA(<0.001)的含量顯著低于CK組，其中，AFE組腎周脂肪中MOA的含量最低為2.31 μg·g；AMR、AWE和AFE組尾部脂肪中MOA、MNA和EOA的含量與CK組相比無顯著性差異(>0.05)；AMR、AWE和AFE組背部皮下脂肪中MOA(<0.001)和EOA(<0.001)的含量顯著低于CK組，4組間MNA的含量無顯著性差異(>0.05)；AMR、AWE和AFE組大網(wǎng)膜脂肪中MOA(<0.001)和EOA(=0.002)的含量顯著低于CK組，另外，AMR、AWE和AFE組大網(wǎng)膜脂肪中MNA(=0.062)的含量與CK組相比有顯著降低的趨勢。綜上所述，沙蔥及其提取物對腎周脂肪中3種支鏈脂肪酸含量的影響最為顯著，并且沙蔥醇提物對改善腎周脂肪膻味效果最佳，因此選擇CK組腎周脂肪為極高膻味水平組(HLOF)樣本，選擇AFE組腎周脂肪為極低膻味水平組(LLOF)樣本，進(jìn)行后續(xù)的代謝組學(xué)特征分析。

表2 日糧中添加沙蔥及其提取物對舍飼肉羊不同部位脂肪組織中3種支鏈脂肪酸含量的影響Table 2 Effect of dietary supplementation with Allium mongolicum Regel and its extracts on the concentrations of three branched-chain fatty acids in the different adipose tissues of captive meat sheep μg·g-1

2.2 差異代謝物分析

2.2.1 PLS-DA分析和OPLS-DA分析 偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)是一種有監(jiān)督的判別統(tǒng)計(jì)方法，該方法運(yùn)用偏最小二乘回歸建立代謝物表達(dá)量與樣本分組之間的關(guān)系模型，來實(shí)現(xiàn)對樣品類別的預(yù)測。參數(shù)R2X (cum)能對模型有效性進(jìn)行評判，除了參數(shù)R2X (cum)能對模型有效性進(jìn)行評判外，還包括解釋率R2Y (cum)和預(yù)測率Q2 (cum)，PLS-DA模型能更好地解釋和預(yù)測兩組樣本之間的差異，代表模型預(yù)測能力越好，由圖1(左)可知，該模型解釋率和預(yù)測率良好。正交偏最小二乘方-判別分析OPLS-DA是有監(jiān)督的判別分析統(tǒng)計(jì)方法，由圖1(右)可知兩組樣本在OPLS-DA得分圖上具有顯著的差異，該模型解釋率和預(yù)測率良好。

圖1 小尾寒羊腎周脂肪(CK組 vs. AFE組)PLS-DA得分圖和OPLS-DA得分圖Fig.1 PLS-DA and OPLS-DA score plot of perirenal adipose tissue samples (CK group vs. AFE group) in Small-tailed Han sheep

2.2.2 OPLS-DA模型的響應(yīng)排序檢驗(yàn) 為防止模型過擬合，采用7次循環(huán)交互驗(yàn)證(7-fold cross validation)和200次響應(yīng)排序檢驗(yàn)(response permutation testing，RPT)的方法來考察模型的質(zhì)量。使用RPT檢驗(yàn)時，一般要求這種情況的Q2小于0。由圖2可知，R2=0.82，Q2=-0.077，模型不存在過擬合現(xiàn)象。

圖2 Permutation圖Fig.2 Graph of Permutation

2.2.3 單變量統(tǒng)計(jì)分析 利用火山圖對CK組(HLOF)和AFE組(LLOF)代謝物表達(dá)量的變異進(jìn)行可視化，有利于篩選差異代謝產(chǎn)物，如圖3所示，其中紅色圓點(diǎn)代表在試驗(yàn)組中顯著上調(diào)的差異代謝產(chǎn)物(<0.05)，藍(lán)色圓點(diǎn)代表顯著下調(diào)的差異代謝產(chǎn)物(<0.05)，灰色點(diǎn)代表不顯著的差異代謝產(chǎn)物(>0.05)。采用多維分析和單維分析相結(jié)合的辦法，來篩選組間差異代謝產(chǎn)物。篩選的標(biāo)準(zhǔn)為OPLS-DA模型第一主成分的VIP值>1，T檢驗(yàn)的值<0.05。共篩選出差異代謝物共94個，其中56個代謝物下調(diào)，38個代謝物上調(diào)。差異代謝物的分類見圖4，由圖可知，脂類和類脂類分子占比55%、有機(jī)雜環(huán)類占比13%、有機(jī)酸及其衍生物占比10%、苯甲酸鹽類化合物占比6%、有機(jī)氮化合物占比4%、有機(jī)硫化合物占比3%、有機(jī)氧化合物占比1%、其他化合物占比8%。

圖3 小尾寒羊腎周脂肪(HLOF組 vs. LLOF組)差異代謝物火山圖Fig.3 Volcano map of different metabolites of perirenal adipose tissue samples (HLOF group vs. LLOF group) in Small-tailed Han sheep

圖4 小尾寒羊腎周脂肪(HLOF組 vs. LLOF組)差異代謝物分類圖Fig.4 Classification of the significantly varying metabolites of perirenal adipose tissue samples (HLOF group vs. LLOF group) in Small-tailed Han sheep

2.2.4 差異代謝物的篩選 為了更直觀地展示樣本之間的關(guān)系及代謝物在不同樣本之間的表達(dá)差異，本研究對所有顯著差異代謝物表達(dá)量進(jìn)行層次聚類(Hierarchical Clustering)，根據(jù)VIP值對top50差異代謝物表達(dá)量進(jìn)行可視化分析，結(jié)果如圖5。橫坐標(biāo)表示樣本名稱，縱坐標(biāo)表示差異代謝物，每個試驗(yàn)組6個生物學(xué)重復(fù)。左側(cè)的樹狀結(jié)構(gòu)表示差異代謝物之間的相似度聚類關(guān)系。顏色從綠到紅表示代謝物的表達(dá)豐度從低到高，即顏色越紅表示差異代謝物的表達(dá)豐度越高。由圖可知，正、負(fù)離子模式下Top-50代謝物被分為兩類，一類代謝物的表達(dá)量上調(diào)，而另一類代謝物的表達(dá)量下調(diào)。極低膻味組(LLOF)TOP-50差異代謝物中表達(dá)量上調(diào)的代謝物為19個，按物質(zhì)分類判定其中，甘油磷脂類化合物4個，分別為：[PI(16:0/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z)), PI(18:1(9Z)/20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)), PS(18:0/18:1(9Z)), PI(18:1(9Z)/20:3(8Z,11Z,14Z)) ]、脂肪?；?個，分別為：[二十四烷酸(Tetracosanoic acid), 二十二烷酸(Behenic acid), (S)-2-乙酰乳酸((S)-2-Acetolactate), 2-amino-2,3,7-trideoxy-D-lyxo-hept-6-ulosonic acid, 3Z,6Z,9Z,12Z,15Z-Tricosapentaene]；甘油糖脂3個，分別為[DG(18:0/20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)/0:0), DG(18:0/20:4(8Z,11Z,14Z,17Z)/0:0), PS(18:0/18:1(9Z))]；鞘磷脂2個分別為[C16 二氫(神經(jīng))鞘氨醇(C16 Sphinganine), (3’-sulfo)Galbeta-Cer(d18:1/16:0(2OH))]；有機(jī)氮化合物1個為N,N-Dimethylaniline；丙烯醇脂類1個為葉綠醇(Phytol)；苯甲酸鹽1個為非爾氨酯(Felbamate)；未分類化合物2個，分別為[Xestoaminol C, 苯甲烴銨(Benzalkonium)]。表達(dá)量下調(diào)的代謝物為31個，其中，甘油磷脂類化合物7個，分別[LysoPE(22:5(7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)/0:0), PI(20:1(11Z)/0:0), (4E,8E,10E-d18:3)sphingosine, 1-Oleoylglycerophosphoserine, PC(16:0/16:0), PS(O-16:0/20:2(11Z,14Z)), PC(20:2(11Z,14Z)/18:0)]；脂肪?；?個，分別為[蓖麻油酸(Ricinoleic acid), Linoleamide, Cer(d18:0/14:0), Ethyl 9-hexadecenoate]；有機(jī)酸及其衍生物4個，分別為[N-Arachidonoyl tyrosine, D-4’-Phosphopantothenate, L-2-Amino-3-(1-pyrazolyl) propanoic acid, 1-(Malonylamino)cyclopropanecarboxylic acid]；有機(jī)雜環(huán)類化合物3個，分別為[咪唑丙烯酸(Urocanic acid), Isoniazid, N-Methyl-1H-indole-3-propanamide]；苯甲酸鹽3個，分別為[2-(4-Hydroxyphenyl)ethanol, 乙基苯酚(4-Ethylphenol), m-Chlorohippuric acid]；丙烯醇脂類1個為[雷公藤紅素(Celastrol)]；鞘磷脂1個[4E,14Z-Sphingadiene]；有機(jī)氮化合物1個為[組氨醇(L-Histidinol)]；有機(jī)氧化合物1個[Adlupone]；有機(jī)硫化合物1個為[二丁基二硫化物(Dibutyl disulfide)]、其它類化合物5個，分別為[4-羥基-6-甲基吡喃-2-酮(4-Hydroxy-6-methylpyran-2-one), 7-氯犬尿酸(7-Chlorokynurenic acid), PC(16:1(9Z)/20:3(5Z,8Z,11Z)), PC(16:1(9Z)/20:3(8Z,11Z,14Z)), 4-氨基-5-羥甲基-2-甲基嘧啶(4-Amino-5-hydroxymethyl-2-methylpyrimidine)]。

圖5 HLOF組與LLOF組TOP-50差異代謝物熱圖Fig.5 Top-50 differential metabolites thermogram between HLOF group and LLOF group

2.2.5 代謝通路富集分析 基于KEGG數(shù)據(jù)庫對差異代謝物進(jìn)行代謝通路富集分析。代謝通路中值為該代謝通路富集的顯著性。紅線示意值為0.01，藍(lán)線示意值為0.05，條柱的頂端高于藍(lán)線時，其所代表的信號通路具有顯著性。由圖6可知，差異代謝物主要涉及的代謝通路包括：逆行內(nèi)源性大麻素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(Retrograde endocannabinoid signaling)、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、癌癥中的膽堿代謝(Choline metabolism in cancer)、阿米巴類感染(Amoebiasis)、組氨酸代謝(Histidine metabolism)、甘油磷脂代謝(Glycerophospholipid metabolism)、精氨酸和脯氨酸代謝(Arginine and proline metabolism)、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)、亞油酸代謝(Linoleic acid metabolism)和泛酸和輔酶A生物合成(Pantothenate and CoA biosynthesis)。

圖6 TOP-10代謝通路富集圖Fig.6 Top-10 metabolic pathway enrichment map

代謝通路中值為該代謝通路富集的顯著性，選擇顯著性富集pathway進(jìn)行氣泡圖繪制。由圖7分析可知，在TOP-10代謝通路中，富集到Retrograde endocannabinoid signaling代謝通路的代謝物有3個，分別是磷脂酰膽堿(下調(diào))，二酰甘油(上調(diào))和磷脂酰乙醇胺(下調(diào))；富集到Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection代謝通路的代謝物有2個，分別是二酰甘油(上調(diào))和磷脂酰乙醇胺(下調(diào))；富集到Choline metabolism in cancer通路的代謝物有2個，分別是磷脂酰膽堿(下調(diào))和二酰甘油(上調(diào))；富集到Amoebiasis代謝通路的代謝物有2個，分別是二酰甘油(上調(diào))和磷脂酰絲氨酸(上調(diào))；富集到Histidine metabolism通路的代謝物有3個，分別是尿酸(下調(diào))、L-組氨酸(下調(diào))和1-甲基組胺(下調(diào))；富集到Glycerophospholipid metabolism通路的代謝物有3個，分別是磷脂酰膽堿(下調(diào))，磷脂酰乙醇胺(下調(diào))和磷脂酰絲氨酸(上調(diào))；富集到Arginine and proline metabolism代謝通路的代謝物有3個，分別是N-乙酰-L-谷氨酸5-半醛(上調(diào))，1-吡咯啉-2-羧酸鹽(上調(diào))和4-(L-γ-谷氨酸氨基)丁酸酯(上調(diào))；富集到EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥(EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance)代謝通路的代謝物有1個，是二酰甘油(上調(diào))；富集到亞油酸代謝(Linoleic acid metabolism)通路的代謝物有2個，分別是磷脂酰膽堿(下調(diào))和9-順式，11-反癸二烯酸酯(下調(diào))；富集到Pantothenate and CoA biosynthesis代謝通路的代謝物有2個，分別是D-4′-磷酸泛酸鹽(下調(diào))和(S)-2-羥基-2-甲基-3-氧代丁酸酯(上調(diào))。

圖7 TOP-20差異代謝物氣泡圖Fig.7 Top-20 bubble chart of differential metabolites

2.2.6 主要差異代謝產(chǎn)物與3種支鏈脂肪酸含量的相關(guān)性分析 由表3可知，MOA與尿酸([ρ]=0.68,=0.001)、L-組氨酸([ρ]=0.70,=0.012)、1-甲基組胺([ρ]=0.57,=0.033)、磷脂酰膽堿([ρ]=0.62,=0.035)、磷脂酰乙醇胺([ρ]=0.54,=0.044)、9-順式,11-反癸二烯酸酯([ρ]=0.50,=0.001)呈顯著正相關(guān)，與二酰甘油([ρ]=-0.49,=0.016)、磷脂酰絲氨酸([ρ]=-0.64,=0.029)呈顯著負(fù)相關(guān)，與其他代謝產(chǎn)物均無顯著相關(guān)性。EOA與尿酸([ρ]=0.61,=0.016)、L-組氨酸([ρ]=0.72,=0.023)、1-甲基組胺([ρ]=0.68,=0.026)、磷脂酰膽堿([ρ]=0.58,=0.018)、磷脂酰乙醇胺([ρ]=0.61,=0.001)、9-順式,11-反癸二烯酸酯([ρ]=0.47,=0.022)呈顯著正相關(guān)，與二酰甘油([ρ]=-0.45,=0.029)、磷脂酰絲氨酸([ρ]=-0.58,=0.031)呈顯著負(fù)相關(guān)，與其他代謝產(chǎn)物均無顯著相關(guān)性。MOA與尿酸([ρ]=0.59,=0.049)、L-組氨酸([ρ]=0.50,=0.056)、1-甲基組胺([ρ]=0.56,=0.058)、磷脂酰膽堿([ρ]=0.67,=0.014)、磷脂酰乙醇胺([ρ]=0.49,=0.016)、9-順式,11-反癸二烯酸酯([ρ]=0.45,=0.029)、4-(L-γ-谷氨酸氨基)丁酸酯([ρ]=0.36,=0.026)呈顯著正相關(guān)，與二酰甘油([ρ]=-0.51,=0.004)、磷脂酰絲氨酸([ρ]=-0.57,=0.033)呈顯著負(fù)相關(guān)，與其他代謝產(chǎn)物均無顯著相關(guān)性。

表3 腎周脂肪主要差異代謝物與3種支鏈脂肪酸含量的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between main differential metabolites and the contents of three branched-chain fatty acids in perirenal adipose tissue

3 討 論

3.1 沙蔥及其提取物對3種支鏈脂肪酸含量的影響

羊肉中致膻物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和探究一直是肉羊和食品領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題。Wong等首次報(bào)道引起羊肉特殊風(fēng)味的物質(zhì)主要是3種支鏈脂肪酸，即MOA、EOA和MNA，同時也指出，碳鏈長度在7～9之間不同酸(如：辛酸及其異構(gòu)體、2-甲基辛酸、6-甲基辛酸、壬酸、4,6-二甲基辛酸、壬酸及其異構(gòu)體和8-甲基壬酸)的組合也會產(chǎn)生類似于羊肉膻味的不良?xì)馕丁?種支鏈脂肪酸的合成途徑中，丙酸是重要的前體物之一，Berthelot等研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加丙酸鹽能夠顯著提高綿羊體脂中支鏈脂肪酸的沉積量，試驗(yàn)證實(shí)了丙酸是合成奇數(shù)碳脂肪酸和甲基支鏈脂肪酸的重要前體物。Young等研究發(fā)現(xiàn)，飼糧中谷物添加比例增加時，羔羊肌內(nèi)脂肪和體脂中也將沉積更多的支鏈脂肪酸。眾所周知，瘤胃微生物發(fā)酵谷物中的碳水化合物產(chǎn)生大量的丙酸，產(chǎn)生的丙酸被瘤胃上皮細(xì)胞吸收進(jìn)入門靜脈，而后被運(yùn)送到肝，其中一部分丙酸可被氧化或用于糖異生為機(jī)體提供能量，但隨著肝中丙酸供應(yīng)量的不斷增加，肝對丙酸的提取量由85%降低至75%，導(dǎo)致丙酸在外周組織中的可利用比例增加3倍，多余的丙酸被轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A和琥珀酸的中間體甲基丙二酰輔酶A。在脂肪酸的合成中，脂肪酸合成酶通常使用丙二酰輔酶A作為從頭合成直鏈脂肪酸，可利用甲基-丙二酰輔酶A或乙基-丙二酰輔酶A取代丙二酰輔酶A作為脂肪酸從頭合成的前體物，生成甲基-或者乙基支鏈脂肪酸。由此看來，丙酸的生成量是影響支鏈脂肪酸合成的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，沙蔥及其提取物能夠有效降低綿羊肌內(nèi)脂肪中支鏈脂肪酸的含量，改善羊肉膻味，同時進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，沙蔥及其提取物能夠改變綿羊瘤胃發(fā)酵類型，豐富瘤胃液菌群的多樣性，對丙酸生成量的影響可能是降低羊肉膻味的原因之一。另外在支鏈脂肪酸的合成中，提高丙二酰輔酶A脫羧酶的活性能夠降低組織對丙二酰輔酶A的攝取和利用，從而使甲基-丙二酰輔酶A的可用性成比例增加，增加支鏈脂肪酸的合成量，由此推測，沙蔥及其提取物中的活性成分可能降低丙二酰輔酶A脫羧酶的活性，避免脂肪酸合成底物中丙二酸輔酶A被該酶提前降解，因此，降低甲基-丙二酰輔酶A或乙基-丙二酰輔酶A參與合成支鏈脂肪酸的幾率。

組織中支鏈脂肪酸除了來自于脂肪酸的從頭合成，還可來源于小腸吸收的食物、微生物代謝和支鏈氨基酸的降解, 支鏈脂肪酸合成途徑中的丙二酰輔酶A是異亮氨酸和纈氨酸的降解產(chǎn)物，支鏈氨基酸的降解是通過支鏈氨基酸轉(zhuǎn)移酶的脫氨基作用開始的，降解產(chǎn)物支鏈酮酸隨后在線粒體中代謝，在支鏈酮酸脫氫酶復(fù)合物作用下生成?；o酶A，有研究表明，在支鏈脂肪酸合成的同時，支鏈氨基酸的分解代謝同步上調(diào)，其分解代謝產(chǎn)物為三羧酸循環(huán)和乙酰輔酶A的的產(chǎn)生提供碳源，因此，支鏈氨基酸的代謝影響著支鏈脂肪酸的合成，這為探究沙蔥及其提取物降低綿羊體脂支鏈脂肪酸合成機(jī)理提供新的思路。Wallace等研究發(fā)現(xiàn)，肝和大腦中甲基-支鏈脂肪酸的含量低于脂肪組織，這表明支鏈脂肪酸的合成具有組織特異性。Alves等報(bào)道，極端惡劣條件下達(dá)馬拉肥尾羊會動員尾部儲存的脂肪來維持機(jī)體能量需求，長此以往尾部形成獨(dú)特的局部脂肪代謝機(jī)制，同時檢測發(fā)現(xiàn)，尾部脂肪中含有高水平的支鏈脂肪酸，本研究發(fā)現(xiàn)沙蔥及其提取物對尾部脂肪中MOA、MNA和EOA的含量沒有顯著性影響，提示小尾寒羊這種耐粗飼、適應(yīng)能力強(qiáng)的物種可能同樣存在局部脂肪代謝機(jī)制，更深層次的機(jī)制有待進(jìn)一步探究。

3.2 不同膻味水平下舍飼肉羊腎周脂肪的代謝組學(xué)分析

氨基酸是機(jī)體生命活動中的重要組成成分，是蛋白質(zhì)合成和分解的單位和產(chǎn)物，氨基酸通過脫氨和轉(zhuǎn)氨作用分解為α-酮酸進(jìn)而合成糖類、脂類和一些非必需氨基酸，部分氨基酸為4-烷基支鏈脂肪酸的合成提供支鏈碳架結(jié)構(gòu)。本研究發(fā)現(xiàn)，LLOF組與HLOF組相比差異代謝產(chǎn)物尿酸、L-組氨酸和1-甲基組胺三者均表達(dá)下調(diào)，尿酸和1-甲基組胺為L-組氨酸代謝的下游產(chǎn)物參與組氨酸代謝，提示沙蔥醇提物可能通過調(diào)控組氨酸代謝途徑中相關(guān)代謝產(chǎn)物的表達(dá)，進(jìn)而影響4-烷基支鏈脂肪酸的合成。磷脂酰膽堿(卵磷脂)是一種內(nèi)源性的小半抗原分子，廣泛存在于各組織中，它是甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑中膽堿的前體物，是甘油磷脂代謝途徑中膽堿和胞苷二磷酸膽堿的中間產(chǎn)物，也是亞油酸代謝途徑中亞油酸鹽合成的前體物，而9-順式，11-反癸二烯酸酯是亞油酸的下游產(chǎn)物。在亞油酸代謝途徑中磷脂酰膽堿和9-順式，11-反癸二烯酸酯表達(dá)豐度下調(diào)，提示沙蔥提取物可能參與調(diào)控腎周脂肪中的亞油酸代謝途徑，降低亞油酸含量，導(dǎo)致膻味物質(zhì)硬脂酸的合成量下降。磷脂酰乙醇胺(腦磷脂)同樣參與甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝途徑，在甘油磷脂代謝途徑中，是通過磷酯酰絲氨酸的脫羧作用形成的，在動物中，它是通過CDP乙醇胺和1, 2-甘油二酯的反應(yīng)生成的。磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸都是細(xì)胞膜的重要組成成分，如人類紅細(xì)胞膜上就有磷脂酰膽堿(占19%)、鞘磷脂(占8%)、磷脂酰乙醇胺(占16%)和磷脂酰絲氨酸(占10%)，同樣在低等生物中，甲基支鏈脂肪酸在控制細(xì)胞膜的流動性等方面發(fā)揮著十分重要的作用，并有助于其神經(jīng)發(fā)育。相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，3種支鏈脂肪酸含量與組氨酸代謝通路中的尿酸和1-甲基組、L-組氨酸；與甘油磷脂代謝通路中的磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺和磷脂酰絲氨酸；與EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥代謝通路中的二酰甘油；與亞油酸代謝通路中的9-順式，11-反癸二烯酸酯顯著相關(guān)。Xue等研究發(fā)現(xiàn)，沙蔥提取物的攝入并沒有直接調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，而是能夠通過影響綿羊脂肪組織的甲基化水平和lncRNA的表達(dá)間接調(diào)控動物機(jī)體能量代謝、信號通路和細(xì)胞增殖等相關(guān)過程，而這些都是脂質(zhì)代謝的上游調(diào)節(jié)通路，這可能是3種支鏈脂肪酸與上述通路中的代謝產(chǎn)物顯著相關(guān)，但相關(guān)性不強(qiáng)的主要原因。李樹穎等研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖對小鼠細(xì)胞氨基酸代謝途徑具有調(diào)節(jié)作用。沙蔥及其提取物對舍飼肉羊腎周脂肪組織中氨基酸的調(diào)節(jié)可能與黃芪多糖具有構(gòu)效相似性。綜上所述，沙蔥醇提物可能通過調(diào)控舍飼肉羊機(jī)體脂肪酸及氨基酸代謝通路，調(diào)控相關(guān)代謝產(chǎn)物的合成，進(jìn)而影響4-烷基支鏈脂肪酸的合成，從而改善羊肉膻味。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)條件下，沙蔥及其提取物能夠改善除尾部脂肪外其它部位脂肪組織中(腎周脂肪、背部皮下脂肪和大網(wǎng)膜脂肪)3種支鏈脂肪酸，其中沙蔥醇提物對降低腎周脂肪中3種支鏈脂肪酸的沉積效果最佳。代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，沙蔥醇提物可能通過調(diào)控舍飼肉羊機(jī)體脂肪酸及氨基酸代謝通路，調(diào)控相關(guān)代謝產(chǎn)物的合成，進(jìn)而影響4-烷基支鏈脂肪酸的合成，從而改善羊肉膻味。