付義凱，張麗芳，王春梅，王霄旸，費(fèi)陳忠，張可煜，王 米，薛飛群，劉迎春

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

雞球蟲病每年給養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年飼養(yǎng)大約390億只雞，因雞球蟲病直接造成的經(jīng)濟(jì)損失可達(dá)到30億英鎊[1]。目前，雞球蟲病作為一種寄生性原蟲病，研制疫苗對(duì)雞很難進(jìn)行全面保護(hù)，抗球蟲藥物仍然是防治畜禽球蟲病的主要手段[2]。但是，隨著這些藥物被大量和重復(fù)使用，球蟲耐藥性逐漸顯現(xiàn)，曾經(jīng)被認(rèn)為抗球蟲藥物中最有效的地克珠利（Diclazuril）也出現(xiàn)非常嚴(yán)重的耐藥性問題[3-5]。為了更好的防治畜禽球蟲病，應(yīng)對(duì)耐藥性的問題，最好的的辦法是研制出全新的抗球蟲藥物。

沙咪珠利（Ethanamizuril，EZL）是中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所獸用抗感染藥物創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)在地克珠利和妥曲珠利的基礎(chǔ)上自主研發(fā)的一種新型三嗪類抗球蟲藥。藥效學(xué)研究表明沙咪珠利在臨床使用中，低劑量下、抗球蟲活性較高，具有成為新型抗球蟲藥物的潛力[6]。本研究通過建立的雞球蟲感染模型，灌胃不同劑量的沙咪珠利溶液，給藥后于不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行心臟采血，血漿樣品采用超高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，濃度數(shù)據(jù)利用DAS3.0軟件進(jìn)行分析，得到不同劑量下的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，為進(jìn)一步合理使用沙咪珠利提供數(shù)據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 沙咪珠利（EZL）（由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所制備），純度不低于99.5%；妥曲珠利亞砜（TSO）（含量≥99%），購自上海維編科貿(mào)有限公司；色譜純乙腈和甲醇購自美國(guó)Fisher公司；分析純乙酸乙酯、正己烷購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器設(shè)備 超高效液相色譜儀（ACQUITYUPLC系列，美國(guó)Waters公司）；紫外檢測(cè)器 （ACQUITY UPLC TUV 系列，美國(guó)Waters公司）；渦旋混合器（XW-OA，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；超聲儀（SCQ-250，上海聲譜科學(xué)儀器廠）；離心機(jī)（An-ke LXJ-ⅡB，上海安亭科學(xué)儀器廠）；氮吹儀（美國(guó)Organomation Associates公司）；微量臺(tái)式離心機(jī)（美國(guó)Thermo Scientific）；微孔濾膜：0.22 μm（SCAA104，上海安譜科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 1日齡三黃雛雞購自上海阜稷生物科技有限公司，平地散養(yǎng)，一周后轉(zhuǎn)至籠養(yǎng)，自由采食飲水，飼喂未添加任何藥物的全價(jià)配合飼料。

1.4 溶液制備 準(zhǔn)確稱量10 mg沙咪珠利和10 mg妥曲珠利亞砜，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，分別得到1 mg/mL的沙咪珠利和妥曲珠利亞砜?jī)?chǔ)備液，置4℃冰箱中密封保存。取適量?jī)?chǔ)備液，用甲醇稀釋至所需濃度為不同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.5 給藥和樣品采集 健康幼齡雛雞200只，選取160只，體重120～160g，于15日齡時(shí)感染柔嫩艾美爾球蟲孢子化卵囊80 000。感染后分別選取75只感染模型于第5 d分別灌胃給藥沙咪珠利4 mg/kg.bw與8 mg/kg.bw。感染雞給藥前后分別于0、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、36、48、60、72 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取5只雞心臟采血2 mL，離心分離血漿，血漿樣品-20℃保存待測(cè)。

1.6 血漿中沙咪珠利含量測(cè)定方法

1.6.1 色譜條件 色譜柱：BEH C18柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流動(dòng)相：色譜純乙腈（A），0.1%甲酸水（B），采用梯度洗脫（見表1）；流速：0.2 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)251 nm，運(yùn)行10 min。

表1 UPLC 梯度洗脫條件Table 1 The gradientelution program of the UPLC-CV method

1.6.2 樣品前處理 試驗(yàn)前，將待測(cè)樣品取出，放置室溫解凍。取200 μL血漿樣品至1.5 mL離心管中，加入10 μL的40 μg/mL妥曲珠利亞砜（TSO）作為內(nèi)標(biāo)，渦旋混勻。然后加入1.2 mL乙酸乙酯渦旋30 s，進(jìn)行提取。渦旋后10 000 ×g離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)2 mL離心管中，60℃水浴氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00 μL的30%乙腈水進(jìn)行復(fù)溶，渦旋混勻后，10 000 ×g離心10 min，上清液過0.22 μm濾膜，進(jìn)樣測(cè)定。

1.6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定 取200 μL的空白血漿置于1.5 mL離心管中，添加系列濃度的沙咪珠利標(biāo)準(zhǔn)工作液10 μL，使沙咪珠利濃度分別為0.04、0.1、0.5、1、5、10 μg/mL，按照1.6.2樣品前處理方法處理，進(jìn)樣確定，記錄色譜圖中的EZL和TSO的峰面積，以樣品中的EZL的濃度為橫坐標(biāo)，以沙咪珠利和妥曲珠利亞砜的峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.4 回收率與精密度的測(cè)定 取200 μL的空白血漿，添加沙咪珠利標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μL，使樣品濃度分別為低、中和高三組，每種濃度5個(gè)平行樣品，樣品濃度分別為0.1、1、5 mg/L，按照1.6.2方法進(jìn)行處理，進(jìn)樣測(cè)定。樣品的相對(duì)回收率根據(jù)當(dāng)天的制備的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。精密度包括日內(nèi)和日間精密度，精密度用日內(nèi)和日間的標(biāo)準(zhǔn)偏差（s）或者相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation, RSD）表示。

1.6.5 樣品穩(wěn)定性的測(cè)定 制備樣品濃度為1、4 μg/ml，分兩組，第一組室溫，添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的血漿樣品放置8 h后，按照1.6.2中的方法處理并進(jìn)樣測(cè)定，記錄EZL和TSO的峰面積；第二組是將樣品放置到-20℃冰箱中，保存24 h后取出，自然解凍，解凍后再次將血漿樣品放置-20℃冰箱，如此反復(fù)3次后，進(jìn)行樣品處理后測(cè)定，記錄EZL和TSO的峰面積，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出相對(duì)回收率。

1.7 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)沙咪珠利的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算兩藥在各采樣時(shí)間點(diǎn)血漿中藥物濃度，用DAS3.0軟件對(duì)血藥濃度－時(shí)間數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，用非房室模型分析藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

2.結(jié)果

2.1 血漿中沙咪珠利測(cè)定方法的建立

2.1.1 檢測(cè)方法的專屬性 空白雞血漿與空白雞血漿添加沙咪珠利（EZL）、妥曲珠利亞砜（TSO）后，按1.6.2中方法處理后，經(jīng)UPLC進(jìn)樣檢測(cè)，比較空白血漿和添加藥物血漿色譜圖。由圖可知，沙咪珠利（EZL）和妥曲珠利亞砜（TSO）在出峰處無干擾，方法專屬性良好（圖1）。

圖1 血漿中沙咪珠利和妥曲珠利亞砜色譜圖Fig.1 Chromatograms of EZL and TSO

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍 分別以藥物濃度（X）和EZL峰面積/TSO峰面積比值（Y）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)回歸，得到雞血漿回歸方程為y=0.8532x-0.0337，R2=0.9998。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可知血漿中沙咪珠利在0.04～10 μg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 回收率及精密度 空白雞血漿中分別添加高、中、低3個(gè)濃度沙咪珠利標(biāo)準(zhǔn)工作液，每個(gè)濃度平行測(cè)定5個(gè)樣品，連續(xù)測(cè)定3 d，計(jì)算回收率及精密度結(jié)果（表2）。由結(jié)果可知，血漿回收率為90.19%～116.72%，日內(nèi)精密度為1.62%～8.57%、2.64%～7.41%。方法的回收率及精密度良好，符合生物樣品的測(cè)定要求。

表2 雞血漿中沙咪珠利含量檢測(cè)準(zhǔn)確度和精密度Table 2 Recovery and precision results of Ethanamizuril in chicken plasma

2.1.4 樣品穩(wěn)定性 本試驗(yàn)考察了2個(gè)濃度的雞血漿樣品在8 h和3次反復(fù)凍融后穩(wěn)定性。添加濃度為1 μg/mL、4 μg/mL的樣品放置8 h后回收率分別為98.14±4.78和93.64±5.05；兩種濃度的樣品反復(fù)凍融3次后回收率分別為113.02±2.49和112.66±7.89。結(jié)果表明，血漿樣品在此種條件下穩(wěn)定性良好。

2.2 沙咪珠利在感染雞體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征 空白健康雛雞飼養(yǎng)至15 d齡感染柔嫩艾美爾球蟲孢子化卵囊80 000，給藥劑量分別為4 mg/kg.bw、8 mg/kg.bw，灌胃給藥。給藥前后分別于0、0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、36、48、60、72 h時(shí)間點(diǎn)采血。4 mg/kg與8 mg/kg劑量下，血藥濃度-時(shí)間曲線如圖2所示，兩種給藥劑量下血漿中不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的平均藥物濃度見表3。用DAS3.0藥動(dòng)學(xué)軟件非房室模型對(duì)濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表4。通過灌胃給藥，給藥劑量分別為4 mg/kg.bw與8 mg/kg.bw，按不同時(shí)間點(diǎn)采血，通過DAS3.0軟件非房室模型擬合，獲得4 mg/kg和8 mg/kg給藥后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，分析數(shù)據(jù)得到藥時(shí)曲線面積AUC（mg L-1h）為96.90±16.31、351.61±36.06；平均滯留時(shí)間MRT（h）為21.80±1.80、23.86±2.12；藥物半衰期t1/2z（h）為13.83±5.13、15.07±7.49；藥物達(dá)峰時(shí)間Tmax（h）為5.2±3.83、8.8±1.79，藥物達(dá)峰濃度Cmax（mg L-1）為4.28±1.56、11.82±0.59。

表3 雞分別單劑量給藥4 mg/kg.bw，8 mg/kg.bw后不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)雞血漿中沙咪珠利平均藥物濃度Table 3 The mean concentrations of EZL in poultry plasma after oral administration of 4 mg/kg.bw，8 mg/kg.bw,respectively

表4 雞灌胃4 mg/kg.bw，8 mg/kg.bw藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 4 Pharmacokinetic parameters EZL in chicken plasma after administration at the dosage of 4 mg/kg.bw, 8 mg/kg.bw

圖2 血漿中沙咪珠利藥物濃度-時(shí)間曲線圖Fig.2 The concentration time curve of EZL in chicken plasma

3 討論

藥物代謝動(dòng)力學(xué)（Pharmacokinetics, PK）研究的是給藥后藥物在機(jī)體內(nèi)的排泄以及代謝規(guī)律，借助數(shù)學(xué)模型計(jì)算出藥動(dòng)學(xué)參數(shù)來預(yù)測(cè)藥物在體內(nèi)的過程[7]。藥物的體內(nèi)過程包括吸收（Absorption）、分布（Distribution）、代謝（Metabolism）、消除（Elimination）、排泄（Excretion），通過檢測(cè)和分析手段，得到體內(nèi)藥物的含量和質(zhì)量隨時(shí)間的變化規(guī)律，最終得到各種藥代動(dòng)力學(xué)相關(guān)的參數(shù)和代謝相關(guān)信息，為藥物的制劑研究，藥理毒理研究等提供理論和數(shù)據(jù)支撐[8-9]。本實(shí)驗(yàn)通過建立雞球蟲感染模型，灌胃給藥，給藥劑量分別為4 mg/kg.bw與8 mg/kg.bw，按不同時(shí)間點(diǎn)采血，通過DAS3.0軟件非房室模型擬合，獲得4 mg/kg和8mg/kg給藥后的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，分析數(shù)據(jù)得到藥時(shí)曲線面積AUC （mg L-1h）為96.90、371.45；藥物半衰期t1/2z為13.83 h和15.07 h；藥物達(dá)峰時(shí)間Tmax分別為5.2 h和8.8 h，藥物達(dá)峰濃度Cmax分別為4.28 μg/mL和11.82 μg/mL。研究表明，兩種給藥劑量下最高血藥濃度，藥時(shí)曲線下面積值與給藥劑量呈正相關(guān)，說明沙咪珠利對(duì)雞給藥后在其體內(nèi)吸收良好。兩種劑量下消除半衰期相近，有文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)雞單劑量10 mg/kg灌胃給藥地克珠利后，藥物半衰期t1/2z為24.2 h，大于沙咪珠利在雞體內(nèi)的消除半衰期，說明沙咪珠利對(duì)雞給藥后在雞體內(nèi)消除更快[10]；Myoung-Seok等[11]報(bào)道雞以單劑量10 mg/kg或20 mg/kg給藥妥曲珠利后，妥曲珠利的最終代謝產(chǎn)物妥曲珠利亞砜在雞體內(nèi)的消除半衰期分別比妥曲珠利慢80.3 h和82.9 h，表明妥曲珠利對(duì)雞給藥后在體內(nèi)的消除更慢?？傊?，研究結(jié)果表明對(duì)雞給藥后，沙咪珠利與地克珠利和妥曲珠利相比，在雞體消除更快。