劉保平

（九江學(xué)院江西長江經(jīng)濟(jì)帶研究院/江西省長江流域產(chǎn)業(yè)生態(tài)模擬與環(huán)境健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 九江 332005）

生態(tài)文明建設(shè)是關(guān)系中華民族永續(xù)發(fā)展的根本大計(jì)［1］。堅(jiān)決打好污染防治攻堅(jiān)戰(zhàn)一個(gè)重要內(nèi)容就是治理水污染。生活污水是水污染重要組成部分。日用洗滌劑和糞便類都是生活污水重要來源。糞便類最終都可被自然界植物和微生物轉(zhuǎn)化為對(duì)環(huán)境無害物質(zhì)，但是日用洗滌劑大多是最近幾百年人類化工產(chǎn)品，排放到環(huán)境中的經(jīng)過稀釋的洗滌劑對(duì)環(huán)境的影響有多大還不完全清楚。洗滌劑在使用過程中經(jīng)過自來水稀釋，然后通過下水道排放，有的是直接排放到江河湖海等環(huán)境水體中。這些水體要澆灌水稻，要養(yǎng)魚。洗滌劑對(duì)環(huán)境會(huì)有什么影響，本研究通過試驗(yàn)結(jié)果分析日用洗滌劑對(duì)作物根部土壤微生物的影響。

洗滌用品行業(yè)是一項(xiàng)與人民生活息息相關(guān)的民生產(chǎn)業(yè)［2］。洗滌用品類型很多，如肥皂、合成洗衣粉、液體洗滌劑、固體狀洗滌劑及膏狀洗滌劑等，可廣泛用于家居、個(gè)人清潔衛(wèi)生、織物清潔護(hù)理、工業(yè)清洗等領(lǐng)域［2］。2019年我國洗滌用品（合成洗衣粉、液體洗滌劑和肥皂）產(chǎn)量約1 092.1萬t［3］。各種洗滌劑都是由表面活性劑、助劑等組成。表面活性劑是洗滌劑配方的核心部分，具有去污、濕潤、分散、乳化、殺菌、抗靜電和增溶作用，助劑具有增溶、增稠、防腐、調(diào)節(jié)pH、增香、增色等作用［4］。洗滌劑對(duì)環(huán)境的影響主要體現(xiàn)在2個(gè)方面：生物降解性和水生生物毒性［5］。

土壤微生物數(shù)量和群落組成及活性變化是衡量土壤質(zhì)量和肥力的一個(gè)重要指標(biāo)［6］。土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組分，在土壤物質(zhì)循環(huán)、生態(tài)平衡和植物養(yǎng)分轉(zhuǎn)換中起著重要的作用，通常被比作土壤C、N、S、P等養(yǎng)分元素的循環(huán)“轉(zhuǎn)化器”、環(huán)境污染物的“凈化器”、陸地生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定的“調(diào)節(jié)器”［7］。土壤微生物是由多個(gè)種群組成的微生物群落，不同種群之間存在著共生、互利、共存、競爭等各種復(fù)雜的關(guān)系，共同在土壤物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要作用［8］。盡管可培養(yǎng)微生物占土壤微生物總數(shù)的比例很小，但是稀釋分離培養(yǎng)單菌落依然是土壤微生物研究方法最常用和最直觀的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品選取栽培花生30年以上且花生品質(zhì)和產(chǎn)量都很高的紅安丘陵山區(qū)優(yōu)質(zhì)旱地［9］，采取五點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)攫取深度10～30 cm土壤4 kg，共20 kg，混勻，過8目篩去除石子等雜物，裝袋備用。選取栽培水稻30年以上優(yōu)質(zhì)稻田，攫取淤泥20 kg，裝袋備用。2種土壤取樣時(shí)間是2020年9月20日，存放在江西九江，花生地黃棕壤活菌濃度測定時(shí)間是2020年11月2日，水稻田淤泥活菌濃度測定時(shí)間是2020年11月5日。

1.1.2 培養(yǎng)基分別配制400 mL 5種固體培養(yǎng)基：酵母甘露醇瓊脂（Yeast mannitol agar，YMA）、酵母粉蛋白胨葡萄糖瓊脂（Yeast peptone dextrose agar，YPD）、LB、高氏1號(hào)培養(yǎng)基（GAU）、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）。補(bǔ)足瓊脂粉至質(zhì)量濃度30 g/L，分別裝入容積為500 mL錐形瓶高壓蒸汽滅菌，每種培養(yǎng)基分別倒平板21個(gè)備用。5種培養(yǎng)基的配方分別為：①YMA培養(yǎng)基配方：甘露醇10.0 g/L，酵母粉1.0 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，氯化鈉0.1 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，無水氯化鈣0.05 g/L，微量元素Rh溶液4 mL/L，瓊脂粉30 g/L，pH 7.0，微量元素Rh溶液配方為：鉬酸鈉0.5 g/L，硼酸鈉0.5 g/L；②YPD培養(yǎng)基配方：蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂粉30 g/L，pH 7.0；③LB培養(yǎng)基配方：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，瓊脂粉30 g/L，pH 7.0；④GAU培養(yǎng)基配方：可 溶 性 淀 粉20 g/L，NaCl 0.5 g/L，KNO31.0 g/L，KH2PO4·3H2O 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，瓊脂30 g/L，pH 7.0；⑤PDA培養(yǎng)基配方：馬鈴薯浸粉6.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂30 g/L，pH 7.0。

1.1.3 洗滌劑溶液分別配制6種質(zhì)量濃度為1 g/L的洗滌劑稀釋液各100 mL。用玻璃碎片刮蹭香皂碎屑0.10 g，加入100 mL去離子水；稱取0.10 g洗衣粉，加入100 mL去離子水；塑料薄膜放置在精度為0.01 g的天平秤上，將1個(gè)金屬勺放在塑料薄膜上，去皮，準(zhǔn)確蘸取洗滌劑0.10 g，加入去離子水100.0 g。按照日常洗滌劑使用習(xí)慣，取樣1滴洗滌劑液或者膏，刮蹭香皂粉末，或者稱取洗衣粉，配制200 mL稀釋液，計(jì)算質(zhì)量濃度。

1.1.4 儀器設(shè)備移液器（DRAGON公司）、烘箱（蘇州諾德）、恒溫培養(yǎng)箱、天平秤（樂祺牌電子天平秤）、滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、土壤四合一檢測儀（DEEPBANG公司）、8目土壤樣品篩（鹽城市悅成公司）。

1.2 方法

1.2.1 pH的測定將100 g土壤樣品與100 g洗滌劑稀釋液混合搖勻，采用DEEPBANG公司生產(chǎn)的土壤四合一檢測儀（可測酸堿度、濕度、溫度、光照）測定pH。

1.2.2 洗滌劑浸泡花生地黃棕壤準(zhǔn)備7個(gè)容積為250 mL錐形瓶，洗凈115℃烘干備用。往每個(gè)錐形瓶中加入花生地黃棕壤樣品100.0 g，分別加入上述6種洗滌劑稀釋液100.0 g，對(duì)照處理加去離子水100.0 g，用塑料薄膜密封，搖勻，放在室內(nèi)或者28℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置。

1.2.3 洗滌劑浸泡水稻田淤泥準(zhǔn)備7個(gè)容積為250 mL燒杯，洗凈115℃烘干備用。往每個(gè)燒杯中加入水稻田淤泥樣品100.0 g，分別加入上述6種洗滌劑稀釋液100.0 g，對(duì)照處理加去離子水100.0 g，用塑料薄膜密封，搖勻，放在室內(nèi)或者28℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置。

1.2.4 改進(jìn)的稀釋涂平板測活菌數(shù)采用改進(jìn)的10倍梯度稀釋法［10］。準(zhǔn)備42個(gè)剪掉蓋的1.5 mL離心管，35個(gè)玻璃涂布棒，140個(gè)平皿，容積為100 mL錐形瓶裝去離子水8瓶，20～200 μL規(guī)格黃色吸頭、100～1 000 μL規(guī)格藍(lán)色吸頭，滅菌備用。稀釋過程首先是取出上述洗滌劑浸泡的土壤溶液樣品0.1 mL，加入1.5 mL離心管中，然后加入0.9 mL無菌

去離子水稀釋，依次類推，先稀釋到第8個(gè)離心管，再稀釋到所需梯度。初步稀釋涂平板試驗(yàn)不做重復(fù)，再次試驗(yàn)做3、4、6個(gè)重復(fù)。

1.2.5 玻璃涂布棒吸附誤差的測定倒取固體培養(yǎng)基，加入0.1 mL菌液，用玻璃涂布棒涂布均勻，玻璃涂布棒由于吸附作用將帶走部分菌液，由此產(chǎn)生的誤差命名為：玻璃涂布棒吸附誤差。用YMA固體培養(yǎng)基，用精度為0.01 g的天平秤測定玻璃涂布棒涂布前后的質(zhì)量，分別為mformer、mlater。誤差設(shè)為S，則第1個(gè)培養(yǎng)基平板菌落數(shù)的S=0.1 g÷［0.1 g-（mlatermformer）］。

1.2.6 土壤浸泡洗滌劑稀釋液后體積的測定土壤100.0 g，水100.0 g，用量筒測定體積V（mL）。

1.2.7 數(shù)據(jù)計(jì)算及方差分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013軟件進(jìn)行計(jì)算，不同處理間的統(tǒng)計(jì)分析及方差分析用IBM SPSS Statistics 17.0軟件計(jì)算。

1.2.8 土壤樣品活菌數(shù)濃度的計(jì)算取100.0 g土壤樣品，設(shè)用YMA培養(yǎng)基計(jì)數(shù)，設(shè)第n個(gè)稀釋度平板菌落數(shù)平均為Xn，土壤樣品每克土壤活菌數(shù)濃度＝（Xn×10n×10×S×V）/100.0，單位為CFU/g。菌落濃度變化一般呈現(xiàn)對(duì)數(shù)正態(tài)分布，因而適宜取對(duì)數(shù)進(jìn)行平均值計(jì)算和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種土壤可培養(yǎng)微生物的濃度

測得100.0 g花生地黃棕壤與100.0 g水混合后體積為146 mL；100.0 g水稻田淤泥與100.0 g水混合后體積為160 mL。所以，得到V黃棕壤=146 mL；V淤泥=160 mL。

測得玻璃涂布棒涂布0.1 mL菌液后的質(zhì)量增加0.02 g，因而涂布第1個(gè)平板試驗(yàn)中，0.1 mL菌液涂布之后只剩下0.08 mL，損失20%，同一梯度菌液第2個(gè)平板吸附的和被吸附的可能都是0.02 mL，可以抵消。根據(jù)這個(gè)試驗(yàn)數(shù)據(jù)校對(duì)誤差，如果每次平行涂布同樣菌液同一梯度2個(gè)平板，將2次結(jié)果平均，除以0.9即可校正，計(jì)算得出S=1.11。代入前述方法“1.2.8”中的公式計(jì)算出活菌濃度。

在2020年11月2日測定花生地黃棕壤樣品的微生物濃度，11月5日測定水稻田淤泥樣品的微生物濃度，試驗(yàn)2次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)試驗(yàn)3個(gè)技術(shù)重復(fù)，取對(duì)數(shù)進(jìn)行均值計(jì)算和方差分析。結(jié)果見表1。

由表1可以看出，用YMA、YPD、LB、GAU、PDA 5種培養(yǎng)基測定2種土壤樣品的活菌濃度，取對(duì)數(shù)值，測得的花生地黃棕壤樣品對(duì)應(yīng)值分別為6.11、5.78、6.13、6.62、6.34；測得的水稻田淤泥樣品對(duì)應(yīng)值分別為5.76、5.51、5.44、5.12、5.34。換算成每克樣品土壤可培養(yǎng)活菌濃度，花生地黃棕壤樣品的活菌濃度 分 別 為1.30×106、6.05×105、1.34×106、4.19×106、2.17×106CFU/g；水稻田淤泥樣品的活菌濃度分別為5.80×105、3.24×105、2.75×105、1.32×105、2.20×105CFU/g。

2.2 洗滌劑稀釋液室溫浸泡土壤樣品36 d后可培養(yǎng)微生物的濃度

2020年11月2日完成花生地黃棕壤浸泡試驗(yàn)，12月8日測定活菌濃度；11月5日完成水稻淤泥浸泡試驗(yàn)，12月11日測定活菌濃度。江西九江2020年11月2日—12月11日氣溫實(shí)況在網(wǎng)站查詢（https：//lishi.tianqi.com/jiujiang/202011.html）?；ㄉ攸S棕壤和水稻田淤泥2種土壤樣品分別浸泡在香皂、洗衣粉、洗發(fā)露、洗潔精、沐浴露、潔廁精稀釋液中，密封存放在室內(nèi)，過36 d測定活菌濃度，取對(duì)數(shù)，計(jì)算平均值、分析方差和顯著性，結(jié)果見表2和表3。

表2 洗滌劑稀釋液室溫浸泡花生地黃棕壤36 d后可培養(yǎng)微生物濃度的對(duì)數(shù)

由表2可以看出，YMA、YPD、LB、GAU、PDA 5種培養(yǎng)基在江西九江冬季測得的花生地黃棕壤活菌濃度（CK）的對(duì)數(shù)在5～6之間，潔廁精稀釋液處理與對(duì)照差異不顯著，與對(duì)照相比，香皂、洗衣粉、洗發(fā)露、洗潔精、沐浴露稀釋液處理顯著提高了5種培養(yǎng)基測得的活菌濃度，提高了0～3個(gè)數(shù)量級(jí)。

由表3可以看出，YMA、YPD、LB、GAU、PDA 5種培養(yǎng)基在江西九江冬季測得的水稻淤泥活菌濃度的對(duì)數(shù)（CK）在4～6之間，潔廁精稀釋液處理與對(duì)照差異不顯著。用5種培養(yǎng)基測得的活菌濃度取對(duì)數(shù)進(jìn)行顯著分析，與對(duì)照相比，香皂、洗衣粉、洗發(fā)露、洗潔精、沐浴露稀釋液處理部分結(jié)果顯著提高，提高幅度可達(dá)0～3個(gè)數(shù)量級(jí)，部分結(jié)果與對(duì)照差異不顯著。

表3 洗滌劑稀釋液室溫浸泡稻田淤泥36 d后可培養(yǎng)微生物濃度的對(duì)數(shù)

6種洗滌劑對(duì)YMA數(shù)據(jù)的影響差異各不相同，影響最大的是洗衣粉，其后依次為：洗潔精、沐浴露、洗發(fā)露、香皂、潔廁精，潔廁精影響不顯著，其他影響都顯著。與對(duì)照相比，洗衣粉顯著提高YPD數(shù)據(jù)，提高2.42個(gè)數(shù)量級(jí)，其他洗滌劑對(duì)YPD影響不顯著。洗衣粉也是影響LB、GAU、PDA數(shù)據(jù)最大的洗滌劑。

2.3 洗滌劑稀釋液在28℃浸泡土壤樣品7、14 d后可培養(yǎng)微生物的濃度變化

花生地黃棕壤和水稻田淤泥兩種土壤樣品分別浸泡在香皂、洗衣粉、洗發(fā)露、洗潔精、沐浴露、潔廁精稀釋液中，密封存放在恒溫培養(yǎng)箱中，設(shè)置溫度為28℃，當(dāng)天分別測定活菌濃度，取對(duì)數(shù)平均值，過7、14 d再測定活菌濃度，取對(duì)數(shù)，減去第0天測定的活菌濃度對(duì)數(shù)平均值，進(jìn)行方差和顯著性分析，結(jié)果見表4至表7。

由表4可以看出，對(duì)照處理浸泡黃棕壤7 d后，YMA、GAU、PDA測得的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)小幅下降，而YPD、LB測得數(shù)據(jù)呈現(xiàn)小幅上升，幅度都在1個(gè)數(shù)量級(jí)以內(nèi)；潔廁精處理浸泡黃棕壤7 d后，YMA、YPD測得數(shù)據(jù)與對(duì)照差異顯著，LB、GAU、PDA測得數(shù)據(jù)與對(duì)照差異不顯著。香皂、洗衣粉、洗發(fā)露、洗潔精、沐浴露5種洗滌劑顯著影響土壤活菌濃度，不過多半使活菌濃度顯著上升，上升幅度在1個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)。

由表5可以看出，對(duì)照處理浸泡淤泥7 d后，YPD測得的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)小幅下降，而YMA、LB、GAU、PDA測得數(shù)據(jù)呈現(xiàn)小幅上升，幅度都在1個(gè)數(shù)量級(jí)以內(nèi)；潔廁精處理浸泡淤泥7 d后，YMA測得數(shù)據(jù)與對(duì)照差異顯著更低，YPD、LB、GAU、PDA測得數(shù)據(jù)與對(duì)照差異不顯著。香皂、洗衣粉、洗發(fā)露、洗潔精、沐浴露5種洗滌劑顯著影響土壤活菌濃度，不過多數(shù)使活菌濃度顯著上升，上升幅度多數(shù)在1～2個(gè)數(shù)量級(jí)，洗衣粉處理導(dǎo)致YMA測得數(shù)據(jù)上升2.02個(gè)數(shù)量級(jí)。

表5 洗滌劑稀釋液28℃浸泡7 d后稻田淤泥可培養(yǎng)微生物濃度的對(duì)數(shù)差別

由表6可以看出，對(duì)照處理浸泡黃棕壤14 d后，YPD、LB測得的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)小幅上升，而YMA、GAU、PDA測得數(shù)據(jù)呈現(xiàn)小幅下降，幅度都在1個(gè)數(shù)量級(jí)以內(nèi)；潔廁精處理浸泡黃棕壤14 d后，YPD、LB測得數(shù)據(jù)與對(duì)照差異顯著降低，YMA、GAU、PDA測得數(shù)據(jù)與對(duì)照差異不顯著。與對(duì)照相比，除了洗衣粉處理YMA測得數(shù)據(jù)差異不顯著以外，香皂、洗發(fā)露、洗潔精、沐浴露4種洗滌劑用5種培養(yǎng)基測得數(shù)據(jù)的其他組合顯著提高土壤活菌濃度，提高幅度大多數(shù)在2個(gè)數(shù)量級(jí)以內(nèi)。

表6 洗滌劑稀釋液28℃浸泡花生地黃棕壤14 d后可培養(yǎng)微生物濃度的對(duì)數(shù)差別

由表7可以看出，對(duì)照處理浸泡淤泥14 d后，5種培養(yǎng)基測得數(shù)據(jù)呈現(xiàn)小幅下降，幅度都在1個(gè)數(shù)量級(jí)以內(nèi)；潔廁精處理浸泡淤泥14 d后，LB、PDA測得數(shù)據(jù)與對(duì)照差異顯著升高，YMA、YPD、GAU測得數(shù)據(jù)與對(duì)照差異不顯著。與對(duì)照相比，除了香皂處理用LB測得數(shù)據(jù)差別不顯著以外，洗衣粉、洗發(fā)露、洗潔精、沐浴露4種洗滌劑用5種培養(yǎng)基測得數(shù)據(jù)的其他組合顯著提高土壤活菌濃度，提高幅度大多數(shù)在2個(gè)數(shù)量級(jí)以內(nèi)，洗發(fā)露導(dǎo)致GAU測得數(shù)量上升2.60個(gè)數(shù)量級(jí)。

表7 洗滌劑稀釋液28℃浸泡14 d后稻田淤泥可培養(yǎng)微生物濃度的對(duì)數(shù)差別

2.4 兩種土壤用洗滌劑稀釋液浸泡前后的pH

6種洗滌劑和1個(gè)對(duì)照共7個(gè)處理，洗滌劑兩種濃度，用兩種溫度保存，供試兩種土壤樣品處理前后的pH測量值見表8和表9。

由表8可以看出，花生地黃棕壤浸泡在1.00 g/L洗滌劑不僅沒有使溶液呈堿性，反而呈弱酸性，其中，潔廁精浸泡酸性更強(qiáng)，pH=6.0，7 d后和14 d后，全都呈中性，pH=7.0。選取自來水測定，pH=6.5，空氣中，pH=7.0。水稻田淤泥浸泡在1.00 g/L洗滌劑，0、7、14 d測定結(jié)果全部為pH=7.0。

表8 洗滌劑稀釋液28℃浸泡對(duì)兩種土壤樣品pH的影響

由表9可以看出，花生地黃棕壤浸泡濃度更高的洗滌劑同樣不僅沒有使溶液成為堿性，而且反而成弱酸性，其中，潔廁精浸泡后酸性更強(qiáng)，pH=6.0，36 d后，全都呈中性，pH=7.0。水稻田淤泥浸泡洗滌劑，在36 d時(shí)，測定結(jié)果全部為pH=7.0。

表9 洗滌劑稀釋液室溫浸泡對(duì)兩種土壤樣品pH的影響

3 討論

3.1 稀釋平板計(jì)數(shù)方法的改進(jìn)

平板計(jì)數(shù)（plate count）包括稀釋涂平板和稀釋倒平板兩種方法。稀釋土壤樣品可使懸浮于溶液中的根瘤菌、酵母菌、細(xì)菌、放線菌孢子和真菌孢子等微生物濃度變得更稀薄從而有利于培養(yǎng)單菌落計(jì)算活菌數(shù)，對(duì)于絲狀真菌菌絲、放線菌菌絲、粘附在較大固體顆粒物上的細(xì)菌等則不適用。部分真菌可通過菌絲刺入其他物質(zhì)，放線菌可通過假根吸附于基質(zhì)，產(chǎn)黏液細(xì)菌可黏附于固體顆粒，這些事實(shí)導(dǎo)致這部分微生物無法進(jìn)入懸浮液，菌細(xì)胞相互之間黏附可能導(dǎo)致單個(gè)菌落由多個(gè)微生物細(xì)胞發(fā)展而成。

用酒精燈火焰滅菌涂布棒可能產(chǎn)生巨大誤差。本研究采取一次性高壓水蒸氣滅菌35根涂布棒冷卻備用。倒平板試驗(yàn)和涂布試驗(yàn)可以直接在試驗(yàn)臺(tái)上，最下部墊2個(gè)滅菌空平皿，倒平板從下倒到上，涂平板從上涂到下，保證倒皿后和涂布前平板保持水平，避免平板中培養(yǎng)基凝固前溢出，避免平板中0.1 mL菌液流到邊界。一種稀釋盒［11］，將單種菌株菌液的稀釋變得簡潔精準(zhǔn)，但是多個(gè)樣品平行稀釋就得多個(gè)盒子。一套多樣稀釋盒［12］，方便多個(gè)樣品的細(xì)菌平行稀釋涂平板，但是稀釋真菌倒平板存在樣品量不足問題。一種環(huán)形稀釋管［13］，適用于真菌稀釋和倒平板計(jì)數(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是便于混勻，便于操作，缺點(diǎn)是缺乏蓋子不方便滅菌，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)固，運(yùn)輸、保存和使用過程容易碰碎。一種便于混勻的稀釋盒［14］，結(jié)構(gòu)穩(wěn)固，方便真菌稀釋倒平板計(jì)數(shù)，但是沒有商品轉(zhuǎn)化，因而市場沒有供應(yīng)。本研究用剪刀剪去蓋的1.5 mL離心管作為稀釋場所，利用8瓶滅菌水來稀釋，采用改進(jìn)的十倍梯度稀釋法，對(duì)樣品可培養(yǎng)微生物濃度進(jìn)行測定和計(jì)算。

3.2 土壤可培養(yǎng)微生物活菌濃度分析

土壤是微生物大本營，每克耕作層土壤各種微生物含量之比大體有個(gè)10倍系列的遞減規(guī)律［15］。土壤微生物兩兩之間形成各種生態(tài)關(guān)系，一種菌株可能會(huì)抑制另外一種菌株的生長，例如產(chǎn)抗生素類微生物會(huì)抑制敏感細(xì)菌的生長。梯度稀釋測定的是懸浮菌、優(yōu)勢菌，對(duì)于嵌入木屑的真菌菌絲、放線菌、黏附于顆粒的細(xì)菌等，可能會(huì)導(dǎo)致偏差。

移液器配合吸頭遠(yuǎn)比傳統(tǒng)玻璃吸管配合吸耳球精準(zhǔn)而且方便。設(shè)計(jì)試驗(yàn)驗(yàn)證，量取0.1 mL去離子水，放在精密天平上稱量3次，結(jié)果精度可達(dá)0.001 g。盡管移液器很精準(zhǔn)，可是10倍梯度稀釋在平板上反映出來的結(jié)果卻出現(xiàn)巨大反常，叫作平板計(jì)數(shù)巨大異常（The great plate anomaly）［16］。玻棒吸附導(dǎo)致第1個(gè)平板損失20%菌液，第2個(gè)和以后的損失為0。

CFU為Colony form unit縮寫，即菌落形成單位。形成一個(gè)菌落的初始微生物會(huì)是什么呢？可能是單個(gè)的活菌細(xì)胞，也可能是雙個(gè)活菌細(xì)胞，例如雙球菌；可能是鏈狀細(xì)胞，例如鏈球菌；可能是4個(gè)菌細(xì)胞，例如四聯(lián)球菌；可能是多個(gè)菌細(xì)胞，例如葡萄球菌；再例如真菌孢子囊。洗滌劑為表面活性劑，可能使脂類物質(zhì)分散，土壤樣品加入吐溫（Tween）后，測得數(shù)據(jù)更高。洗滌劑可能具有同樣效果。土壤充分混勻的情況下，平行測定的微生物濃度可視為相同。

花生播種深度5～7 cm最合適［17］，表層10 cm內(nèi)的土壤可能受空氣和陽光影響較大，花生根部絕大部分在深度30 cm以內(nèi)范圍。自來水可能含有氯等殺毒劑。因而不適宜作本試驗(yàn)配制培養(yǎng)基、稀釋液等。YMA是常用根瘤菌培養(yǎng)基。YPD是常用酵母菌培養(yǎng)基。LB是常用細(xì)菌培養(yǎng)基。GAO是常用放線菌培養(yǎng)基。為防雜菌常加少量重鉻酸鉀，本試驗(yàn)沒加重鉻酸鉀。PDA是常用霉菌培養(yǎng)基。在YMA上生長的不全是根瘤菌，其他4種培養(yǎng)基也是如此。這幾種培養(yǎng)基主要分離的是好氣性微生物，結(jié)果表明水稻田淤泥比花生地黃棕壤微生物濃度稍低?？焐鼍谂囵B(yǎng)1 d后可見單菌落，慢生根瘤菌在2～3 d可見單菌落。單菌落數(shù)目計(jì)數(shù)過早導(dǎo)致未長出的慢生菌落遺漏，計(jì)數(shù)過晚可能導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)的菌落覆蓋其他菌落。本試驗(yàn)培養(yǎng)平板24、48、72 h后分別計(jì)數(shù)，數(shù)據(jù)采取48 h計(jì)數(shù)結(jié)果。

傳統(tǒng)方法本身容易產(chǎn)生誤差，例如9 mL水量取、滅菌、放置、使用過程體積會(huì)變，而且容易遭受雜菌污染。溶液中好氣性微生物可能聚集在溶液表面，有些可能聚集于底部，因此形成不均一性［18］，混勻后汲取溶液過程，菌細(xì)胞可能會(huì)有趨向性，例如產(chǎn)生順流而上或者逆流而下的趨向。

3.3 洗滌劑對(duì)土壤可培養(yǎng)微生物濃度的影響

供試6種洗滌劑，2種濃度，2種土壤，5種培養(yǎng)基排列組合可以有120種。潔廁精減少土壤微生物濃度或者影響不顯著，而其他5種洗滌劑多數(shù)提高了土壤微生物濃度?；ㄉ攸S棕壤是好氧性環(huán)境但缺水，而水稻田淤泥是厭氧環(huán)境但含水充足，測定的黃棕壤微生物濃度普遍高于淤泥。5種培養(yǎng)基都是測定的好氧性懸浮微生物。厭氧性微生物沒測定，非懸浮微生物沒測定，不可培養(yǎng)的無法測定。

李章輝［19］研究發(fā)現(xiàn)花生連作土壤微生物總數(shù)減少。張寶貴等［20］測得青藏高原草甸土壤可培養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量介于4.3×106～4.5×107CFU/g。用常規(guī)技術(shù)可分離的微生物數(shù)量大約占土壤微生物總數(shù)1%［21］。本研究用5種培養(yǎng)基測得的花生地黃棕壤微生物濃度對(duì)數(shù)都在6～7，測得的水稻淤泥微生物濃度的對(duì)數(shù)在5～6?？赡苡绊懲寥牢⑸餄舛葴y定結(jié)果的因素有很多，采樣日期、存放長短、測定日期、測定地點(diǎn)、酸堿度改變、營養(yǎng)物質(zhì)輸入、測定方法、選擇的培養(yǎng)基等?；ㄉ馗迟|(zhì)不能太肥沃，否則導(dǎo)致花生藤豐收而莢果欠收，適當(dāng)?shù)呢汃ね恋厮坪醺m合花生莢果生產(chǎn)。因而這個(gè)猜想也可解釋花生地雖然豐收，但是本研究測定花生地可培養(yǎng)微生物濃度較肥沃土壤明顯更少。本研究測定活菌濃度的同時(shí)，測得了洗滌劑浸泡土壤溶液的pH，結(jié)果沒有變化或者變化較小，因而pH對(duì)土壤微生物濃度影響可以忽略。

日用洗滌劑中含有砷和汞［22］，對(duì)土壤微生物有沒有毒害作用呢？分離培養(yǎng)根瘤菌常用YMA培養(yǎng)基［23］，分 離 葡 萄 球 菌、大腸 桿 菌 等 常 用LB培 養(yǎng)基［24，25］，分離放線菌常用高氏1號(hào)培養(yǎng)基［26］，分離酵母菌常用YPD培養(yǎng)基［27］，分離霉菌常用PDA培養(yǎng)基［28］，這些主要屬于好氧微生物，農(nóng)田土壤好氧類微生物濃度也較高?；ㄉ堑湫汀暗厣祥_花、地下結(jié)果”的作物［29］，也是油料作物［30］，豆科作物［31］，可與根瘤菌共生固氮，土樣采集地常年種植花生，用YMA分離微生物濃度較高，同比水稻田泥土數(shù)值也較高。

根據(jù)上述結(jié)果與分析，可以得出如下結(jié)論：①6種濃度高于1.00 g/L的洗滌劑稀釋液浸泡兩種土壤室溫存放36 d，與對(duì)照相比，潔廁精對(duì)土壤微生物的影響不顯著，香皂、洗衣粉、洗發(fā)露、洗潔精、沐浴露顯著提高土壤可培養(yǎng)微生物濃度大約0～3個(gè)數(shù)量級(jí)。②6種濃度為1.00 g/L的洗滌劑稀釋液浸泡兩種土壤28℃存放14 d，與對(duì)照相比，潔廁精顯著降低黃棕壤中YPD、LB測得的菌群近1個(gè)數(shù)量級(jí)，香皂、洗衣粉、洗發(fā)露、洗潔精、沐浴露顯著提高兩種土壤可培養(yǎng)微生物濃度約1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。③兩種土壤可以緩沖6種洗滌劑供試濃度在室溫和28℃時(shí)對(duì)土壤酸堿性的影響。

致謝：對(duì)江西省長江流域產(chǎn)業(yè)生態(tài)模擬及環(huán)境健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室陳劍鋒博士、邱秀文博士在試驗(yàn)過程中提供的幫助表示誠摯的感謝。