孫靜 閔婕 單宇鵬 雷鴿 張峰

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，陜西 西安 710000)

統(tǒng)計(jì)顯示，每年新發(fā)胃癌和死于胃癌的患者分別約為100萬例和80萬例，占所有惡性腫瘤的5.7%和8.2%，發(fā)病率和死亡率均分別排名第六和第二[1]。但目前，胃癌發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制則仍不清楚。在腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)過程中，會發(fā)現(xiàn)一些帶有內(nèi)部空泡和多個(gè)細(xì)胞核的大細(xì)胞，即一個(gè)細(xì)胞在另一個(gè)細(xì)胞內(nèi)的情況，被稱為“cell-in-cell”結(jié)構(gòu)[2-3]。免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的“cell-in-cell”結(jié)構(gòu)會提高腫瘤的惡性程度[4-5]，一項(xiàng)臨床研究顯示“cell-in-cell”結(jié)構(gòu)與口腔舌癌的侵襲性特征和癌癥相關(guān)死亡率有關(guān)[6]。然而，關(guān)于“cell-in-cell”結(jié)構(gòu)對胃癌的影響則仍不清楚，至今也鮮有研究報(bào)道。為此，本文就胃癌腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞“cell-in-cell”對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響進(jìn)行研究，以期為胃癌的診斷和治療提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細(xì)胞BGC823(ATCC，美國)；96孔、24孔組織培養(yǎng)板(康寧公司，美國)；RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司，美國)；BALB/c小鼠[SPF級，雄性，6～8周齡(20±2) g，浙江醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心， SYXK(浙)2021-0017)]；免疫磁珠(Invitrogen公司，美國)；吉姆薩試劑(碧云天公司，中國)；凋亡試劑盒(Annexin V-FITC和PI)(耶森公司，中國)；流式細(xì)胞儀(Becton公司，美國)；基質(zhì)膠和Transwell裝置(Corning公司，美國)。本次動物實(shí)驗(yàn)符合3R原則，并且實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院動物倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 小鼠免疫細(xì)胞的分離 小鼠頸脫臼處死，在無菌的環(huán)境下收集得到脾臟中細(xì)胞懸液，通過密度梯度離心法分離單核淋巴細(xì)胞(PBMC)，使用免疫磁珠傳話PBMC。PBMC培養(yǎng)在RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基含有10%的胎牛血清，將細(xì)胞在5%CO2培養(yǎng)箱中于37°C和95%濕度下培養(yǎng)。

1.3 胃癌細(xì)胞培養(yǎng)和“cell-in-cell”模型的建立 人胃癌細(xì)胞BGC823培養(yǎng)在DMEM完全基中，培養(yǎng)基含有10%的胎牛血清、0.1 mg / mL的鏈霉素和100 U/mL的青霉素。將細(xì)胞在5%CO2培養(yǎng)箱中于37°C和95%濕度下培養(yǎng)。根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]構(gòu)建腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞的“cell-in-cell”模型。按照靶效比1∶1和5∶1加入已標(biāo)記的胃癌細(xì)胞分別為1∶1組和5∶1組，分別接種到24 孔板中，每孔細(xì)胞總數(shù)為5×104個(gè)。在上述條件下孵育6 h。然后BGC823細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)作為對照。

1.4 檢測方法

1.4.1 “cell-in-cell”構(gòu)建率 培養(yǎng)后細(xì)胞加入2.5%的戊二醛在4℃固定20 min，然后加入10%的吉姆薩試劑1在室溫下染色1 min；洗滌后加入10%的吉姆薩試劑2室溫下染色10 min。顯微鏡下觀察，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，“cell-in-cell”構(gòu)建率=(“cell-in-cell”細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100%。

1.4.2 CCK-8檢測細(xì)胞增殖活力 將100 μL的細(xì)胞懸浮液添加到96孔板的孔中，孵育24 h、48 h和72 h后，將體積為10 μL的CCK-8溶液添加到每個(gè)孔中并孵育2 h。在450 nm波長下，用酶標(biāo)儀檢測每個(gè)孔的光密度(OD)值。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞用1×PBS洗滌并懸浮在100 μL結(jié)合緩沖液中。加入5 μL的Annexin V-FITC和10 μL的PI(中國上海耶森)，在室溫下于黑暗中孵育10～15 min。最后，將400 μL的結(jié)合緩沖液添加到樣品中，并在1 h內(nèi)通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.4.4 Transwell檢測侵襲 將基質(zhì)膠(1∶8稀釋)加入Transwell裝置的上室并在 37℃下孵育 30 min。將 600 μL完全培養(yǎng)基填充到 24 孔板-Transwell 裝置的下室。將細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng) 24 h進(jìn)行饑餓處理。消化后，向水合的 Transwell 上室中加入 100 μL 細(xì)胞溶液(5×105個(gè)細(xì)胞/mL)。24 h后，洗去未侵入的細(xì)胞。滲入下室的細(xì)胞用95%乙醇固定，0.1%結(jié)晶紫室溫染色20 min。在×400倍視野中的5個(gè)隨機(jī)視野中計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞與免疫細(xì)胞“cell-in-cell”形成情況 深紫紅色為細(xì)胞核，淺紫色為細(xì)胞質(zhì)，黃色箭頭為形成的“cell-in-cell”結(jié)構(gòu)，見圖1。1∶1組的“cell-in-cell”構(gòu)建率為(8.65±1.06)%，5：1組的“cell-in-cell”構(gòu)建率為(12.92±1.32)%，顯著高于1∶1組(P<0.05)。

圖1 胃癌細(xì)胞與免疫細(xì)胞“cell-in-cell”形成情況(400×)Figure 1 Gastric cancer cell and immune cell "cell-in-cell" formation

2.2 “cell-in-cell”形成對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響 3組細(xì)胞的增殖能力比較差異顯著(P<0.05)。1∶1組的增殖能力顯著高于對照組(P<0.05)，5∶1組的增殖能力顯著高于1∶1組和對照組(P<0.05)。見表1。

表1 “cell-in-cell”形成對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響Table 1 The effect of "cell-in-cell" formation on the proliferation of gastric cancer cells

2.3 “cell-in-cell”形成對胃癌細(xì)胞凋亡的影響 3組細(xì)胞的凋亡率比較差異顯著(P<0.05)。1∶1組的凋亡率(4.06±0.45)%顯著低于對照組(6.27±0.58)%(P<0.05)，5∶1組的凋亡率(2.95±0.34)%顯著低于1∶1組和對照組(P<0.05)。見圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測“cell-in-cell”形成對胃癌細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 Flow cytometry detects the influence of "cell-in-cell" formation on the apoptosis of gastric cancer cells

2.4 “cell-in-cell”形成對胃癌細(xì)胞侵襲的影響 3組細(xì)胞的侵襲能力比較差異顯著(P<0.05)。1：1組的侵襲能力顯著高于對照組(P<0.05)，5∶1組的侵襲能力顯著高于1∶1組和對照組(P<0.05)。圖3、表2。

圖3 Transwell檢測“cell-in-cell”形成對胃癌細(xì)胞侵襲的影響Figure 3 Transwell detects the influence of "cell-in-cell" formation on gastric cancer cell invasion

表2 “cell-in-cell”形成對胃癌細(xì)胞侵襲的影響(個(gè)，Table 2 The influence of "cell-in-cell" formation on the invasion of gastric cancer cells

3 討論

胃癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，大部分患者在確診時(shí)已處于中晚期，這使得死亡率大幅升高[8-10]。胃癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致治療失敗的主要原因[11-13]，尋找胃癌細(xì)胞增殖和侵襲的機(jī)制具有重要的臨床意義。

研究顯示免疫抑制在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中起著重要的作用，一方面，腫瘤細(xì)胞表面會產(chǎn)生包括PD-L1等免疫抑制的蛋白，并直接與免疫細(xì)胞表面的受體結(jié)合導(dǎo)致免疫細(xì)胞的功能抑制或者凋亡[14-17]；另一方面，腫瘤細(xì)胞也會分泌免疫抑制因子，從而來降低機(jī)體的識別和清除腫瘤細(xì)胞的能力[18-20]。免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的“cell-in-cell”結(jié)構(gòu)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞現(xiàn)象，即一個(gè)活細(xì)胞侵入另一個(gè)活細(xì)胞[21-22]。近年來研究顯示，免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞也可形成“cell-in-cell”結(jié)構(gòu)，并且與腫瘤免疫相關(guān)，如Wang等[23]的研究顯示結(jié)腸癌細(xì)胞可以內(nèi)化淋巴細(xì)胞，并且這種免疫細(xì)胞與結(jié)腸癌細(xì)胞形成的“cell-in-cell”結(jié)構(gòu)有助于逃避宿主免疫防御。也有研究顯示在乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)了“cell-in-cell”結(jié)構(gòu)，并且臨床研究結(jié)果顯示“cell-in-cell”結(jié)構(gòu)的增多與乳腺癌患者不良預(yù)后有關(guān)[24]。為分析胃癌細(xì)胞與免疫細(xì)胞是否可以形成“cell-in-cell”結(jié)構(gòu)，本研究從小鼠脾臟中收集了PBMC，并分別按照PBMC：胃癌細(xì)胞比例為1∶1和5∶1的比例混合接種，通過顯微鏡觀察，可清晰的觀察到細(xì)胞的內(nèi)化結(jié)果，其中5∶1組的“cell-in-cell”構(gòu)建率顯著高于1∶1組。本次研究成功的構(gòu)建了胃癌細(xì)胞與免疫細(xì)胞的“cell-in-cell”模型。

為在細(xì)胞水平上分析“cell-in-cell”對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，本研究分別檢測了各組細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲情況。結(jié)果顯示“cell-in-cell”的形成能夠顯著的促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，并且抑制凋亡。此外，隨著“cell-in-cell”比例的升高，細(xì)胞的增殖和侵襲能力被進(jìn)一步促進(jìn)，且凋亡率也被進(jìn)一步抑制。研究顯示“cell-in-cell”的形成能夠促進(jìn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖并抑制凋亡[25]。Miyatake等[26]的研究也顯示“cell-in-cell”的形成會促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)合過往文獻(xiàn)報(bào)道和本次研究結(jié)果，提示免疫細(xì)胞與胃癌細(xì)胞形成的“cell-in-cell”會促進(jìn)胃癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并抑制凋亡。

然而，本研究也存在不足之處，首先，關(guān)于“cell-in-cell”結(jié)構(gòu)對胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為的而影響和對機(jī)體免疫的影響仍需要體內(nèi)研究證實(shí)?！癱ell-in-cell”結(jié)構(gòu)在胃癌組織中的形成情況、與臨床病理數(shù)據(jù)的關(guān)系和與患者預(yù)后的關(guān)系則仍需要進(jìn)一步的臨床研究。此外，“cell-in-cell”形成的分子機(jī)制和調(diào)控胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制也值得深入研究。

4 結(jié)論

胃癌細(xì)胞與免疫細(xì)胞形成的“cell-in-cell”結(jié)構(gòu)不但會提高胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，還會顯著抑制細(xì)胞凋亡。此外，PBMC的比例升高會提高“cell-in-cell”的形成率，并更顯著地促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究揭示了一種胃癌進(jìn)展的新機(jī)制，提示cell-in-cell”可能成為診斷和治療胃癌的新方向。