劉鳴昊, 劉素彤, 尚東方, 張麗慧, 顧亞嬌, 趙文霞

河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 脾胃肝膽科， 鄭州 450000

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)進(jìn)展為肝硬化、肝衰竭等終末期肝病的重要環(huán)節(jié)[1]，也是臨床干預(yù)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。有研究[2]發(fā)現(xiàn)，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)肝臟Kupffer細(xì)胞焦亡，放大炎癥反應(yīng)，參與NASH的發(fā)生和進(jìn)展，此過程類似于“痰濕瘀濁”在肝臟的形成和沉積。有學(xué)者[3]認(rèn)為細(xì)胞焦亡可能是中醫(yī)理論中痰濁、瘀血的一種微觀體現(xiàn)。中藥治療具有多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，在NASH的治療中具有一定的優(yōu)勢?；奠顫窕钛绞堑诙珖现嗅t(yī)趙文霞教授根據(jù)NASH“痰濕內(nèi)停、瘀血阻絡(luò)、肝失條達(dá)”的主要病機(jī)而創(chuàng)立的，以澤瀉、丹參、郁金、海藻、決明子、山楂、水飛薊、柴胡組方。方中澤瀉利水滲濕、行氣消瘀為君藥；丹參活血化瘀、涼血安神，郁金活血止痛、行氣解郁，海藻化痰利濕、軟堅(jiān)消痰，共為臣藥；決明子清肝明目，山楂消積散瘀，水飛薊清熱解毒，共為佐藥；柴胡疏肝理氣為使藥，全方共奏化痰祛濕活血之功效。臨床應(yīng)用效果良好。課題組前期研究[4]發(fā)現(xiàn)，化痰祛濕活血方可通過抑制肝組織損傷，減輕炎癥反應(yīng)，但其機(jī)制尚不完全清晰。據(jù)此本研究將以LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞焦亡，化痰祛濕活血方含藥血清干預(yù)后，采用掃描電鏡觀察細(xì)胞焦亡“金指標(biāo)”細(xì)胞膜變化，及免疫熒光觀察參與巨噬細(xì)胞焦亡發(fā)生相關(guān)的GSDMD-N含量及定位，以此揭示化痰祛濕活血方的部分療效機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥物 SD雄性大鼠60只，SPF級(jí)，體質(zhì)量(150±10)g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物合格證號(hào): 11400700116588; 生產(chǎn)許可證號(hào): SXYK(豫)2015-0005；實(shí)驗(yàn)單位動(dòng)物使用許可證：SXYK(豫)2017-0001?；奠顫窕钛筋w粒劑: 澤瀉(批號(hào)15120135)、丹參(批號(hào)15060138)、海藻(批號(hào)15070027)、郁金(批號(hào)15060128)、決明子(批號(hào)15090036)、山楂(批號(hào)15060020)、柴胡(批號(hào)15070208)、水飛薊(批號(hào)15070223)，由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展股份有限公司提供。多烯磷脂酰膽堿膠囊 (易善復(fù)): 賽諾菲(北京) 制藥有限公司(批號(hào)5JD070)。

1.2 主要試劑與儀器 臨界點(diǎn)干燥儀(Quorum，k850),離子濺射儀(HITACHI，MC1000),掃描電子顯微鏡(HITACHI，SU8100),電鏡固定液(Servicebio，G1102)抗熒光衰減封片劑(solarbio，S2110)，曲拉通Triton X-100(T8200)，DAPI溶液(索拉寶，C0065)，山羊血清(S9070，索拉寶)，4%組織細(xì)胞固定液(P1110，索拉寶)，GSDMD-N抗體(affinity，DF12275)

1.3 含藥血清制備 (1)中藥溶液配制：將化痰祛濕活血方散裝顆粒溶于適量雙蒸水中，混勻后100 ℃水浴鍋中煮5 min，自然冷卻至室溫，4 ℃保存?zhèn)溆谩?2)多烯磷脂酰膽堿膠囊溶液配制：將膠囊去殼，藥物溶于適量雙蒸水中混勻，4 ℃保存?zhèn)溆谩?3)分組和給藥：將60只SD大鼠隨機(jī)分為中藥組、西藥組、空白組。根據(jù)人與動(dòng)物等效藥量體質(zhì)量換算方法,B種動(dòng)物的劑量(mg/kg)=W×A種動(dòng)物的劑量(mg/kg)，W為等效系數(shù)。計(jì)算得知大鼠化痰祛濕活血方的等效劑量為1.26 g/100 g體質(zhì)量，化痰祛濕活血方的給藥劑量為等效劑量(相當(dāng)于臨床成人用量的10倍)。中藥組：灌服化痰祛濕活血方顆粒溶液(以純水配成2.52 g/mL，灌服劑量為1 mL/100 g)。西藥組：灌服多烯磷脂酰膽堿混懸液(濃度0.028 5 g/mL)?？瞻捉M：灌服去離子水，1 mL/100 g體質(zhì)量。2 次/d(上午9點(diǎn)及下午5點(diǎn))，連續(xù)3 d。最后1次灌胃結(jié)束后1 h，采用3%的戊巴比妥鈉腹腔注射(0.2 mL/100 g體質(zhì)量)麻醉大鼠，穿刺腹主動(dòng)脈采血，離心后取上清液滅活，采用0.22 μm濾膜過濾后分裝儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱備用。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 (1)將生長良好的RAW264.7細(xì)胞分為6組，分別為空白組、模型組及化痰祛濕活血方高劑量組、中劑量組、低劑量組、對照組。(2)空白組給予含10%空白組血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，模型組給予含LPS(5 μg/mL)的10%空白組血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，高、中、低劑量組在模型組的基礎(chǔ)上分別給予相應(yīng)濃度的10%含藥血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)，對照組在模型組的基礎(chǔ)上給予相應(yīng)濃度的10%多烯磷脂酰膽堿含藥血清，分別培養(yǎng)24 h和48 h后備檢。

1.5 掃描電子顯微鏡觀察各組巨噬細(xì)胞形態(tài) 將貼壁于蓋玻片的細(xì)胞培養(yǎng)處理完成后棄培養(yǎng)基，用PBS漂洗后，加電鏡固定液2 h，再轉(zhuǎn)移至4 ℃保存。固定好的樣品經(jīng)0.1 mol/L磷酸緩沖液PBS(pH 7.4)漂洗3次，每次15 min。再將樣本放入臨界干燥儀內(nèi)干燥，然后緊貼于導(dǎo)電碳膜雙面上放入離子濺射儀樣品臺(tái)上進(jìn)行噴金30 s，掃描電鏡觀察。

1.6 免疫熒光染色觀察巨噬細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白含量及定位 六孔板中棄原培養(yǎng)液；PBS洗滌 2 次；0.25% TritonX-100 ，室溫放置10 min；PBS洗滌2次，每次3 min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫放置20 min；PBS洗滌2次，每次3 min；滴加一抗500 μL(抗體濃度按產(chǎn)品說明劑量配制)，放于4 ℃冰箱過夜或37 ℃孵育箱內(nèi)2 h；PBS洗滌2次，每次3 min；滴加二抗500 μL(抗體濃度按產(chǎn)品說明劑量配制)，37 ℃孵育箱內(nèi)40 min；PBS洗滌2次，每次3 min；染核，500 μL(抗體濃度按產(chǎn)品說明劑量配制)，37 ℃孵育箱內(nèi)15 min；PBS洗滌2次，每次3 min；封片后顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 化痰祛濕活血方對LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞焦亡形態(tài)的影響 在掃描電鏡低倍和高倍觀察下發(fā)現(xiàn)LPS促進(jìn)了巨噬細(xì)胞表面的球狀突起和膜孔的形成(圖1)?？瞻捉M細(xì)胞形態(tài)呈圓形，無腫脹，包膜表面光滑，無凸起，無皺褶和孔隙;模型組細(xì)胞表現(xiàn)形態(tài)偏圓或橢圓，細(xì)胞腫脹膨大，表面有許多氣泡狀突出物，大量皺褶和突起，并伸出較長偽足,細(xì)胞膜上有孔隙形成，這些變化與焦亡形態(tài)特征相符合;對照組細(xì)胞腫脹不明顯，但表面許多氣泡狀突出物，偽足明顯,細(xì)胞膜上孔隙較模型組減少;高劑量組細(xì)胞形態(tài)無腫脹接近空白組，但表面粗糙有偽足，細(xì)胞膜上未見明顯孔隙;低劑量和中劑量組細(xì)胞形態(tài)橢圓或圓形，腫脹，細(xì)胞膜表面粗糙有孔隙，有偽足伸出。

2.2 化痰祛濕活血方對LSP誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞內(nèi)GSDMD-N水平的影響 與空白組相比模型組 GSDMD-N陽性染色強(qiáng)度明顯增加，對照組與中藥高劑量組相較模型組GSDMD-N陽性染色強(qiáng)度均有減弱(圖2)。

圖1 電鏡下巨噬細(xì)胞形態(tài)變化(低倍，×1500；高倍，×6000)Figure 1 Morphological changes of macrophages under electron microscopy (low fold, ×1500; High fold, ×6000)

注：藍(lán)色代表PI染色結(jié)果；綠色代表 GSDMD-N染色結(jié)果。

3 討論

Kupffer細(xì)胞與NASH致病關(guān)系密切，LPS誘導(dǎo)Kupffer細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞焦亡,分泌IL-1β和IL-18誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)是NASH的形成機(jī)制之一。研究[5]發(fā)現(xiàn)NAFLD患者由于飲食結(jié)構(gòu)紊亂等因素，腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳桿菌、擬桿菌、腸球菌、腸桿菌等菌落數(shù)發(fā)生了明顯的改變，腸源性LPS水平增高，腸壁通透性增加，LPS通過腸道-門靜脈-肝臟的“腸-肝軸”循環(huán)影響肝臟，這可能是導(dǎo)致NAFLD向NASH發(fā)展的原因之一。LBP結(jié)合LPS進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)的LPS可直接活化Caspase-11(小鼠亞型，在人身上與 Caspase-11 同源的是 Caspase-4,5)，剪切 GSDMD 形成 GSDMD-N，在胞膜上聚合形成孔道，使 IL-1β 和 IL-18 等炎癥因子被釋放[6]，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。同時(shí)IL-1β 和 IL-18 會(huì)募集更多炎癥細(xì)胞， 擴(kuò)大肝臟炎癥反應(yīng)。研究[7]發(fā)現(xiàn)，在 NASH 模型小鼠肝臟組織中，GSDMD 和 GSDMD-N 蛋白表達(dá)明顯升高，蛋氨酸/膽堿缺乏飲食喂養(yǎng) NASH 模型小鼠在敲除 GSDMD 后，與野生小鼠相比脂肪變性和炎癥程度明顯降低，提示細(xì)胞焦亡在 NASH 發(fā)病過程中起到了重要作用。巨噬細(xì)胞在非病理狀態(tài)下只表達(dá)少量 Caspase-11，當(dāng)給予 LPS 刺激時(shí)， Caspase-11 表達(dá)量增加，作用于 Caspase-1 和 GSDMD-N，引起 IL-1β、IL-1α、 IL-18 的釋放與Kupffer細(xì)胞焦亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞表面出現(xiàn)球狀突起和膜孔的形成。這些變化與焦亡形態(tài)特征相符合。當(dāng)給予多烯磷脂酰膽堿及化痰祛濕活血方含藥血清干預(yù)后發(fā)現(xiàn)可以減少細(xì)胞腫脹和表明突起現(xiàn)象，高劑量組并可明顯減少細(xì)胞孔隙發(fā)生。進(jìn)一步細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)證明，模型組細(xì)胞GSDMD-N陽性染色強(qiáng)度明顯增加，證實(shí)GSDMD-N是參與細(xì)胞膜孔道形成的關(guān)鍵。對照組與中藥組相較模型組GSDMD-N陽性染色強(qiáng)度均有減弱。證明藥物可通過干預(yù)GSDMD-N的表達(dá)減輕細(xì)胞焦亡對肝組織的損傷。

綜上所述，本研究從亞細(xì)胞水平觀察了化痰祛濕活血方對巨噬細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，為中醫(yī)藥防治NASH的機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。后續(xù)還會(huì)開展針對巨噬細(xì)胞焦亡的機(jī)制方面探究化痰祛濕活血方的作用靶點(diǎn)，為該方的臨床使用提供更多實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2021年9月16日經(jīng)由河南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審批，批號(hào)為YFYDW2021026，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：劉鳴昊負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)；劉素彤負(fù)責(zé)資料分析，撰寫論文；尚東方、張麗慧、顧亞嬌參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；趙文霞負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。