豐東升 王 霞 李雪穎 馬穎清 王 敏 方絲蕓 韓奕奕 張維誼

（上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，上海 201708）

葡萄是我國重要的果樹樹種之一。我國是目前全球第二大葡萄生產(chǎn)國，是第一大鮮食葡萄生產(chǎn)國。據(jù)國家統(tǒng)計(jì)局?jǐn)?shù)據(jù)，2020年，我國葡萄產(chǎn)量為1 431萬t，同比增長0.8%[1～2]。然而葡萄從新芽萌發(fā)到果實(shí)采收階段的病蟲害防治一直是一個(gè)難題，其主要的病蟲害有霜霉病、白粉病、灰霉病、炭疽病、白腐病、枝干病害等。通過對中國農(nóng)藥信息網(wǎng)的農(nóng)藥登記數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，截至2022年7月1日，我國葡萄生產(chǎn)上登記的農(nóng)藥產(chǎn)品共832種，包括殺菌劑、殺蟲劑和植物生長調(diào)節(jié)劑等[3～5]。因此，建立葡萄中農(nóng)藥殘留的非靶向快速篩查分析方法十分必要。高分辨質(zhì)譜是目前用來篩查食品基質(zhì)中污染物的主流分析手段[6～10]。高分辨率氣相色譜－四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜（GC－Q－TOF/MS）[11～17]系統(tǒng)的一項(xiàng)優(yōu)勢是能夠在一次運(yùn)行中篩查幾乎無限多的化合物，且靈敏度不受影響。本研究對GC－Q－TOF/MS在定性篩查過程中影響相對較大的儀器運(yùn)行、篩查、定量等條件進(jìn)行優(yōu)化確定，以葡萄為研究對象，探討建立75種農(nóng)藥的高通量篩查方法。

一、材料與方法

（一）儀器Agilent 7890B氣相色譜－7200B四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；冷凍離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Milli－Q超純水儀（美國Millipore公司）。

（二）試劑和材料乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司）；水為超純水；無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉和檸檬酸氫二鈉（分析純，德國Merck公司）；75種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為100 μg/mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%，天津阿爾塔科技有限公司），于－18℃冷凍避光保存?zhèn)溆茫灰徊椒焖偾疤幚硇≈⊿HIMSEN QPet－GE+，日本島津公司）；0.22 μm有機(jī)相濾膜（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；葡萄樣品購自上海農(nóng)貿(mào)市場。

（三）樣品前處理方法

1.提取。準(zhǔn)確稱取葡萄樣品10 g（精確到0.01 g）于50 mL塑料離心管中，準(zhǔn)確加入乙腈20 mL，高速渦旋混勻，超聲20 min。然后加入硫酸鎂4 g、氯化鈉1 g、檸檬酸鈉1 g、檸檬酸氫二鈉0.5 g，蓋上蓋子，劇烈振搖約30 s，以100 kHz超聲30 min，完畢后取出，以8 000 r/min離心5 min。

2.凈化。用SHIMSEN QPet－GE+一步法快速前處理小柱處理后，取離心后上清液3 mL過0.22 μm有機(jī)相濾膜，待測。

（四）基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制將本底中不含有目標(biāo)化合物的空白葡萄樣品按照前處理方法制得空白基質(zhì)溶液。將10 μg/mL 75種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)工作液用空白基質(zhì)溶液進(jìn)行稀釋，得到質(zhì)量濃度為0.04、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 μg/mL的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

（五）儀器運(yùn)行條件

1.氣相色譜條件。色譜柱為5%－苯基－甲基聚硅氧烷毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。升溫程序?yàn)?0℃保持1 min后以40℃/min升溫至120℃，再以5℃/min升溫至310℃。載氣為氦氣（純度≥99.999%），流速為0.717 mL/min；進(jìn)樣口溫度為280℃；進(jìn)樣量為2.0 μL；進(jìn)樣方式為脈沖不分流。

2.質(zhì)譜條件。電離源為電子轟擊源，能量為70 eV；離子源溫度為280℃；傳輸線溫度為280℃；溶劑延遲時(shí)間為4 min；離子監(jiān)測模式為全掃描模式；掃描范圍為50～500m/z；掃描速率為5 Hz。

二、結(jié)果與分析

（一）提取劑的比較本研究采用添加回收方式，分別考察了丙酮和乙腈作為提取劑對目標(biāo)化合物的提取效果。結(jié)果表明，加標(biāo)水平為0.30 mg/kg時(shí)，乙腈作為提取劑，目標(biāo)化合物的回收率優(yōu)于丙酮。這主要是由于葡萄含水量較高，丙酮更易發(fā)生乳化反應(yīng)，且更易提取色素；采用乙腈提取時(shí)，加入的無水硫酸鎂、氯化鈉等無機(jī)鹽能夠很好地起到鹽析作用，液液分離效果好。

（二）儀器運(yùn)行條件的選擇

1.氣相色譜升溫程序的選擇。本研究考察了兩種升溫程序（見表1和表2）運(yùn)行0.05 μg/mL 75種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的分析結(jié)果。發(fā)現(xiàn)運(yùn)行相同農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用表1的升溫程序時(shí)，含有同分異構(gòu)體的農(nóng)藥化合物色譜峰重疊，且峰型不好；采用表2的升溫程序時(shí)，農(nóng)藥化合物色譜峰之間完全分離，分離效果優(yōu)于前者。因此，本研究確定采用表2的升溫程序。

表1 總運(yùn)行時(shí)間為20.75 min的升溫程序

表2 總運(yùn)行時(shí)間為40.5 min的升溫程序

2.質(zhì)譜采集條件的選擇。本研究考察了2 GHz低分辨率和4 GHz高分辨率兩種采集模式運(yùn)行0.05 μg/mL 75種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的分析結(jié)果，兩種模式下的總離子流圖分別見圖1和圖2。發(fā)現(xiàn)運(yùn)行相同農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 GHz高分辨率采集模式精確度高，但運(yùn)行高濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜圖易飽和，且靈敏度低于2 GHz低分辨率采集模式。因此，本研究確定采用2 GHz低分辨率采集模式。

圖1 2 GHz模式下的總離子流圖

圖2 4 GHz模式下的總離子流圖

（三）篩查條件的優(yōu)化篩查方法需要經(jīng)過優(yōu)化以減少假陽性和假陰性結(jié)果的數(shù)量，可優(yōu)化的參數(shù)包括保留時(shí)間（RT）窗口、質(zhì)量數(shù)準(zhǔn)確度、提取離子流色譜圖（EIC）共流出得分和譜庫匹配得分等。一般情況下將質(zhì)量數(shù)準(zhǔn)確度設(shè)定為5 mg/kg，將RT窗口設(shè)定為0.1 min。RT鎖定與反吹可提供良好的RT精密度和重現(xiàn)性，有助于減少假陽性結(jié)果。譜庫匹配得分根據(jù)實(shí)際樣品情況進(jìn)行調(diào)節(jié)設(shè)定，能更好地消除假陽性和假陰性結(jié)果。

本研究使用目標(biāo)疑似物篩查工作流程和農(nóng)藥化合物數(shù)據(jù)庫，結(jié)合保留時(shí)間差值（ΔRT）、EIC共流出得分和質(zhì)量數(shù)準(zhǔn)確度，對復(fù)雜食品基質(zhì)中的農(nóng)藥化合物進(jìn)行疑似篩查。每種農(nóng)藥化合物自動提取最多7個(gè)離子，要求其中至少兩個(gè)離子滿足信噪比≥3及EIC共流出得分≥50的條件。若保留時(shí)間差值在±0.15 min范圍內(nèi)的化合物符合上述要求，則視為得到鑒定。本研究將EIC共流出得分由≥70降低至≥50，增加了匹配不易打碎化合物的概率。設(shè)置EIC峰過濾器，將絕對峰高≥50提升至≥1 000，以排除基質(zhì)雜峰。在此模式下篩查0.05 μg/mL 75種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果顯示農(nóng)藥化合物可全部檢出，主要判斷依據(jù)見表3。

（四）定量條件的建立本研究根據(jù)75種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液建立定量處理方法，對樣品中篩查出的農(nóng)藥進(jìn)行準(zhǔn)確定量。配制0.05、0.1、0.5 μg/mL的75種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)合NIST數(shù)據(jù)庫和PCDL數(shù)據(jù)庫提供的化合物特征離子，從標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)譜圖中挑選出4個(gè)合適的特征離子，特征離子1作為定量離子，特征離子2、3、4作為定性離子（見表3）。

表3 75種農(nóng)藥化合物篩查結(jié)果及定量條件

（五）方法學(xué)考察

1.標(biāo)準(zhǔn)工作曲線和線性范圍。利用上述優(yōu)化好的條件，取不同質(zhì)量濃度的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行氣相色譜－四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測，以農(nóng)藥化合物的峰面積（y）為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)作圖，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出相應(yīng)的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)（R2），結(jié)果見表4。由結(jié)果可知，在0.04～2.00 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，75種農(nóng)藥化合物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.99。

續(xù)表3

表4 75種農(nóng)藥化合物在葡萄基質(zhì)中的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）

續(xù)表4

2.回收率和精密度。利用上文確定的樣品前處理和儀器條件，稱取空白葡萄樣品后分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以0.3、0.6、1.5 mg/kg 3個(gè)濃度水平進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加水平均做6次平行測定，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，75種農(nóng)藥化合物的回收率為60.9%～104.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.2%～26.3%。

3.檢出限和定量限。依據(jù)GB/T 27417－2017《合格評定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》[18]中信噪比（S/N）法確定方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ），以S/N＝3計(jì)算方法LOD，以3倍LOD作為方法LOQ。經(jīng)計(jì)算，最終確定75種農(nóng)藥目標(biāo)化合物的檢出限為0.08 mg/kg，定量限為0.24 mg/kg。

（六）實(shí)際樣品的檢測采用建立的方法對市售的210批次葡萄樣品進(jìn)行檢測，檢出農(nóng)藥殘留為腐霉利、氟唑菌酰胺，其余未檢出。其中，4批次葡萄樣品檢出腐霉利，檢出率為1.9%，殘留值在0.24～0.43 mg/kg范圍內(nèi)；2批次葡萄樣品檢出氟唑菌酰胺，檢出率為1.0%，殘留值在0.32～0.58 mg/kg范圍內(nèi)，農(nóng)藥殘留檢測結(jié)果均符合GB 2763－2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[19]的限量要求。同時(shí)，在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)化合物進(jìn)行盲樣測試，回收率＞60%，檢測結(jié)果符合方法學(xué)要求，說明該方法適用于葡萄中農(nóng)藥多殘留非靶向快速篩查。

三、結(jié)論

本文建立了基于GC－Q－TOF/MS的葡萄中農(nóng)藥多殘留非靶向快速篩查方法，通過優(yōu)化篩選條件，確定了定性篩查數(shù)據(jù)處理的最佳參數(shù)，降低了篩查出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果的概率。該方法快捷有效、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于葡萄中農(nóng)藥多殘留快速篩查與測定。同時(shí)從方法本身來說，有一定的拓展性，針對數(shù)據(jù)庫的后續(xù)擴(kuò)展能夠覆蓋更多化合物以及面向更多種類基質(zhì)。