王 莉，李 丹，唐 凱，黃育剛

腎上腺皮質癌(adrenocortical carcinoma,ACC)是一種發(fā)生于腎上腺皮質的較為罕見的惡性腫瘤，易發(fā)生局部浸潤和轉移，約占原發(fā)性腎上腺瘤的14%[1]。ACC患者預后較差，有局部晚期疾病的ACC患者5年生存率為35%～50%，有遠處轉移患者的5年生存率為0～28%[2]。目前，外科手術或基于米托坦-鉑的化學療法仍然是唯一有效的治療策略[1-3]。因此，提高ACC的早期診斷率、發(fā)現(xiàn)評估預后的新指標和抗腫瘤治療的新靶點已成為ACC研究的焦點。著絲粒蛋白F(centromere protein F,CENPF)是細胞周期相關核抗原，參與細胞周期的調控[4-5]。研究表明，CENPF參與多種腫瘤的發(fā)生，包括肝癌[6]、乳腺癌[7]、前列腺癌等[8]；但國內外鮮有CENPF在ACC中表達的報道。本文根據腫瘤基因相關公共數(shù)據庫對ACC中CENPF的表達、預后的相關性及生物學功能進行初步分析，以提高臨床與病理醫(yī)師對ACC的認識水平，為ACC的預后或治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2011年1月～2021年5月湖北省十堰市太和醫(yī)院/湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院病理科ACC 6例、腎上腺皮質腺瘤12例及正常腎上腺皮質12例(對照組)，患者均有完整的臨床病理資料，術前均未行放、化療。本實驗經我院倫理委員會批準，患者或家屬均知情同意。

1.2 免疫組化手術標本均經10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)HE、免疫組化EnVision兩步法染色。兔抗人CENPF一抗(Abcam公司，稀釋比1 ∶500)37 ℃孵育60 min，HRP二抗(福州邁新公司)37 ℃孵育30 min，蘇木精復染30 s。光鏡下觀察CENPF蛋白的表達，每個組織隨機選擇3個視野(400×)進行計數(shù)，并計算CENPF陽性細胞百分比，即CENPF陽性細胞率=CENPF陽性細胞計數(shù)/腫瘤細胞計數(shù)×100%。所有切片均經兩位病理醫(yī)師采用雙盲法閱片。

1.3 細胞系RNA干擾實驗及RT-PCR設計干擾性小分子RNA(siCENPF)，探討CENPF在人ACC細胞系SW13細胞中的功能。用50 nmol/L的CENPF-siRNA(siCENPF組)或對照siRNA(siNC)分別轉染人SW13細胞48 h。siCENPF引物：5′-GACCCA GAAACUAGCUUAUTT-3′；siNC引物：5′-UUCUCCGA ACGUGUCACGUTT-3′。使用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)從SW13細胞中提取總RNA。利用Oligo(dT)引物和逆轉錄酶生成的cDNA，運用QuantiTect-SYBR-Green-PCR-Master-Mix試劑盒(德國Qiagen公司)和ABI-Prism 7000分析儀(美國Applied Biosystems公司)行實時定量PCR檢測。CENPF：正向引物5′-AGCACTGATCACCTGTTAGC-3′，反向引物5′-ACCCACATACAAACAGAGATTG-3′；內參基因GAPDH：正向引物5′-CGGAGTCAACGGATTTG GTCGTAT-3′，反向引物5′-AGCCTTCTCCATGGTG GTGAAGAC-3′。所有實驗均重復3次，使用2-ΔΔCt法計算siCENPF組和對照組中CENPF mRNA水平，引物均由上海生工生物公司合成。

1.4 Western blot法用siCENPF和siNC分別轉染人SW13細胞48 h，收集細胞，提取蛋白。加入CENPF一抗(Abcam公司，稀釋比1 ∶500)，4 ℃孵育細胞膜過夜；與HRP二抗結合的IgG抗體室溫下孵育1.5 h。ECL化學發(fā)光試劑盒顯色。

1.5 CCK-8細胞增殖實驗將人SW13細胞以100 μL(合計2×103個細胞)接種于96孔板，分別轉染50 nmol/L的siCENPF和siNC。向每孔中添加10 μL CCK-8試劑(上海碧云天生物公司)。細胞在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72和96 h,分別測量各時間點在450 nm處的吸光度值(OD)。

1.6 劃痕試驗將人SW13細胞接種于DMEM(含10%胎牛血清)的12孔板中，用50 nmol /L siCENPF和siNC分別轉染細胞48 h。用20 μL移液管尖劃痕；每孔再用PBS沖洗5次，以清除劃痕上的漂浮細胞，并向每孔中添加3 mL 10%FBS、含1%抗生素的DMEM。在0、48 h拍攝劃痕區(qū)域，48 h內細胞遷移的寬度=0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度。

1.7 腫瘤數(shù)據庫的信息分析本實驗根據GEO數(shù)據庫查詢與ACC研究相關的所有數(shù)據集，研究資料包括人ACC及其鄰近或正常腎上腺皮質組織，篩選得到數(shù)據集：GSE90713。在GEPIA基因數(shù)據服務平臺可檢索到 TCGA數(shù)據庫和GTEx項目的79例ACC和128例正常樣本的RNA測序表達數(shù)據。本實驗應用GEPIA平臺進行腫瘤及正常組織中CENPF的差異表達、病理分期、CENPF相關的表達、基因相關性及患者生存分析。

1.8 統(tǒng)計學分析采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計學分析，應用t檢驗對正常組織與ACC組織中CENPF的表達差異進行比較。采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進行多組間比較；應用χ2檢驗或Fisher精確概率法分析CENPF表達與臨床病理特征的關系。采用Kaplan-Meier生存曲線分析CENPF表達對ACC患者預后的影響；應用Log-rank檢驗比較兩組間的生存差異；并用Cox回歸模型分析CENPF表達對生存期及臨床特征(分期、分級等)的影響。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 正常腎上腺組織、腎上腺皮質腺瘤及ACC組織中CENPF的表達腎上腺皮質腺瘤的結節(jié)切面呈金黃色、質硬(圖1A)；ACC切面的包膜完整或有缺陷，一些區(qū)域呈灰紅色，有壞死(圖1B)。HE染色示：正常腎上腺皮質的網狀帶細胞，胞質呈嗜酸性顆粒，細胞排列無特征性，空泡狀、核仁小(圖2A)。腎上腺皮質腺瘤腫瘤細胞呈巢、團狀分布，胞質豐富，呈嗜酸性，可見小核仁(圖2B)。ACC細胞呈片狀或大的巢、團狀排列，被纖細的竇系網狀結構分隔，癌細胞生長密集，核仁清楚(圖2C)。免疫組化檢測顯示：CENPF在腎上腺皮質腺瘤組和正常腎上腺組中均呈低表達或不表達(圖3A、B)，在ACC中呈核表達，且表達量顯著高于腎上腺皮質腺瘤及正常腎上腺組織(圖3C)。CENPF在ACC組織中的陽性率顯著高于正常腎上腺皮質、腎上腺皮質腺瘤(圖4)。本組6例ACC中CENPF均陽性，其中5例CENPF的陽性細胞率>10%，1例CENPF的陽性細胞率約8%。而CENPF在腎上腺皮質腺瘤及對照組中大多數(shù)不表達(陽性細胞率0～2%)。

圖1 A.腎上腺皮質腺瘤的結節(jié)切面呈金黃色、質硬；B.腎上腺皮質癌切面的包膜完整或有缺陷，一些區(qū)域呈灰紅色，有壞死

圖2 A.正常腎上腺皮質的網狀帶細胞，胞質呈嗜酸性顆粒，細胞無特征性排列，空泡狀、核仁??；B.腎上腺皮質腺瘤的腫瘤細胞呈巢、團狀分布，胞質豐富，呈嗜酸性，可見小核仁；C.腎上腺皮質癌腫瘤細胞呈片狀或大的巢、團狀排列，被纖細的竇系網狀結構分隔，癌細胞生長密集，核仁清楚 圖3 A.CENPF在正常腎上腺皮質中低表達；B.CENPF在腎上腺皮質腺瘤中不表達；C.CENPF在腎上腺皮質癌中的染色呈核表達(紅色箭頭)，EnVision兩步法

圖4 不同腎上腺皮質組織中CENPF的表達：***P<0.001，ns為P>0.05

2.2 ACC中CENPF的表達差異為進一步驗證CENPF在ACC中的表達，對GEO數(shù)據集應用GEO2R進行表達差異分析，GSE90713數(shù)據集包含5例正常腎上腺皮質組織和58例ACC組織。在GSE90713研究芯片中，CENPF mRNA在ACC中的表達量高于正常腎上腺皮質組織(P=0.000 7，圖5A)。在GEPIA平臺中，數(shù)據庫包含128例正常腎上腺皮質組織和79例ACC組織。本組結果顯示：CENPF mRNA在ACC中的表達量高于正常腎上腺皮質(P<0.05，圖5B)。此外，根據GEPIA平臺的分析顯示，在ACC患者中CENPF mRNA表達量與臨床分期(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)呈正相關(P=0.000 174，圖5C)。這表明CENPF異常表達與ACC的惡化程度或疾病進展相關。

圖5 腎上腺皮質癌中CENPF表達的差異：A.GSE90713的分析；B.GEPIA平臺的分析：*P<0.05；C.CENPF mRNA表達量與TNM分期的分析

2.3 ACC中CENPF 表達與臨床病理特征的關系根據TCGA腫瘤數(shù)據庫中CENPF mRNA表達的中位值，將79例ACC分為低表達組(39例)和高表達組(40例)，分析CENPF表達與患者性別、年齡、臨床分期、病理分級等相關性。在ACC中，CENPF表達與患者年齡、性別、腫瘤發(fā)生位置無關(P>0.05，表1)。隨著臨床分期升高，CENPF高表達者顯著多于CENPF低表達者(尤其是TNM分期 Ⅲ、Ⅳ期，P<0.001)。CENPF高表達者更易發(fā)生腫瘤復發(fā)(P<0.001，表1)。腫瘤發(fā)生淋巴結轉移的患者中，CENPF高表達者明顯多于CENPF低表達者(P<0.001，表1)。

表1 腎上腺皮質癌中CENPF表達與臨床病理特征的關系

采用Cox單因素、多因素回歸分析，CENPF與患者年齡、性別、分級、TNM分期、發(fā)生腫瘤復發(fā)等臨床因素對ACC患者預后的影響。Cox單因素回歸分析顯示：CENPF和TNM分期與ACC患者的預后相關(P<0.01，表2)。Cox多因素回歸分析顯示：CENPF和TNM分期可能是ACC患者的獨立預后因素(P<0.01，表2)。

表2 腎上腺皮質癌中CENPF的Cox單因素、多因素回歸分析

2.4 ACC中CENPF表達與預后的關系為進一步分析CENPF基因表達與ACC患者預后的關系，根據CENPF mRNA表達的中位值將ACC患者分為CENPF高表達組和CENPF低表達組，應用GEPIA平臺繪制生存曲線。結果顯示：CENPF表達與患者預后，即總生存率、無進展生存率均呈顯著負相關(HR=8.88,P=0.000 24；HR=4.12,P=0.001 7，圖6)。

圖6 腎上腺皮質癌中CENPF表達與患者預后的關系 A.CENPF表達與腎上腺皮質癌患者總生存率的關系；B.CENPF表達與腎上腺皮質癌患者無進展生存率的關系

2.5 CENPF在細胞系SW13中的RNA干擾實驗為探索CENPF基因在ACC發(fā)生、發(fā)展中的生物學功能，本實驗構建了CENPF的表達抑制體系，應用人SW13細胞轉染siCENPF后，siCENPF組中CENPF mRNA(P<0.01，圖7A)和蛋白(P=0.001 1，圖7B、C)的表達顯著被抑制，表明CENPF表達干擾體系構建成功。CCK-8細胞分裂實驗結果顯示：與siNC組相比，抑制CENPF表達(siCENPF)的SW13細胞生長速度顯著受到抑制(P<0.01，圖8)。劃痕實驗結果顯示：與siNC相比，抑制CENPF表達(siCENPF)后，SW13細胞的遷移速度顯著受到抑制(P=0.005 3，圖9)。

圖7 CENPF在腎上腺皮質癌細胞SW13中的siRNA體系的建立：A.實時定量PCR檢測CENPF mRNA相對表達，**P<0.01；B.Western blot檢測CENPF蛋白的表達；C.蛋白表達的灰度值分析

圖8 CCK-8細胞增殖能力實驗：檢測CENPF對SW13細胞增殖的影響：**P<0.01，*P<0.05

圖9 劃痕實驗分析CENPF對SW13細胞遷移能力的影響

3 討論

ACC是一種較為少見的惡性腫瘤，文獻報道較少[9-10]。目前，外科手術、化療分別是治療早、晚期ACC的主要方式。近年大量文獻表明：WNT-β-catenin、p53-RB信號通路、錯配修復相關酶的缺陷和TERT基因表達異常，與ACC的疾病進展及預后相關[11-13]。但這些基因異常表達或信號異常調控只存在于ACC少部分患者中[10]，因此尋找ACC發(fā)生、發(fā)展的關鍵分子或靶點，對治療ACC具有重要的臨床意義。

近年越來越多的證據表明，CENPF的過度表達或激活是惡性腫瘤的常見行為，與肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多種腫瘤的惡化和預后不良密切相關。然而，CENPF在ACC患者中的表達模式和確切作用尚不清楚，其分子機制和功能也未見報道。本組通過對臨床樣本及腫瘤數(shù)據庫(GEO和GEPIA)中CENPF相關基因信息的分析，發(fā)現(xiàn)CENPF在ACC中顯著高表達，CENPF基因高表達與TNM分期呈正相關、與患者預后呈顯著負相關；表明CENPF表達可能促進ACC的疾病進展。此外，在ACC中CENPF表達與TNM分期、腫瘤復發(fā)、是否發(fā)生淋巴結轉移密切相關(P<0.001)；與患者年齡、性別、腫瘤發(fā)病部位無關(P>0.05)。CENPF表達、TNM分期與ACC患者的預后相關，且可能是ACC患者的獨立預后因素。在ACC中CENPF可能通過調控細胞的分裂、遷移，促進ACC的發(fā)生或進展。以上結果拓展了ACC的相關研究，分析CENPF與ACC發(fā)病及進展的相關性，為下一步的分子機制實驗研究提供線索與依據。本文也存在一定的局限性，由于收集樣本量較少，CENPF與ACC發(fā)病及進展的相關性、預后信息等皆以生物信息學分析為基礎，故以上結論仍需要進一步的分子實驗及臨床樣本來驗證。