吳賽青，程 平，胡麗娟，沈玉蓮，張子悅，胡向陽(yáng)

子宮頸癌是最常見的女性生殖道惡性腫瘤，發(fā)病率較高[1]，持續(xù)感染人乳頭瘤病毒(human papillonma virus,HPV)是子宮頸癌發(fā)病的高危因素，尤其是高危型HPV[2]。近年，因多樣化檢查手段的聯(lián)合運(yùn)用，子宮頸癌發(fā)病率有所下降。有研究表明[3]，HPV DNA敏感度優(yōu)于液基細(xì)胞學(xué)(thinprep cytologic test,TCT)篩查，HPV的PCR檢測(cè)因其靈敏度高、特異性強(qiáng)，常用于HPV感染的早期篩查和分型檢測(cè)，但因HPV感染存在一過(guò)性感染情況，檢測(cè)中也可能存在假陽(yáng)性，而導(dǎo)致轉(zhuǎn)診陰道鏡過(guò)度治療等問(wèn)題。HPV E6/E7 mRNA作為HPV轉(zhuǎn)錄活性的重要標(biāo)志，是子宮頸癌及癌前病變風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的關(guān)鍵指標(biāo)之一。目前，關(guān)于HPV E6/E7 mRNA聯(lián)合TCT篩查手段的相關(guān)報(bào)道較少。本文通過(guò)HPV中E6/E7 mRNA與DNA法分別聯(lián)合TCT進(jìn)行檢測(cè)，并在子宮頸癌前病變中進(jìn)行對(duì)比分析，旨在協(xié)助臨床醫(yī)師選擇合理的子宮頸癌前篩查方法。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2020年1月～2021年12月安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院TCT聯(lián)合HPV DNA分型篩查后，轉(zhuǎn)診陰道鏡下活檢的81例已婚女性患者?；颊吣挲g19～79歲，平均49.5歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)患者均有性生活史；(2)TCT檢查陽(yáng)性或HPV DNA分型檢測(cè)陽(yáng)性或兩者聯(lián)合篩查陽(yáng)性；(3)患者均轉(zhuǎn)診進(jìn)行陰道鏡活檢。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)以往有子宮頸癌病史；(2)曾有子宮手術(shù)史或放療史；(3)妊娠期、哺乳期、近期有激素使用史；(4)陰道鏡檢測(cè)前行抗病毒治療或藥物治療。對(duì)每例細(xì)胞學(xué)標(biāo)本再行HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均知情同意。

1.2 方法

1.2.1液基細(xì)胞學(xué)檢測(cè) 患者檢查前3天應(yīng)避免陰道沖洗及性生活，避開經(jīng)期，用棉球輕輕擦拭黏液，選用專用子宮頸采樣刷進(jìn)行取樣，標(biāo)本送檢病理科，制片。根據(jù)2018年修訂的子宮頸細(xì)胞學(xué)診斷系統(tǒng)(the bethesda system,TBS)進(jìn)行相關(guān)閱片判讀，設(shè)備和試劑均購(gòu)自廣州安必平公司。

1.2.2HPV DNA基因分型檢測(cè) 取樣方法同子宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查，采用HPV反向點(diǎn)雜交法檢測(cè)進(jìn)行HPV基因分型提取PCR擴(kuò)增后，可檢測(cè)28種HPV亞型。結(jié)果判讀：HPV檢測(cè)膜條上，質(zhì)控點(diǎn)PC、CC點(diǎn)均要顯色(圖1)。本試劑盒可檢測(cè)15種高危型病毒亞型(16、18、31、33等)，3種疑似高危型病毒亞型(26、53、66)，10種低危型病毒亞型(6、11、40等)；試劑均購(gòu)自廣州安必平公司。

圖1 HPV DNA 16、18型陽(yáng)性

1.2.3陰道鏡子宮頸活檢病理學(xué)檢查 陰道鏡檢查前患者應(yīng)選擇非經(jīng)期時(shí)間，并于檢查前3天避免性生活，禁止陰道沖洗。采用電子陰道鏡檢查，擴(kuò)陰并充分暴露子宮頸后，將探頭置入受檢者陰道內(nèi)，通過(guò)醋酸白實(shí)驗(yàn)，對(duì)呈現(xiàn)出白色病變、點(diǎn)狀血管、碘不著色等可疑部位行多點(diǎn)活檢，送病理檢查，制成薄切片，染色，鏡檢。根據(jù)WHO(2014)女性生殖器官腫瘤標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類[4]：炎癥、子宮頸低級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL)、子宮頸高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)。

1.2.4HPV E6/E7 mRNA檢測(cè) 子宮頸脫落細(xì)胞，取樣方法與子宮頸液基細(xì)胞學(xué)檢查相同，待檢測(cè)；取子宮頸脫落細(xì)胞樣本1 mL，離心后去除上清。加入1 mL DEPC水，充分震蕩混勻，再次離心去除上清，備用。將提取好的核酸5 μL對(duì)應(yīng)加入反應(yīng)體系，利用熒光PCR儀自動(dòng)上機(jī)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，設(shè)定陰、陽(yáng)性質(zhì)控品，利用Taqman探針并進(jìn)行Blast比對(duì)，記錄樣本Ct值，判讀結(jié)果：樣本在相應(yīng)的通道內(nèi)有對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線且Ct≤26，標(biāo)記為“+”；無(wú)對(duì)數(shù)擴(kuò)增曲線或Ct值>26時(shí)，標(biāo)記為“-”?？蓹z測(cè)15種高危型病毒亞型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82)，3種疑似高危型病毒亞型(26、53、66)，6種低危型病毒亞型(6、11、40等)，試劑均購(gòu)自廣州安必平公司。

2 結(jié)果

2.1 子宮頸癌前病變中HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA的檢測(cè)81例已婚女性陰道鏡下子宮頸活檢結(jié)果顯示，炎癥20例(圖2)，LSIL 21例(圖3)，HSIL 40例(圖4)。其中，經(jīng)HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)：炎癥組3例陽(yáng)性(15%)，LSIL組17例陽(yáng)性(80.95%)，HSIL組39例陽(yáng)性(97.5%)；經(jīng)HPV DNA檢測(cè)顯示：炎癥組15例陽(yáng)性(75%)，LSIL組15例陽(yáng)性(71.43%)，HSIL組32例陽(yáng)性(80%)(表1)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，兩種檢測(cè)方法陽(yáng)性結(jié)果具有一致性，除炎癥組外，LSIL組和HSIL組HPV DNA陽(yáng)性病例HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)結(jié)果均陽(yáng)性。

表1 Bethesda分類中兩種檢測(cè)方法陽(yáng)性率對(duì)比分析[n(%)]

2.2 HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)子宮頸癌前病變中HPV的不同型別除炎癥組3例陽(yáng)性外，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)LSIL與HSIL組的53例陽(yáng)性患者高危型HPV 16、18型陽(yáng)性分別為：10例(47.6%)、27例(67.50%)，其他型別陽(yáng)性分別為：8例(38.1%)、14例(35.0%)(表2，圖5、6)。

表2 HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)子宮頸癌前病變中HPV的不同型別[n(%)]

圖5 HPV E6/E7 mRNA16型陽(yáng)性

2.3 炎癥組中HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)與HPV DNA檢測(cè)陰道鏡轉(zhuǎn)診比較子宮頸活檢炎癥組中，20例HPV E6/E7 mRNA聯(lián)合TCT檢測(cè)僅3例(15.0%)患者行陰道鏡檢查，HPV DNA聯(lián)合TCT檢測(cè)顯示需15例(75.0%)患者行陰道鏡檢查。結(jié)果顯示：HPV E6/E7 mRNA聯(lián)合TCT檢測(cè)與HPV DNA聯(lián)合TCT檢測(cè)相比，其可以降低陰道鏡轉(zhuǎn)診例數(shù)，防止過(guò)度治療。

圖6 HPV E6/E7 mRNA16、18、52型陽(yáng)性

3 討論

2018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示子宮頸癌發(fā)病率位居惡性腫瘤的第14位，位居女性癌癥的第4位，在發(fā)展中國(guó)家其發(fā)病率位居女性腫瘤的第2位[5-6]。子宮頸癌與HPV感染密切相關(guān)，合理的檢測(cè)方法有利于改善患者的治療與預(yù)后[7]。由于檢測(cè)方法多樣化，科學(xué)家已鑒定出200多種HPV型別，不同的型別存在致病的差異性，根據(jù)其與子宮頸癌的關(guān)系可將其分為高危型和低危型，尤其以高危型HPV持續(xù)感染最為顯著[8]。從子宮頸上皮內(nèi)病變發(fā)展為子宮頸癌需要一個(gè)長(zhǎng)期過(guò)程，子宮頸癌前病變臨床檢測(cè)方法也多樣化，單一檢查可能存在一定的漏診及過(guò)度治療，聯(lián)合幾種檢測(cè)方法篩查可提高診斷的敏感性，降低漏診率，防止HPV一過(guò)性感染引起過(guò)度的陰道鏡轉(zhuǎn)診治療。有研究顯示HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)對(duì)HSIL檢測(cè)優(yōu)于TCT檢測(cè)；HPV E6/E7 mRNA聯(lián)合TCT檢測(cè)更能降低HSIL的漏診率，具有重要的臨床意義[9]。

HPV屬于小型無(wú)包膜長(zhǎng)雙鏈環(huán)狀DNA病毒，病毒編碼基因E6、E7在宿主細(xì)胞中的表達(dá)是子宮頸癌發(fā)生的關(guān)鍵因素。根據(jù)HPV基因組組成以及HPV E6/E7 mRNA致病蛋白惡性細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程中作用模式，E6致癌蛋白通過(guò)其它相關(guān)蛋白能與宿主細(xì)胞p53蛋白特異性結(jié)合形成復(fù)合物，利用泛素降解系統(tǒng)促使p53蛋白快速降解，其效應(yīng)等同于p53突變，阻止細(xì)胞所依賴凋亡途徑，而阻礙細(xì)胞的凋亡進(jìn)程從而使細(xì)胞永生化[10]；E7致癌蛋白通過(guò)解離E2F和Rb復(fù)合物，使Rb通路失活，促使細(xì)胞永生，導(dǎo)致癌變[11]。此外，宿主上皮細(xì)胞惡變是由于HPV癌基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物E6/E7 mRNA表達(dá)。有研究報(bào)道，惡性腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelia-mesenchymal transition,EMT)可通過(guò)致癌基因E6和E7激活表達(dá)，使得細(xì)胞趨于EMT變化，從而進(jìn)一步增強(qiáng)惡性細(xì)胞的侵襲力[12-13]。

子宮頸活檢是診斷子宮頸癌及癌前病變的金標(biāo)準(zhǔn)，也是聯(lián)合癌前篩查的最后步驟，但檢查費(fèi)用高且有創(chuàng)傷。臨床在子宮頸防癌篩查前，一般采用其他無(wú)創(chuàng)手段進(jìn)行子宮頸癌前病變的初篩。其中TCT檢查是最常用的子宮頸癌及癌前病變的篩查手段，但由于受取材技術(shù)及診斷醫(yī)師的主觀影響，也存在漏診可能。使用TCT聯(lián)合HPV檢測(cè)篩查子宮頸癌，可降低單項(xiàng)檢查的誤、漏診率[14]。HPV分為高危、低危型，有研究分析了高危型HPV分型檢測(cè)對(duì)子宮頸癌及癌前病變篩查的意義。也有報(bào)道顯示子宮頸癌以高危型HPV 16和18型為主，少數(shù)患者感染其他高危型HPV[15]。余偉等[16]采用HPV E6/E7 mRNA聯(lián)合TCT對(duì)子宮頸癌及癌前病變進(jìn)行篩查，效果優(yōu)于HPV DNA聯(lián)合TCT。HPV DNA與子宮頸癌的發(fā)生過(guò)程關(guān)系較為緊密，但也存在一過(guò)性感染情況；HPV E6/E7 mRNA可能與子宮頸癌的發(fā)展相關(guān)性更高[17]。HPV E6/E7標(biāo)志物能顯示患者子宮頸癌基因情況，且E6/E7蛋白共同表達(dá)能發(fā)揮協(xié)同作用，HPV E6/E7 mRNA是評(píng)估子宮頸癌風(fēng)險(xiǎn)的有效指標(biāo)[18]。本實(shí)驗(yàn)收集81例轉(zhuǎn)診陰道鏡活檢的組織標(biāo)本，以子宮頸活檢結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比分析HPV E6/E7 mRNA聯(lián)合TCT檢測(cè)及HPV DNA聯(lián)合TCT檢測(cè)，結(jié)果顯示：高危型陽(yáng)性，尤其是HPV 16、18型高危型感染陽(yáng)性及長(zhǎng)期感染，更易引起子宮頸癌及癌前病變。HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA在LSIL診斷中無(wú)明顯差異，但在診斷HSIL時(shí)HPV E6/E7 mRNA的臨床價(jià)值更高；炎癥組中HPV E6/E7 mRNA聯(lián)合TCT檢測(cè)比HPV DNA聯(lián)合TCT檢測(cè)，更能降低陰道鏡轉(zhuǎn)診率，避免過(guò)度治療。

綜上所述，通過(guò)HPV E6/E7 mRNA與TCT聯(lián)合篩選與HPV DNA與TCT聯(lián)合篩選的對(duì)比，結(jié)果顯示：前者在HSIL中具有更高的應(yīng)用價(jià)值，HPV E6/E7 mRNA是臨床潛在的診斷子宮頸癌生物學(xué)標(biāo)志物，能為患者臨床診斷治療提供科學(xué)依據(jù)，防止HPV一過(guò)性感染而引起過(guò)度陰道鏡轉(zhuǎn)診。