張改霞，陳海震 綜述， 黃 晶 審校

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是全球范圍的慢性肝病類型，可從單純性脂肪肝發(fā)展為酒精性脂肪性肝炎(alcohol steatohepatitis，ASH)。慢性ASH會導(dǎo)致肝臟發(fā)生纖維化并進展為肝硬化，甚至導(dǎo)致肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。其中嚴(yán)重的ASH(伴或不伴肝硬化)可導(dǎo)致酒精性肝炎(alcoholic hepatitis，AH)，這是ALD的急性臨床表現(xiàn)，與肝衰竭和高死亡率相關(guān)[1]。ALD的不同臨床轉(zhuǎn)歸可能與遺傳、免疫、飲食和腸道微生物等多種因素相關(guān)，其中腸道微生態(tài)的改變在ALD的發(fā)病機制中起著重要作用[2]。正常成人腸道中攜帶有至少1個門的細菌(約500～1000種細菌)，數(shù)量級與人體細胞數(shù)量接近，其中約99%為厭氧菌，包括雙歧桿菌、乳酸桿菌、類桿菌、真桿菌、梭菌等；其次為需氧菌及真菌，此外還有正常的病毒群、螺旋體等[3]。長期大量飲酒會導(dǎo)致腸道微生物群發(fā)生數(shù)量和質(zhì)量的改變,增加腸道炎癥和通透性，導(dǎo)致全身炎癥和組織損傷/器官病變(包括肝臟)。本文將對飲酒導(dǎo)致的腸道微生態(tài)的改變，及其對ALD的促進作用和相關(guān)生物標(biāo)志物的最新研究進展作以綜述。

1 ALD患者腸道微生態(tài)特點

1.1細菌數(shù)量與構(gòu)成的改變 長期大量飲酒會引起腸道穩(wěn)態(tài)的一系列改變，包括腸道pH、腸道動力、膽鹽、免疫防御因子、細菌的代謝產(chǎn)物、以及細菌對腸道營養(yǎng)物質(zhì)和結(jié)合位點的競爭，導(dǎo)致腸道細菌菌群和腸道屏障的改變。用聚合酶鏈法或常規(guī)培養(yǎng)技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)腸道中細菌總數(shù)大量增加，但腸道細菌的多樣性降低。對ALD患者結(jié)腸粘膜研究發(fā)現(xiàn)，細菌菌群的改變表現(xiàn)為變形桿菌增加，擬桿菌減少[4]。長期喂食酒精的小鼠糞便中乳酸桿菌降低，類桿菌門和厚壁菌門減少，革蘭陰性變形桿菌門和革蘭陽性放線菌門的比例增加，其中革蘭陰性產(chǎn)堿桿菌和革蘭陽性棒狀桿菌顯著增加。這種生物失調(diào)可能與乳桿菌、桿菌科、小球菌屬、明串珠菌和乳球菌的顯著減少有關(guān)[5,6]。長期攝入酒精也會改變回腸和肝臟的細菌多樣性，其中普雷沃氏菌不僅在回腸的粘液層中增加，也在肝臟中增加[7]，證明菌群可能從腸道向肝臟發(fā)生了轉(zhuǎn)移。另外，在酒精誘導(dǎo)的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，阿克曼氏菌的水平顯著降低，且該菌的喪失驅(qū)動了放線菌的增加和疣微菌的減少，是腸道生態(tài)失調(diào)的早期標(biāo)志[8]。通過對雙胞胎進行酒精使用障礙量表調(diào)查(alcohol use disorders identification test，AUDIT)，發(fā)現(xiàn)AUDIT評分高的受試者的腸道中羅斯伯里氏菌數(shù)量降低，影響腸道屏障功能，造成肝臟損傷[9]。嚴(yán)重的AH患者腸道以雙歧桿菌和鏈球菌數(shù)量較多和奇異菌較少為特征[10]，而酒精性肝硬化患者腸道普雷沃氏菌、腸桿菌、韋氏菌和鏈球菌等潛在危險細菌也顯著增加[11-13]。

1.2 細菌及其產(chǎn)物的移位 在腸道內(nèi)，微生物及其代謝產(chǎn)物通過門靜脈轉(zhuǎn)移到肝臟。肝臟通過向膽道和體循環(huán)釋放膽汁酸和生物活性介質(zhì)與腸道溝通。對小鼠酒精飲食喂養(yǎng)的不同階段研究發(fā)現(xiàn)，飲酒早期就出現(xiàn)了腸道通透性增加以及細菌及其產(chǎn)物移位；通過細菌在腸系膜淋巴結(jié)中定量培養(yǎng)證明， 繼續(xù)飲酒會進一步誘導(dǎo)腸道細菌過度生長[5]。經(jīng)腸道屏障和門靜脈移位的細菌或內(nèi)毒素激活肝臟巨噬細胞，誘發(fā)先天性和獲得性免疫反應(yīng)導(dǎo)致肝臟損傷，與酒精對肝臟的直接作用共同促進ALD的發(fā)展[14]。因此，來源于腸道菌群的內(nèi)毒素可以作為細菌移位的標(biāo)志物之一。腸道菌群紊亂會誘導(dǎo)對腸道屏障功能具有重要保護作用的短鏈脂肪酸和飽和長鏈脂肪酸的產(chǎn)生減少，進一步促進細菌和微生物毒素發(fā)生移位。研究證明可通過補充短鏈脂肪酸和飽和長鏈脂肪酸減輕肝臟炎癥反應(yīng)[15,16]。另外，ALD中腸-肝軸循環(huán)的膽汁酸譜也發(fā)生改變，其中結(jié)合膽汁酸和總膽汁酸濃度升高，在腸道菌群紊亂和屏障損傷中發(fā)揮重要的作用[17]。

1.3 腸道真菌的變化 健康人體腸道真菌菌落主要由酵母菌、馬拉色菌和念珠菌組成。對ALD患者的腸道真菌菌群研究顯示，真菌多樣性和豐富度降低，其中，腐質(zhì)霉屬、鐮孢屬、曲霉屬相對增加，而念珠菌屬相對降低，主要表現(xiàn)為近平滑念珠菌降低，而白色念珠菌增加[18,19]。研究發(fā)現(xiàn)長期飲酒會導(dǎo)致腸道真菌菌群及β-葡聚糖向全身循環(huán)轉(zhuǎn)運，在骨髓嵌合體小鼠模型中發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖可通過C型凝集素樣受體CLEC7A誘導(dǎo)Kupffer細胞和其他可能來自骨髓的細胞發(fā)生炎癥，引起IL-1β表達分泌增加導(dǎo)致肝細胞損傷，進一步促進酒精誘導(dǎo)的肝病的發(fā)展[19]。另一方面，增加的白色念珠菌可以分泌一種細胞溶解肽外毒素-念珠菌溶素，可以直接損傷上皮細胞和粘膜，也可以通過c-Fos和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路誘導(dǎo)炎性細胞因子的產(chǎn)生。在乙醇喂養(yǎng)的小鼠中證明念珠菌溶素不引起明顯的腸道破壞，主要是通過腸上皮細胞間隙進入肝臟，以計量依賴方式損傷肝細胞[18]。

1.4 腸道病毒的改變 人類腸道病毒是每個人特有的，主要包含噬菌體。研究發(fā)現(xiàn)在ALD患者中腸道病毒多樣性增加，與細菌多樣性呈負相關(guān)，但許多噬菌體與其宿主細菌總量呈正相關(guān)[20]，與其他疾病中的變化一致[21]。AH患者的病毒變化最為顯著，其中，乳球菌噬菌體和類桿菌噬菌體的數(shù)量降低，而乳桿菌噬菌體、大腸桿菌噬菌體、腸桿菌噬菌體和腸球菌噬菌體以及細小病毒科和皰疹病毒科的數(shù)量增加。并且特定的病毒分類，如：葡萄球菌噬菌體和皰疹科病毒，與疾病嚴(yán)重程度及90天死亡率相關(guān)[20]。腸道病毒可以通過引起宿主免疫反應(yīng)直接影響宿主，也可以作為哺乳動物病毒的來源，改變細菌微生物組成從而影響疾病。

2 腸道微生態(tài)改變在ALD發(fā)病機制中的作用

2.1 腸道屏障破壞和腸道通透性增加 完整的腸道屏障是腸肝軸相互作用的重要組成部分，由幾個物理和免疫層組成[22]。上層是粘液層，由腸杯狀細胞合成和分泌的粘蛋白組成，主要為粘蛋白2(mucoprotein 2，Muc2)，具有預(yù)防機械、化學(xué)和生物攻擊的作用，有助于維持腸道平衡[23]。長期飲酒會導(dǎo)致粘液層增厚，同時會抑制抗菌凝集素再生胰島衍生3β(regenerating islet‐derived 3 beta，Reg3b)和再生胰島衍生3γ(regenerating islet‐derived 3 gamma，Reg3g) 的表達，導(dǎo)致腸道細菌過度生長、腸道微生物組成改變，促進ASH發(fā)生。實驗證明Muc2缺陷型小鼠可以促進Reg3b和Reg3g的產(chǎn)生，可以降低ASH的發(fā)生[24]。中層為上皮細胞層，相鄰細胞之間通過頂端連接蛋白(包括claudins、occludins、JAMs和E-cadherins)緊密結(jié)合。酒精及其代謝物可以通過作用于緊密連接的復(fù)合物，引起通透性增加。例如：代謝產(chǎn)物乙醛誘導(dǎo)Caco-2單層細胞旁通透性增加[25]，乙醇誘導(dǎo)的CYP2E1通過硝基氧化應(yīng)激的方式增加腸道Caco-2細胞和大腸的通透性，在腸道滲漏和內(nèi)毒素血癥中起著核心作用[26]。下層為固有層，其常駐細胞群體為天然免疫細胞和獲得性免疫細胞。慢性ALD動物模型證明長期飲酒會誘導(dǎo)固有層炎癥細胞包括單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子α，與腸上皮細胞上的TNF受體I通過激活肌球蛋白輕鏈激酶而部分介導(dǎo)緊密連接破壞[27]。

2.2 腸道菌群移位加速ALD的進展 在腸道中，酒精誘導(dǎo)的生物失調(diào)和細菌移位導(dǎo)致病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)的積累[28]。PAMPs通過門靜脈進入肝臟，激活先天性和獲得性免疫反應(yīng)。PAMPs，如脂多糖、肽聚糖和病毒RNA等可以與Kupffer細胞和肝星狀細胞上的模式識別受體結(jié)合誘導(dǎo)局部炎癥。主要通過肝臟免疫細胞Toll樣受體-4(Toll-like receptor4，TLR4)和TLR2識別PAMPs，TLR信號進一步激活下游促炎級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致MyD88介導(dǎo)的NF-κB激活，促進肝臟炎癥反應(yīng)。另外，飲酒導(dǎo)致的微生物及其產(chǎn)物發(fā)生移位進入肝臟并與Kupffer細胞上的TLR4結(jié)合，促進miR-155的表達，增加炎癥反應(yīng)并加速纖維化進展。在miR-155基因敲除小鼠模型中，缺乏miR-155可以減緩慢性酒精誘導(dǎo)的肝臟炎癥反應(yīng)和纖維化[29]。同時，TLR4信號還通過下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的受體激活肝星狀細胞，促進肝纖維化。這些損傷過程都會誘導(dǎo)炎性細胞因子的表達，氧化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進一步增加肝損傷。此外，PAMPs除了通過門靜脈入肝引起肝臟炎癥，也可以通過體循環(huán)引起全身性炎癥反應(yīng)，增加患者不良預(yù)后和死亡風(fēng)險。

3 ALD誘導(dǎo)腸道微生態(tài)改變的相關(guān)生物標(biāo)志物

目前，激素仍然是ALD的主要治療方案，但療效非常有限，且易發(fā)生機會性感染。對于終末期ALD患者，肝臟移植的機會非常渺茫，短期死亡率非常高。因此，通過對ALD與腸道微生態(tài)之間的相互作用機制的不斷研究，發(fā)現(xiàn)腸道微生態(tài)相關(guān)的ALD生物標(biāo)志物，有助于早期對ALD進行評估，早期進行治療。

3.1 缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF) HIF在缺氧、脂多糖存在等環(huán)境中參與抗炎或組織保護信號通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。研究顯示，腸道HIF-1α對于酒精引起的腸道菌群變化、腸屏障功能損傷、內(nèi)毒素血癥和肝脂肪變性至關(guān)重要[30]。腸上皮特異性HIF-1α敲除(IEhif-1α-/-)小鼠表現(xiàn)出厚壁菌/類桿菌比率顯著降低，阿克曼氏菌豐度增加和乳桿菌水平顯著的降低。許多屏障保護基因受HIF-1α的缺失而影響表達，導(dǎo)致腸上皮通透性增加。研究發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳桿菌有益于預(yù)防、治療小鼠ALD，但當(dāng)腸道中缺失HIF-1α?xí)r，其作用就會減弱[31]。HIF-1α在線粒體中也發(fā)揮重要作用，以應(yīng)對各種因素引起的氧化應(yīng)激，可能對酒精引起的肝臟氧化應(yīng)激起保護作用[32]。因此，HIF-1α可以通過多種途徑保護腸道和肝臟，并作為ALD的治療靶點。

3.2 溶細胞素 溶細胞素是由糞腸球菌產(chǎn)生的一種細菌外毒素。實驗證明在AH患者糞便中，糞腸球菌的數(shù)量增加，溶細胞素陽性的糞腸球菌的存在與AH的嚴(yán)重程度和死亡率有關(guān)[33]。酗酒會降低巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶2(fucosyltransferase 2 ，F(xiàn)ut2)介導(dǎo)的腸道α-1-2-巖藻糖基化，而腸內(nèi)α-1-2-巖藻糖基化的缺失會促進溶細胞素陽性糞腸球菌在腸道生長繁殖[34]。溶細胞素的作用不僅對革蘭氏陽性細菌有裂解活性，而且可能通過形成孔隙對真核細胞也有裂解活性。據(jù)統(tǒng)計，在溶細胞素陽性的AH患者中，89%的患者在入院后180天內(nèi)發(fā)生死亡，而溶細胞素陰性的患者只有3.8%死亡，表明溶細胞素是AH患者死亡的預(yù)測因子[35]。另外，研究發(fā)現(xiàn)糞腸球菌噬菌體可顯著降低肝臟中的溶細胞素水平以及糞便中糞腸球菌的數(shù)量[33]。因此，F(xiàn)ut2及糞腸球菌噬菌體將是治療ALD 的重要靶點。

3.3 其他標(biāo)志物 腸道上皮細胞層中的兩種抗微生物劑，Reg3b和Reg3g可以修復(fù)腸道屏障的損傷，減少細菌移位和肝臟的損傷[35]。Reg3b和Reg3g的產(chǎn)生受白細胞介素22(interleukin 22，IL-22)的調(diào)節(jié)。而在ALD中，IL-22產(chǎn)生減少是由于酒精誘導(dǎo)和腸道中吲哚-3-乙酸( indole-3-acetic acid，IAA)水平降低的結(jié)果。IAA是由具有色氨酸酶活性的腸道細菌代謝色氨酸產(chǎn)生的產(chǎn)物，為微生物群衍生的芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor ，AHR)配體，該配體通路調(diào)節(jié)IL-22的表達。然而，直接補充IL-22可能誘發(fā)腫瘤的產(chǎn)生，通過研究發(fā)現(xiàn)工程改造產(chǎn)生IL-22的羅伊氏乳桿菌可減少脂肪性肝炎和細菌向肝臟的移位[36]。另外，還可以補充IAA，或以腸道微生物作為靶點改善AHR通路，如補充益生菌、AHR配體產(chǎn)生菌或藥理性AHR配體，為ALD的治療帶來新的希望[37]。

血清中抗釀酒酵母IgG抗體(anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies, ASCA)可以作為機體對真菌或其產(chǎn)物的免疫反應(yīng)指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，AH患者血清ASCA水平明顯高于對照組，證明真菌及其產(chǎn)物通過腸道屏障發(fā)生移位，并且機體對真菌的免疫反應(yīng)增強。單變量分析發(fā)現(xiàn)，ASCA水平與肝纖維化分期成正相關(guān)。此外，血清ASCA的升高與AH患者的死亡率也相關(guān)[38]。因此，腸道真菌可作為ALD的治療靶點，ASCA可用于預(yù)測AH患者的預(yù)后。

4 結(jié)論與展望

近年來，腸道微生態(tài)相關(guān)研究已經(jīng)成為許多慢性疾病的研究熱點。通過微生物制劑對腸道微生態(tài)環(huán)境進行修復(fù)與改善，保護并增強腸道屏障，進而減少器官損傷和炎癥反應(yīng)。因此，腸道微生態(tài)成為治療慢性肝臟疾病的最新靶點，如酒精性肝病，非酒精性脂肪性肝病和病毒性肝炎等。但是，由于對腸道菌群的認識和檢測方法的限制，目前對腸道菌群的改變以及機制的研究尚未明確。并且由于研究對象、檢測區(qū)域、檢測標(biāo)本的不同，結(jié)果可能具有差異性。因此，未來需要繼續(xù)深入研究腸道微生物在ALD中的改變，探索與ALD進展相關(guān)的特異性微生物，同時尋求ALD特異的腸道微生態(tài)相關(guān)標(biāo)志物并通過腸-肝軸治療ALD。