張麗榮，阮可悅，童 武，李國新，高 飛，單同領(lǐng)，于 海，童光志，鄭 浩

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

偽狂犬?。≒seudorabies, PR)，又稱Aujeszky's病，是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）引起豬、牛、羊等多種家畜和野生動物以發(fā)熱、奇癢（豬除外）以及腦脊髓炎為主要癥狀的一種急性傳染病[1]。豬是該病的主要傳染源以及自然貯存宿主[2]。豬感染偽狂犬病后常引起初生仔豬發(fā)病，死亡率100%[3]；育肥豬生長緩慢甚至成為僵豬；種豬喪失種用價值；妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或木乃伊胎[4-5]。與其他皰疹病毒一樣，偽狂病病毒具有長期潛伏感染、終生帶毒的特征。

PRV的增殖是遵循嚴(yán)格的時序方式進(jìn)行的。Ben-Porat等根據(jù)PRV DNA轉(zhuǎn)錄和表達(dá)時間的先后順序?qū)⒒蚍譃榱⒓丛缙诨颍╥mmediate early gene,IE)，早期基因（early gene, E）和晚期基因（late gene, L)，并以級聯(lián)方式進(jìn)行調(diào)控[6]。PRV只有一個立即早期基因，即IE180[7]。早期基因有EP0基因、TK基因以及UL54基因。其中EP0基因位于UL區(qū)，其轉(zhuǎn)錄方向與潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄體（large latency transcripts,LLT）方向相反，與立即早期基因IE180彼此相鄰且轉(zhuǎn)錄方向一致。由于EP0基因與反轉(zhuǎn)錄的LLT大部分重疊，缺失LLT基因的同時難以避免缺失一部分的EP0序列，從而影響EP0的表達(dá)[8]。

EP0轉(zhuǎn)錄的mRNA約為1.75 kb，分子量為45 kDa左右，可編碼1230個核苷酸（編碼410個氨基酸）的開放閱讀框[9]。EP0基因是PRV的早期基因，而與之相對應(yīng)HSV-1的ICP0早期基因則為極早期基因，但EP0具有ICP0蛋白相應(yīng)功能。ICP0蛋白分子是HSV-1病毒極早期基因、早期基因以及晚期基因的反式激活因子，其鋅指結(jié)構(gòu)為反式激活動能所必需。有研究表明：EP0基因?qū)τ赑RV的復(fù)制是非必需的，但是EP0作為病毒基因啟動子的反式激活物，對于潛伏感染的激活是必要的[10-11]。在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，EP0可以激活基于TATA框啟動子的轉(zhuǎn)錄起始[12]。在體內(nèi)，EP0可以激活多種PRV編碼基因的啟動子，如IE180、UL23（胸苷激酶）和US4（gG）等[13]。

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于很多病毒的檢測，不僅可以對檢測的序列進(jìn)行定性分析，而且可以對其進(jìn)行準(zhǔn)確定量，與常規(guī)PCR技術(shù)相比具有更高的敏感性、特異性和更好的重復(fù)性，以及快速和污染幾率低等優(yōu)點(diǎn)[14]。本實(shí)驗室采用SYBR GreenI建立了一種PRV EP0基因的實(shí)時熒光定量檢測方法，以期為EP0基因的定量分析提供一種簡便快速、經(jīng)濟(jì)和靈敏的檢測方法，同時也為PRV潛伏感染時病毒表達(dá)的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒 偽狂犬病病毒變異株JS-2012株為實(shí)驗室分離鑒定并保存[15]。LLT單個啟動子缺失病毒JSL1R1[16]、雙啟動子缺失病毒JS-L1R3和JS-UL1R3均由本實(shí)驗構(gòu)建和保存。

1.2 主要試劑 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PBS磷酸鹽緩沖液、TRIzol試劑均購自中國賽默飛世爾公司；熒光定量PCR所用試劑購自TaKaRa公司；細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM購自上海西格瑪奧德里奇公司；培養(yǎng)細(xì)胞所用FBS胎牛血清、消化胰酶0.25%Trypsin-EDTA（1×）購自Invitrogen（美國）。

1.3 接毒以及RNA的提取 將接種用細(xì)胞均勻的鋪在6孔板中，待細(xì)胞長至90%以上時接毒。按照1 MOI的劑量接種細(xì)胞，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中吸附1 h后棄掉病毒液，換成含2%的FBS培養(yǎng)基繼續(xù)放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在接毒8 h后按照TRIzol總RNA提取液說明書提取樣品的總RNA。

1.4 DNaseI消化 按照DNaseI消化試劑盒使用說明書進(jìn)行操作，消化體系為25 μL：總DNA模板為21.5 μL，DNaseI消化酶1 μL，10× DNaseIReaction buffer 2.5 μL，輕輕混勻后放置37℃水浴30 min，加入0.25 μL的0.5 mol/L的EDTA，75℃水浴10 min以終止反應(yīng)。

1.5 反轉(zhuǎn)錄過程 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，反轉(zhuǎn)錄總體系為20 μL：RNA模板8 μL，Random primer（0.1 μg/μL）1 μL，RNase-free water 3 μL，輕輕混勻后放置65℃水浴5 min，立即放冰上備用。然后加入5× Reaction buffer 4 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，Ribolock RNase Inhibitor（20 U/μL）1 μL，Revert Aid M-MuL VRT（200 U/μL）1 μL，輕輕混勻后先放置25℃條件下反應(yīng)5 min，之后45℃條件下反應(yīng)60min，最后放置70℃條件下終止反應(yīng)5 min。

1.6 RT-qPCR方法的構(gòu)建以及優(yōu)化 根據(jù)本實(shí)驗室獲得的兩種不同剪接方式的EP0基因序列對比結(jié)果分析，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計熒光定量檢測引物，EP0334-F：5-GGAAGAGGATGAG CCGGTCT-3；EP0442-R：5-GGTTCATCCCGTG CTCCTG-3。熒光定量反應(yīng)體系為：2× SYBR Green PremixEx TaqTM10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA為2 μL，最后用RNase-Free water 補(bǔ)足至20 μL。設(shè)計3個退火溫度（分別為55℃、60℃和65℃），選擇反應(yīng)信號強(qiáng)度最高，Ct值最小的退火溫度作為最適反應(yīng)條件。

1.7 病毒基因組對RT-qPCR方法的影響 提取病毒的RNA后，將所得樣品分為兩份處理，一份利用DNaseI消化處理，一份不使用DNaseI消化，檢測DNaseI消化前后的RNA中EP0基因是否表達(dá)。

1.8 不同反轉(zhuǎn)錄引物對RT-qPCR方法的影響 分別選擇反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的Random Primer和Oligo（dT）對所提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，檢測不同反轉(zhuǎn)錄引物對EP0基因表達(dá)量的影響。

1.9 EP0基因的時態(tài)表達(dá)特征 根據(jù)JS-2012的病毒滴度按照1 MOI的劑量接種細(xì)胞，分別在2、4、8、12 h和16 h收取病毒RNA，檢測EP0基因的動態(tài)表達(dá)特征。

1.10 RT-qPCR方法的初步臨床應(yīng)用 將JS-2012野毒株和LLT啟動子缺失突變病毒按照104TCID50的劑量滴鼻接種小鼠，觀察小鼠發(fā)病情況和死亡情況，并利用構(gòu)建好的RT-qPCR方法檢測小鼠三叉神經(jīng)組織中EP0的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 熒光定量RT-qPCR構(gòu)建及優(yōu)化 試驗結(jié)果顯示：60℃退火溫度條件下可獲得良好的擴(kuò)增效果。在這個反應(yīng)條件下反應(yīng)信號強(qiáng)度最高，Ct值最?。▓D1），并且溶解曲線單一、重復(fù)性較好（圖2）。所以本RT-qPCR方法的最適反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)體系為：2×SYBR Green PremixEx TaqTM10 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，cDNA 2 μL，用RNase-Free water補(bǔ)足至20 μL。

圖1 RT-qPCR擴(kuò)增曲線Fig.1 Amplification curve of RT-qPCR

圖2 RT-qPCR溶解曲線Fig.2 Melting curves of RT-qPCR

2.2 病毒基因組對RT-qPCR方法的影響 為了避免病毒基因組對反轉(zhuǎn)錄的影響，本研究利用DNaseI將提取的RNA進(jìn)行消化。結(jié)果顯示：將DNaseI處理前后的RNA分別作為模板進(jìn)行qPCR，結(jié)果顯示DNaseI消化前后，均檢測不到EP0的轉(zhuǎn)錄。PRV基因組DNA為模板，也檢測不到EP0的轉(zhuǎn)錄。但是DNaseI消化前后的RNA作為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板進(jìn)行qPCR，結(jié)果顯示在DNaseI消化前后均能檢測到EP0的表達(dá)，并且差異不顯著。這表明，病毒基因組DNA的存在與否并不影響該RT-qPCR方法的檢測結(jié)果（圖3）。

圖3 病毒基因組對RT-qPCR的影響Fig.3 The effect of the viral genome on RT-qPCR

2.3 不同反轉(zhuǎn)錄引物對RT-qPCR方法的影響 為了提高反轉(zhuǎn)錄效率，本研究利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒中提供的兩種引物Random primer和Oligo（dT）分別對總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，比較兩種引物的反轉(zhuǎn)錄效率，RT-qPCR結(jié)果顯示：利用Random Primer反轉(zhuǎn)錄，EP0的表達(dá)量顯著高于Oligo（dT）反轉(zhuǎn)錄表達(dá)量（P＜0.0001），差異極顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4）。

圖4 不同引物對比結(jié)果Fig.4 Comparison results of different primers

2.4EP0基因的時態(tài)表達(dá)特征 將親本病毒按照1 MOI的劑量接種6孔板，利用TRIzol試劑收取不同時間點(diǎn)的細(xì)胞總RNA，利用本研究建立的RT-qPCR方法檢測細(xì)胞中的EP0的動態(tài)表達(dá)情況。結(jié)果顯示：病毒感染后2 h，EP0開始表達(dá)，這表明EP0是一種早期基因；在8 h后EP0基因的表達(dá)量達(dá)到最高，之后隨著時間的延長逐漸減少（圖5）。

圖5 EP0基因的時態(tài)表達(dá)特征Fig.5 Temporal expression characteristics of EP0 gene

2.5 RT-qPCR的臨床初步應(yīng)用 按照104TCID50的劑量滴鼻接種小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變病毒也能造成小鼠發(fā)病并死亡。在攻毒后的第3 d小鼠開始發(fā)病，出現(xiàn)典型的偽狂犬病臨床神經(jīng)癥狀：部分小鼠表現(xiàn)為異常興奮，頭部瘙癢，頻繁抓撓頭部皮膚導(dǎo)致頭部抓破；部分小鼠表現(xiàn)為精神沉郁、畏寒，肢體蜷縮在一起，食欲減退，但最終所有小鼠均發(fā)病死亡。然后在小鼠死亡后立即取三叉神經(jīng)并提取RNA反轉(zhuǎn)錄，利用建立好的熒光定量PCR方法對不同病毒感染的小鼠三叉神經(jīng)組織進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示：該方法可以檢測到三叉神經(jīng)組織中EP0基因的表達(dá)。LLT啟動子缺失突變病毒也可以表達(dá)EP0，但是與親本病毒JS-2012相比，突變病毒中EP0的表達(dá)量大大降低。比較單個啟動子缺失病毒JS-L1R1與雙啟動子缺失病毒JS-L1R3的表達(dá)量差異極顯著（P＜0.0001），這表明第二個啟動子缺失后可以影響EP0的表達(dá)。比較JS-L1R3和JS-UL1R3，結(jié)果顯示JS-UL1R3的表達(dá)量較少（P＜0.05），這表明啟動子前重復(fù)序列的缺失也會影響EP0的表達(dá)（圖6）。

圖6 小鼠三叉神經(jīng)中EP0基因的表達(dá)水平Fig.6 Expression level of EP0 gene in trigeminal nerve of mice

3 結(jié)論

利用分子手段檢測生物標(biāo)志物已經(jīng)成為了一種趨勢，并且隨著PCR技術(shù)的發(fā)展，更加精密、靈敏、高通量的PCR檢測方法被開發(fā)并應(yīng)用于臨床監(jiān)測。如數(shù)字PCR、seninest-PCR、多重?zé)晒舛縋CR等。對于含量極低、容易溶解、在蛋白水平檢測時受基質(zhì)影響較大，以及其他不能在蛋白水平檢測的生物標(biāo)志物，均可以嘗試在核酸水平對其檢測。

近來，我們檢測到的EP0基因ORF中存在一內(nèi)含子（231～368 nt），本研究根據(jù)EP0基因剪接后的序列成功建立了偽狂犬病病毒EP0基因的SYBR GreenI實(shí)時熒光定量PCR檢測方法。由于提出的PRV感染細(xì)胞總RNA中存在病毒基因組DNA，分析病毒基因轉(zhuǎn)錄水平時，常需要DNaseI消化去除PRV DNA的殘留，以獲得準(zhǔn)確的實(shí)驗結(jié)果。本文建立的EP0基因定量檢測方法，對PRV基因組DNA、PRV感染細(xì)胞總RNA及其DNaseI消化處理的RNA，檢測結(jié)果均為陰性；但是利用引物反轉(zhuǎn)錄后，DNaseI消化前后的樣品均能檢測到EP0基因的表達(dá)，并且表達(dá)量差異不顯著。這表明，PRV基因組的存在不干擾該方法的檢測結(jié)果，在EP0轉(zhuǎn)錄時不需要DNaseI處理總RNA樣品，簡化了EP0轉(zhuǎn)錄檢測的實(shí)驗流程，提高了檢測效率，也可節(jié)省部分成本。同時，通過比較利用隨機(jī)引物和Oligo（dT）這兩種引物的反轉(zhuǎn)錄，結(jié)果顯示隨機(jī)引物具有轉(zhuǎn)錄檢測效果。我們也利用該方法檢測了EP0基因在細(xì)胞中的時態(tài)表達(dá)特征，結(jié)果顯示EP0基因在感染后2 h已存在轉(zhuǎn)錄，8 h時表達(dá)量最高，之后逐漸減少。這顯示出EP0是一種早期基因。隨著感染時間延長，EP0轉(zhuǎn)錄量出現(xiàn)下降，這可能與EP0具有自調(diào)控功能有關(guān)。郭洪[17]研究顯示，EP0在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中能抑制其自身啟動子的活性，表現(xiàn)出對自身表達(dá)的負(fù)調(diào)控功能。將該方法應(yīng)用于感染不同病毒株的小鼠實(shí)驗中，結(jié)果顯示在小鼠三叉神經(jīng)組織中均能檢測到EP0基因的表達(dá)，并且LAT啟動子缺失后EP0的表達(dá)比親本毒株出現(xiàn)顯著下降。因此本研究構(gòu)建的RT-qPCR檢測方法可以很好的檢測EP0基因的表達(dá)，并且方法簡單快速，也為EP0基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。