王建湘，廖 楊，易 瓊，陳新宇

動脈粥樣硬化(AS)發(fā)病機制的研究一直是熱點，目前的研究認(rèn)為動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥和自身免疫性疾病[1-2], 炎癥是致動脈粥樣硬化發(fā)病的中介和中心環(huán)節(jié)[3]。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)是一種公認(rèn)的炎癥細(xì)胞信號傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄蛋白[4]，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損的始發(fā)機制就是緣于NF-κB的激活[5-6]，通過NF-κB的轉(zhuǎn)錄激活可促進細(xì)胞因子[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)]、黏附分子[細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)和血管細(xì)胞間黏附分子-1(VCAM-1)]等基因的表達[7-9]，也就是說動脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展主要通過NF-κB調(diào)控炎癥介質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)[10-11]，NF-κB已經(jīng)成為炎性疾病新的治療靶點[12-13]。柴胡陷胸湯是由小柴胡湯與小陷胸湯二方加減而成的中醫(yī)經(jīng)典名方，既往開展的臨床實踐亦證實該方對冠心病心絞痛具有較好的治療作用[14-15]。本研究擬通過高脂血清誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(ECV304)細(xì)胞損傷建立模型，探討柴胡陷胸湯對細(xì)胞損傷時 NF-κB炎性信號通路相關(guān)因子蛋白和基因表達的影響，以闡明其抗動脈粥樣硬化的作用機制，從而為其臨床防治動脈粥樣硬化疾病提供新的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株傳代培養(yǎng) ECV304購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞所，首先在含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中將細(xì)胞株復(fù)蘇培養(yǎng)，再在37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。

1.2 主要試劑與儀器 胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基均購自美國Sigma 公司，四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒、蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒均購自上海碧云天公司；人TNF-α購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)引物由上海Gene Pharma合成；TRIzol RNA分離試劑及實時定量PCR(RT-PCR)試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific(中國)公司；兔抗人NF-κBp65、ICAM-1、VCAM-1、β-actin、山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)H&L辣根過氧化物酶(HRP)均購自英國Abcam公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Scientific公司，iMark680多功能酶標(biāo)儀、蛋白轉(zhuǎn)膜裝置、Power PacTM 基礎(chǔ)電泳儀、GC-800光密度掃描儀、ChemiDoc TMMP成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司。

1.3 含藥血清和高脂血清的制備 柴胡陷胸湯組方：柴胡10 g，法半夏10 g，黃芩10 g，黃連4 g，瓜蔞10 g，木香6 g，九香蟲6 g，丹參15 g，甘草6 g等。將以上原藥材稱量后，先將藥材用相當(dāng)于藥材量的5倍自來水浸泡2 h，煮沸后再以微火煎煮30 min，過濾后收集煎液，原渣再加水煎煮20 min，過濾取汁得第二煎液。將兩次煎液混合，根據(jù)文獻[16-17]，為保證按人-兔等效劑量4倍、8倍、16倍給藥，分別將柴胡陷胸湯藥液水浴濃縮成2.6 g/mL、5.1 g/mL、10.2 g/mL。

選用清潔級健康新西蘭大耳白兔15只，體質(zhì)量1.85～2.25 kg，許可證號：SYXK(湘)2020-0010，隨機分為正常組、柴胡陷胸湯低劑量組、柴胡陷胸湯中劑量組、柴胡陷胸湯高劑量組、辛伐他汀組，每組3只。其中正常對照組給予蒸餾水，柴胡陷胸湯低劑量組、柴胡陷胸湯中劑量組、柴胡陷胸湯高劑量組分別給予柴胡陷胸湯藥液2.6 g/mL、5.1 g/mL、10.2 g/mL，辛伐他汀組給予辛伐他汀18 mg/(kg·d)。每組均按10 mL/kg體質(zhì)量灌胃給藥，每日2 次，連續(xù)灌胃7 d。末次給藥后2 h自耳部中央動脈放血，分離血清，56 ℃水浴滅活30 min，0.22 μm微孔膜濾器過濾，無菌分裝，制備成與實驗分組相同數(shù)量的含藥血清溶液，低溫(-30 ℃)冷藏備用。每組新西蘭雄性大耳白兔3只，每天每只給予高脂乳劑配方(含5 g膽固醇、5 g蛋黃粉、30 g豬油、2 g豬膽酸鈉、2 g吐溫-80、156 g蒸餾水)，以20 mL/kg連續(xù)灌胃2周[18]，所有動物均自由飲水，2周后，禁食不禁水16 h，以麻醉腹主動脈采血，分離血清，56 ℃滅活30 min，微孔濾膜過濾分裝，制備濃度為50 mL/L高脂血清溶液，放置-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 實驗分組及處理 上述ECV304傳代細(xì)胞調(diào)節(jié)至密度為5×105/mL，按每孔100 μL接種于96孔板，待細(xì)胞鋪滿孔底后，分為正常對照組(20%正常兔血清)、高脂血清組(20%正常兔血清預(yù)處理2 h后加入50 mL/L高脂血清20%)、柴胡陷胸湯低劑量組、柴胡陷胸湯中劑量組、柴胡陷胸湯高劑量組、辛伐他汀組，每組設(shè)10個復(fù)孔。其中柴胡陷胸湯低劑量組、柴胡陷胸湯中劑量組、柴胡陷胸湯高劑量組、辛伐他汀組采用各組含藥血清(體積分?jǐn)?shù)為20%)預(yù)處理2 h后加入50 mL/L高脂血清20%，各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 內(nèi)皮細(xì)胞存活率檢測 實驗完成后收集各組ECV304細(xì)胞，在培養(yǎng)基中加入20 μL/mL的MTT溶液，吸取經(jīng)過MTT培養(yǎng)后的細(xì)胞上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)溶液，將培養(yǎng)板在搖床上低速振蕩10 min，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗在490 nm處檢測各組細(xì)胞的吸光值。

1.5.2 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測NF -κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1蛋白表達 各組細(xì)胞經(jīng)藥物處理后用預(yù)冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2次，吸盡水分后加入放射免疫沉淀試驗(RIPA)組織細(xì)胞裂解液適量，樣品置于冰上裂解20 min，4 ℃、12 000×g下離心15 min。取上清，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，按上樣量計算，加入5×loading buffer 混勻，煮沸10 min。取變性后的蛋白樣品80 μg上樣電泳，電壓100 V；電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(350 mA，2 h)，50 g/L牛血清清蛋白(BSA)室溫封閉2 h，分別加入NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1、β-actin 4 ℃孵育過夜；次日用10×封閉-洗滌緩沖液(TBST)充分清洗，加入相應(yīng)二抗孵育2 h，TBST緩沖液再次清洗，加入顯影劑進行顯影，在暗室中對曝光底片進行顯影、定影、烤干和照相。采用凝膠成像掃描系統(tǒng)進行密度掃描，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin的密度積分比值(p)表示相應(yīng)的蛋白表達水平。

1.5.3 RT-PCR 檢測NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達 上述實驗干預(yù)24 h后收集各組細(xì)胞，用Trizol提取細(xì)胞總RNA，測定(A260/280)比值。以反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用SYBR Green I熒光染料進行RT-PCR 反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參照。擴增條件為95 ℃ 30 s變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。所用引物序列NF-κB(165 bp)：正向引物 5′-AGTGCAGAGGAAACGTCAGAA-3′，反向引物5′-CATTTTACCACTTGGCAGGAA-3′；TNF-α(199 bp)：正向引物5′-TGGCGTGTTCATCCGTTC-3′，反向引物5′-CTACTTCAGCGTCTCGTGTG-3′；ICAM-1 (390 bp)：正向引物5′-TGAAGGCCACCCCAGAGGACAAC-3′，反向引物5′-CCCATTATGACTGCGGCTGCTGCTACC-3′；VCAM-1(354 bp)：正向引物5′-CCAGAATCTAGATATCTTGCTC-3′，反向引物5′-CAGCCTGTCAAATGGGTATAC-3′；β-actin(540 bp)：正向引物5′-TCACCAGGGCTGCTTTTA-3′，反向引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTT-3′。用2-ΔΔCT法計算基因表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組內(nèi)皮細(xì)胞存活率比較 與正常對照組相比，高脂血清組內(nèi)皮細(xì)胞存活率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與高脂血清組相比，柴胡陷胸湯各劑量組和辛伐他汀組細(xì)胞存活率均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)，且以辛伐他汀組和柴胡陷胸湯高劑量組作用更為明顯。詳見表1。

表1 各組內(nèi)皮細(xì)胞存活率比較(±s) 單位：%

高脂血清組與正常對照組比較，①P<0.01；與高脂血清組比較，②P<0.05，③P<0.01。

2.2 各組ECV304細(xì)胞中NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1蛋白表達比較 正常對照組VCAM-1未見表達。與正常對照組相比，高脂血清組NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1 蛋白表達明顯升高(P<0.01)；與高脂血清組相比，柴胡陷胸湯各劑量組和辛伐他汀組NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1蛋白表達明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且以辛伐他汀組和柴胡陷胸湯高劑量組作用更為明顯。詳見表2及圖1。

表2 各組ECV304細(xì)胞中NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1蛋白表達比較(±s)

圖1 各組ECV304細(xì)胞中NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1蛋白表達的凝膠電泳圖(A為正常對照組；B為高脂血清組；C為柴胡陷胸湯低劑量組；D為柴胡陷胸湯中劑量組；E為柴胡陷胸湯高劑量組；F為辛伐他汀組)

2.3 各組ECV304細(xì)胞中NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達比較 正常對照組VCAM-1mRNA未見表達。與正常對照組相比，高脂血清組NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達明顯升高(P<0.01)；與高脂血清組相比，柴胡陷胸湯各劑量組和辛伐他汀組NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達明顯低于高脂血清組(P<0.05或P<0.01)，且以辛伐他汀組和柴胡陷胸湯高劑量組作用更為明顯。詳見表3及圖2。

表3 各組ECV304細(xì)胞中NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達比較(±s)

圖2 各組ECV304細(xì)胞中NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1 mRNA表達電泳圖(M為Marker；A為正常對照組；B為高脂血清組；C為柴胡陷胸湯低劑量組；D為柴胡陷胸湯中劑量組；E為柴胡陷胸湯高劑量組；F為辛伐他汀組)

3 討 論

動脈粥樣硬化病變是起始于血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[1-2]，而血管內(nèi)皮損傷后發(fā)生的脂質(zhì)代謝紊亂是動脈粥樣硬化病變的基礎(chǔ)，巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞通過攝取大量脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，隨著泡沫細(xì)胞崩解，一方面形成脂肪條紋和引發(fā)炎癥，另一方面也加劇了斑塊的不穩(wěn)定性。所以，本研究采用體外培養(yǎng)的ECV304細(xì)胞，由高脂血清介導(dǎo)損傷，可較準(zhǔn)確地反映血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動脈粥樣硬化起始及中心環(huán)節(jié)的病理基礎(chǔ)。而新近研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的初始機制是由于NF-κB激活，NF-κB激活會上調(diào)黏附分子VCAM-1、ICAM-1的表達，以介導(dǎo)單核細(xì)胞黏附內(nèi)皮細(xì)胞并向內(nèi)皮下遷移，從而造成局部組織損傷和炎癥反應(yīng)，而阻斷NF-κB信號通路能下調(diào)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的黏附因子表達[19-20]。

NF-κB的Rel家族蛋白包括RelA(p65)、RelB、c-Rel、NF-κB1(p105-p50)和 NF-κB2 (p100-p52)5個成員，這5種蛋白之間可相互形成同源(如p50/p50)或異源(如p50/p65)二聚體。p50/p65異源二聚體是NF-κB所有形式中最重要的一種，幾乎存在于所有細(xì)胞中，可以起到促進促炎因子表達的作用；而p50/p50同源二聚體與 DNA 結(jié)合后抑制了NF-κB 相關(guān)炎癥基因的表達。靜息狀態(tài)下，NF-κB與κB抑制劑(I-κB)結(jié)合，不具有活性，貯存在細(xì)胞漿中。NF-κB 的活化包括經(jīng)典和非經(jīng)典兩種途徑。當(dāng)NF-κB通過經(jīng)典途徑I-κB激酶(IKK)復(fù)合物激活時，腫瘤壞死因子、IL-1β和脂多糖等被細(xì)胞膜受體識別后，I-κB激酶復(fù)合物被一系列的級聯(lián)反應(yīng)激活，使IκB磷酸化和泛素化，并從NF-κB與IκB形成的復(fù)合物上解離下來，從而進入細(xì)胞核進行基因轉(zhuǎn)錄，通過刺激促炎細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子、誘導(dǎo)型酶和促血管生成因子的表達在宿主先天免疫反應(yīng)中起重要作用[21-22]。

中醫(yī)藥防治動脈粥樣硬化的作用機制，如調(diào)血脂、抗氧化、保護血管內(nèi)皮細(xì)胞功能、抗血小板黏附聚集、抗血栓及抗平滑肌細(xì)胞增殖等，認(rèn)為在本虛標(biāo)實的基礎(chǔ)上，以痰、瘀、毒標(biāo)實表現(xiàn)者居多，治療予以活血化瘀、除濕祛痰、清熱解毒為主[23]。柴胡陷胸湯出自《重訂通俗傷寒論》，具有疏肝理氣、清熱化痰、活血寬胸之功效，與中醫(yī)常規(guī)的治療動脈粥樣硬化從“痰”“瘀”“毒”入手密切配合，但更強調(diào)肝失疏泄、氣機郁滯之病機，治療從疏肝調(diào)肝入手。方中以柴胡疏肝解郁、條達肝氣，半夏辛開散結(jié)、化痰消痞，共為君藥；佐以黃芩、黃連清瀉肝郁之火，瓜蔞清熱化痰、寬胸散結(jié)；木香、九香蟲均為行氣止痛之要藥，并能疏解肝氣之郁滯；丹參活血祛瘀，甘草補益心氣，調(diào)和諸藥。上藥合用，共奏疏肝理氣化痰、寬胸活血止痛之功效，使氣滯得散，痰瘀自消，心痛得止[14]?，F(xiàn)代藥理研究也表明，柴胡皂苷可降低高脂血癥中三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)水平[24]；半夏與黃連配伍具有降血脂、下調(diào)NF-κB表達的作用[25]；黃連素抑制NF-κB通路，下調(diào)血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量，增加一氧化氮(NO)水平，保護冠心病大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞[26]，減輕血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，達到防治動脈粥樣硬化形成的目的[27-28]；丹參的有效成分丹參酮ⅡA具有調(diào)節(jié)血脂和抗動脈粥樣硬化的作用，其機制可能與其參與TNF-α/p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)/NF-κB/視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP4)信號通路調(diào)控有關(guān)[29]。

本實驗研究顯示，由高脂血清介導(dǎo)損傷的ECV304細(xì)胞存活率明顯降低，而NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1表達明顯升高；柴胡陷胸湯可明顯提高ECV304細(xì)胞存活率，抑制NF-κB活化，降低NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1表達，提示柴胡陷胸湯通過阻斷NF-κB信號通路，從而降低下游靶基因TNF-α、ICAM-1、VCAM-1表達，減輕炎癥反應(yīng)，進而發(fā)揮保護血管內(nèi)皮細(xì)胞、抗動脈粥樣硬化作用，這可能是其治療動脈粥樣硬化的重要機制之一，NF-κB可以成為炎性疾病新的治療靶點。