胡鵬蘊(yùn)，趙宏峰，楊小偉，史保賓

肝癌是全球常見的癌癥之一，也是導(dǎo)致癌癥死亡的第二大常見原因[1]。肝細(xì)胞癌(hepatocellular caicinoma，HCC)是最常見的肝癌類型。目前，約三分之一的HCC患者發(fā)生在我國[2]。丙型肝炎病毒 (hepatitis C virus， HCV) 或乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)感染是世界范圍內(nèi)慢性肝炎、肝硬化和HCC 的主要病因[3]。至少50%HCC患者曾感染過HBV。在慢性HBV或HCV感染過程中宿主免疫反應(yīng)引起的復(fù)發(fā)性肝炎可導(dǎo)致肝纖維化和肝硬化，加速肝細(xì)胞轉(zhuǎn)換，促進(jìn)突變積累。然而，HCV和HBV感染導(dǎo)致 HCC 發(fā)展的確切機(jī)制在很大程度上仍然未知。因此，本研究旨在探討HBV或HCV感染促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的潛在機(jī)制，為闡明HBV或HCV感染導(dǎo)致 HCC 發(fā)展的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 肝癌細(xì)胞株HepG2購自深圳震科生物科技有限公司(貨號：HepG2.2.15)。肝癌細(xì)胞株Huh7購自北京綠源大德生物科技有限公司(貨號：JK-121-0162)。免疫共沉淀試劑盒購自沈陽萬類生物科技有限公司(貨號：WLA112b)。HCV和Huh-7 衍生細(xì)胞系受贈(zèng)于上海巴斯德所。HepG2-NTCP細(xì)胞株和HBV受贈(zèng)于北京生命科學(xué)研究所?？筁SM11抗體購自廣州佰匯生物科技有限公司(貨號：515210)?？功?catenin抗體購自武漢科爾普生物科技有限公司(貨號：be3365)?？笹APDH抗體購自攸碧艾(上海)貿(mào)易有限公司(貨號：UBI6010)。MTT試劑盒購自廣州珀西生物科技有限公司(貨號：M1020-500T)。TCF/LEF Reporter Kit (Wnt Signaling Pathway)和Dual Luciferase (Firefly-Renilla) assay system購自Bioscience公司(貨號：60500、60683)。Lipofectamine3000購自廣州威佳科技有限公司(貨號：L3000015)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 取肝癌細(xì)胞株HepG2和Huh7細(xì)胞，均使用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。使用HepG2-NTCP細(xì)胞轉(zhuǎn)染HBV，使用Huh-7 衍生細(xì)胞轉(zhuǎn)染HCV。

1.3 細(xì)胞增殖水平測定 取肝癌細(xì)胞，按5×103每孔播種于96孔板上。不同方式處理肝癌細(xì)胞后，使用MTT試劑盒在微孔板閱讀器570 nm上測定細(xì)胞增殖水平。

1.4 高通量測序(RNA-Seq) 取肝癌細(xì)胞，相應(yīng)處理后使用 Qiagen RNeasy Plus Micro 試劑盒進(jìn)行 RNA 提取，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，并使用 Illumina 的 TruSeq RNA Library Prep kit v2 進(jìn)行測序。使用 TopHat2 (v2.1.0) 對齊 RNA 讀數(shù)。所有對齊的讀取文件都使用 StringTie (v1.3.4) 和 Ballgown (Release 3.6) 一起運(yùn)行，以使用默認(rèn)設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)化每千堿基百萬片段(fragments per kilo base of exon per million fragments mapped，F(xiàn)PKM)值。對于差異基因表達(dá)分析，基于信噪比 [S2N =(平均歸一化 FPKM Condition1 - 平均歸一化 FPKM Condition2)/(標(biāo)準(zhǔn)偏差條件 1+標(biāo)準(zhǔn)偏差條件2)]對基因進(jìn)行預(yù)排序。然后，針對選定的感興趣基因列表分析預(yù)先排序的基因列表，以確定使用 GSEA 的條件之間差異表達(dá)的顯著性。同時(shí)進(jìn)行通路富集分析。

1.5 β-catenin活性測定 使用TCF/LEF Reporter Kit評估β-catenin活性。將肝癌細(xì)胞HepG2以2×104細(xì)胞/孔的密度在96孔板上孵育24h，然后敲低或過表達(dá)LSM11處理細(xì)胞。轉(zhuǎn)染TCF/LEF熒光素酶報(bào)告載體，隨后使用Dual luciferase (Firefly-Renilla) assay system進(jìn)行β-catenin活性的讀取和分析。

1.6 免疫印跡檢測 使用免疫共沉淀試劑盒進(jìn)行免疫共沉淀檢測。將肝癌細(xì)胞在 RIPA 裂解緩沖液中裂解并煮沸，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將膜與抗LSM11抗體、抗β-catenin抗體和抗GAPDH抗體在 4℃下孵育過夜。在TTBS 中沖洗 3 次后，與二抗在室溫下孵育1 h，然后根據(jù)制造商的說明使用化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒顯色。

2 結(jié)果

2.1 肝癌細(xì)胞增殖活性比較 在感染HBV后，肝癌細(xì)胞HepG2和Huh7增殖水平均顯著上升(P<0.05)；感染HCV后，肝癌細(xì)胞HepG2和Huh7增殖水平也均顯著上升P<0.05，表1)。

表1 肝癌細(xì)胞增殖活性(OD值，比較

2.2 LSM11能促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖 HBV或HCV感染肝癌細(xì)胞后，有多種基因轉(zhuǎn)錄水平被同時(shí)調(diào)節(jié)(圖1A)；使用siRNA敲低同時(shí)被HBV和HCV調(diào)節(jié)的基因，發(fā)現(xiàn)敲低LSM11時(shí)，肝癌細(xì)胞HepG2和Huh7增殖活性顯著降低(P<0.05，圖1B)；過表達(dá)LSM11時(shí)，肝癌細(xì)胞HepG2和Huh7增殖活性顯著上升(P<0.05，表2)。

圖1 LSM11促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖A：經(jīng)RNA-Seq檢測HBV或HCV感染細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄水平改變的基因；B：以siRNA敲低篩選影響肝癌細(xì)胞HepG2增殖水平的基因，其增殖水平是以MTT法在OD570 nm處檢測的吸光度表示

表2 敲低或過表達(dá)LSM11的肝癌細(xì)胞增殖活性(OD值，比較

2.3 LSM11調(diào)控Wnt/β-catenin通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖 為了探索LSM11調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖的潛在機(jī)制，我們敲低LSM11或過表達(dá)LSM11后進(jìn)行高通量測序并將受調(diào)控的基因進(jìn)行通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LSM11可以顯著影響Wnt/β-catenin通路的產(chǎn)物表達(dá)(圖2A和圖2B)。在敲低LSM11后，轉(zhuǎn)錄因子β-catenin活性下降(P<0.05)；過表達(dá)LSM11后，細(xì)胞β-catenin活性上升(P<0.05，表3)。此外，采用免疫共沉淀檢測發(fā)現(xiàn)LSM11與β-catenin存在相互作用(圖2C)。

圖2 LSM11調(diào)控β-catenin促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖A：以RNA-Seq敲低LSM11或過表達(dá)LSM11后，顯示基因轉(zhuǎn)錄水平改變的基因；B：經(jīng)通路富集分析敲低LSM11或過表達(dá)LSM11后受影響的信號通路；C：免疫共沉淀和免疫印跡檢測細(xì)胞LSM11和β-catenin表達(dá)

表3 敲低或過表達(dá)LSM11后肝癌細(xì)胞β-catenin活性變化

3 討論

肝癌是癌癥相關(guān)死亡的第三大原因(781631人/年)[4]。HCC占所有肝癌病例的90%，其危險(xiǎn)因素已明確，即HBV感染(占所有肝癌的54%)和/或HCV感染(占所有肝癌的31%)、肝硬化(占所有肝癌的80%)、酗酒、肥胖、血色素沉著病等遺傳疾病、黃曲霉毒素暴露、性別(男性)和年齡較大(50歲以上)。

接觸受感染的血液/體液是HBV和HCV傳播的主要方式，大多數(shù)接觸發(fā)生在分娩或生命早期[5]。與HBV或HCV單一感染相比，合并感染HBV/HCV的人HCC的發(fā)生率增加[6，7]。因此，了解HCV和HBV感染后肝癌細(xì)胞增殖水平并闡明其中的關(guān)鍵分子和分子機(jī)制，對于提供有效的癌癥治療至關(guān)重要。

在本研究中，轉(zhuǎn)染HBV或HCV后，肝癌細(xì)胞HepG2和Huh7增殖活性均顯著上升(P<0.05)。HBV/HCV的長期感染是慢性肝炎和肝硬化的主要原因，是進(jìn)展到HCC的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素[8，9]。病毒誘導(dǎo)的HCC在世界范圍內(nèi)存在。然而，在HBV誘導(dǎo)的HCC和HCV誘導(dǎo)的HCC的人群中存在相當(dāng)大的差異。HBV相關(guān)的HCC在低和中等人類發(fā)展指數(shù)國家更常見，而HCV誘導(dǎo)的HCC在高和非常高的人類發(fā)展指數(shù)國家更常見。肝炎病毒感染的地理分布具有明顯的特點(diǎn)。在西方發(fā)達(dá)地區(qū)，高流行率的HCV暴露是HCC發(fā)生的主要病因，而亞洲國家主要流行HBV[10-15]。盡管不同地區(qū)流行的病毒不一樣，但是HBV和HCV促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的共性是HCC形成的原因。

本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染HBV和HCV后細(xì)胞LSM11水平顯著上升。有研究發(fā)現(xiàn)，HBV或HCV感染宿主部分基因啟動(dòng)子的甲基化水平受到了調(diào)控[16]?；騿?dòng)子的甲基化水平與轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)，甲基化水平高的基因轉(zhuǎn)錄水平較低[17]。因此，HBV或HCV感染后，LSM11啟動(dòng)子的甲基化水平可能降低，隨后增加了其表達(dá)水平。當(dāng)敲低LSM11時(shí)，肝癌細(xì)胞HepG2和Huh7增殖水平顯著下降(P<0.05)，而當(dāng)過表達(dá)LSM11時(shí)，細(xì)胞增殖水平顯著上升(P<0.05)。LSM11是一個(gè)u7-特異性的sm樣蛋白，其N端在組蛋白RNA加工和與ZFP100結(jié)合中起著至關(guān)重要的作用[18]。目前，尚未有LSM11與腫瘤相關(guān)性的報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)LSM11可以與β-catenin相互作用，并且可以促進(jìn)β-catenin活性。Wnt/β-catenin是參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和維持的重要信號通路[19，20]。因此，本研究鑒定了一個(gè)新型促癌基因LSM11，可能是治療HCC的靶點(diǎn)。

綜上所述，轉(zhuǎn)染HBV或HCV后，肝癌細(xì)胞LSM11表達(dá)水平升高，而LSM11與Wnt/β-catenin信號通路中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子β-catenin結(jié)合并增強(qiáng)β-catenin的功能活性。