高家樂，姚明江，張 偉，劉建勛

缺血性腦血管疾病是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致患者殘疾和死亡的主要原因[1]，腦缺血后可以誘發(fā)內(nèi)源性的神經(jīng)發(fā)生，是機(jī)體應(yīng)對缺血性損傷的一種代償性保護(hù)機(jī)制。5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-deoxy Uridine,BrdU)作為DNA堿基胸腺嘧啶核苷的類似物，與胸腺嘧啶核苷相同，在細(xì)胞有絲分裂的S期摻入到增殖或分裂細(xì)胞的核內(nèi)[2]，是神經(jīng)發(fā)生中用來標(biāo)記具有增殖活性細(xì)胞的重要指標(biāo)，常與干細(xì)胞、神經(jīng)祖細(xì)胞以及神經(jīng)元的一些標(biāo)志物共同標(biāo)記，以檢測新生神經(jīng)細(xì)胞的情況。側(cè)腦室下區(qū)和海馬齒狀回顆粒下區(qū)是缺血后神經(jīng)發(fā)生的兩個經(jīng)典位點(diǎn)[3]，本實(shí)驗(yàn)以腦缺血大鼠為例，取含有側(cè)腦室和海馬的冠狀切面腦組織行BrdU免疫熒光染色，通過漂片法探討冷凍切片BrdU免疫熒光染色的經(jīng)驗(yàn)，比較是否灌注多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)、BrdU新舊抗體以及不同厚度腦片對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，為科研實(shí)驗(yàn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物SPF級健康SD大鼠3只，雄性，體重140～160 g，購自北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動物公司，動物合格證號：SCXK(京)2019-0010。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院動物倫理審查委員會批準(zhǔn)。

1.2 腦缺血模型制備和BrdU給藥實(shí)驗(yàn)大鼠以400 mg/kg腹腔注射4%水合氯醛麻醉，根據(jù)文獻(xiàn)復(fù)制大鼠微球栓塞所致腦缺血模型[4]，從術(shù)后第一天開始腹腔注射BrdU(50 mg/kg)，每天注射1次，連續(xù)7天，最后一天注射后取材。

1.3 取材和標(biāo)本處理大鼠麻醉后經(jīng)腹主動脈取血，然后夾閉腹主動脈上方。先經(jīng)左心室灌0.9%生理鹽水至肝臟流出澄清液體，后改用4%PFA灌注至大鼠抽搐，全身僵直，即完成活體灌注固定。隨后取出大鼠完整的腦組織于4%PFA中固定2 h，將腦組織浸入25%蔗糖溶液中，待2～3天組織沉淀后直接進(jìn)行冷凍切片，收集不同厚度的腦片置于0.1 mol/L PB中，用于BrdU免疫熒光染色。

對于不灌注4%PFA的大鼠，經(jīng)左心室灌注0.9%生理鹽水至肝臟流出澄清液體，然后取出整腦，用模具從中間修成前后2塊，分別包含側(cè)腦室和海馬，于4%PFA中4 ℃固定過夜，然后將腦組織浸入25%蔗糖中，后續(xù)操作同上。

1.4 BrdU免疫熒光染色依據(jù)實(shí)驗(yàn)需要對照《大鼠腦立體定位圖譜》(第3版)[5]，取含有側(cè)腦室和海馬的腦冠狀切面組織，厚約5 mm，在其周圍滴加OCT，冷凍后進(jìn)行冷凍切片。設(shè)置4個梯度厚度的腦片，分別為25、30、35和40 μm，收集腦片依次放入含有0.1 mol/L PB的6孔板中，采用漂片法進(jìn)行BrdU免疫熒光染色。

將腦片置于0.1 mol/L PB中漂洗3次，每次5 min。切片經(jīng)1 mol/L HCl(37 ℃孵育30 min)變性，用0.1 mol/L硼酸鈉(pH 8.5)室溫中和10 min，再經(jīng)0.1 mol/L PB漂洗3次，每次5 min。3%山羊血清室溫封閉30 min，BrdU單克隆抗體(稀釋度1 ∶500) 4 ℃孵育過夜，0.1 mol/L PB中漂洗3次，每次5 min。再將腦片置于含有DAPI的對應(yīng)二抗(稀釋度1 ∶500)中，室溫避光孵育90 min，隨后于0.1 mol/L PB中避光清洗3次，每次5 min，再于0.02 mol/L PB中貼片，待切片略干但保持濕潤狀態(tài)下用抗熒光淬滅封片劑封固，并用透明指甲油將蓋玻片邊緣固封。采用Olympus熒光顯微鏡在10倍物鏡下，觀察BrdU細(xì)胞的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 灌注PFA和不灌注PFA：側(cè)腦室下區(qū)和海馬齒狀回BrdU細(xì)胞的表達(dá)BrdU呈核表達(dá)，在側(cè)腦室下區(qū)和海馬齒狀回均有陽性。灌注PFA與不灌注PFA的大鼠腦片，在側(cè)腦室下區(qū)和海馬齒狀回顆粒下區(qū)均可見BrdU陽性(圖1)。同等條件下，其中不灌注PFA的大鼠腦片BrdU熒光信號更加清晰。

圖1 A.腦缺血大鼠側(cè)腦室下區(qū)BrdU呈陽性(新BrdU抗體，腦片厚40 μm)；B.腦缺血大鼠海馬齒狀回BrdU呈陽性(新BrdU抗體，腦片厚40 μm)

2.2 舊BrdU抗體：側(cè)腦室下區(qū)和海馬齒狀回BrdU細(xì)胞的表達(dá)BrdU一抗4 ℃孵育過夜，第二天回收后于4 ℃保存，使用舊的BrdU抗體進(jìn)行免疫熒光染色。結(jié)果顯示：在大鼠腦組織的側(cè)腦室下區(qū)和海馬齒狀回顆粒下區(qū)BrdU均明顯陽性(圖2)，提示回收利用BrdU抗體具有可行性。

圖2 腦缺血大鼠側(cè)腦室下區(qū)和海馬齒狀回BrdU呈陽性(不灌注PFA，腦片厚40 μm)

2.3 不同厚度的腦片:側(cè)腦室下區(qū)BrdU細(xì)胞的表達(dá)腦組織冷凍切片厚25～50 μm，為尋找合適的切片厚度以增加切片數(shù)量，更好地適應(yīng)實(shí)驗(yàn)需求，采用25、30和35 μm的大鼠腦片進(jìn)行側(cè)腦室下區(qū)BrdU免疫熒光染色。結(jié)果顯示：25、30和35 μm的腦片BrdU均呈陽性(圖3)。

圖3 腦缺血大鼠側(cè)腦室下區(qū)BrdU呈陽性(灌注PFA，新BrdU抗體)

3 討論

BrdU是神經(jīng)發(fā)生中反應(yīng)增殖的重要指標(biāo)，雖然石蠟切片免疫陽性物易被精確定位，但切片保存的時間和溫度不當(dāng)會導(dǎo)致組織抗原丟失，抗原反應(yīng)活性降低常發(fā)生在石蠟切片上，前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)石蠟切片BrdU染色效果并不理想。冷凍切片能較完整地保存抗原的免疫活性，冷凍切片可選用漂片法和貼片法進(jìn)行免疫熒光染色，漂片法是指將切好的切片直接置于裝有緩沖液的6孔板(或12孔板)中，清洗幾次后，封閉，孵育一、二抗，最后裱在載玻片上，封固后進(jìn)行觀察；而貼片法需要將切好的切片，貼在載玻片上再進(jìn)行下一步染色。漂片法與貼片法相比，其更能使抗體從兩側(cè)滲透，更有利于抗體與抗原充分反應(yīng)，故本實(shí)驗(yàn)采取冷凍切片漂片法進(jìn)行BrdU免疫熒光染色。

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：(1)灌注PFA與不灌注PFA對BrdU熒光染色的影響：選用交聯(lián)劑PFA對動物組織進(jìn)行固定，有利于保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但交聯(lián)會阻斷抗體的結(jié)合能力，可能降低某些組分的抗原性，特別是固定時間較長或使用較高濃度的交聯(lián)固定劑。與灌注PFA的大鼠相比，未進(jìn)行PFA灌注的大鼠側(cè)腦室下區(qū)和海馬齒狀回顆粒下區(qū)均可見BrdU明顯表達(dá)，免疫熒光染色過程中切片完整，無脫片現(xiàn)象。(2)一抗回收對BrdU熒光染色的影響：漂片法浪費(fèi)抗體，考慮到實(shí)驗(yàn)成本，在BrdU一抗4 ℃孵育過夜后，第二天將其回收到干凈的離心管中置于4 ℃保存，結(jié)果顯示使用舊BrdU抗體在腦組織的側(cè)腦室下區(qū)和海馬齒狀回均有明顯表達(dá)，提示回收利用BrdU抗體的可行性，同時BrdU抗體回收利用的次數(shù)以及保存期還需要進(jìn)一步分析。(3)切片厚度對BrdU熒光染色的影響：腦組織冷凍厚切片(25～50 μm)可以觀察由神經(jīng)元胞體延伸而來的突觸[6]，在以上的實(shí)驗(yàn)中均使用40 μm厚腦片，結(jié)果較為理想。由于側(cè)腦室和海馬所在部位的相應(yīng)腦片厚度有限，為尋找合適的切片厚度以增加切片數(shù)量，更好地適應(yīng)實(shí)驗(yàn)需求，本實(shí)驗(yàn)又探討了不同厚度的腦片對BrdU染色的影響。前期實(shí)驗(yàn)表明20 μm腦片太薄，在漂洗、貼片過程中操作困難，易松散爛片，不易貼片。故本實(shí)驗(yàn)選擇25、30和35 μm厚腦片進(jìn)行側(cè)腦室下區(qū)的BrdU免疫熒光染色，結(jié)果顯示均有BrdU表達(dá)，其中腦片越厚，漂洗、挑片和貼片等操作相對容易，腦組織的完整性也更好。

總之，腦組織冷凍切片漂片法能較好地滿足BrdU免疫熒光染色的需求，對于冷凍切片厚度的選擇，腦組織前期處理是否灌注PFA及染色過程中BrdU回收利用的次數(shù)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮托枨蟆⒔?jīng)濟(jì)效益等進(jìn)行綜合考慮。