肖 倩，黃秀英，丁 莉，左榕琳，李成山，邢 剛

（1.成都史紀(jì)生物制藥有限公司，成都 610100；2.北京市華都峪口禽業(yè)有限責(zé)任公司，北京 101206）

雞傳染性法氏囊病（infectious bursal disease,IBD）是由雞傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus, IBDV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病，主要侵害雞的法氏囊，以傳播迅速、發(fā)病率高、病死率高、病程短為特征，易感雞群為3～12周齡雛雞和青年雞[1]。IBDV可在法氏囊的B淋巴細(xì)胞中進(jìn)行繁殖并損傷B淋巴細(xì)胞，從而引起感染雞的免疫抑制，導(dǎo)致繼發(fā)感染或疫苗免疫失敗[2]。從發(fā)現(xiàn)至今，IBDV已給世界各國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

IBDV屬于雙RNA病毒科禽雙RNA病毒屬，是一種無(wú)囊膜病毒，由A、B兩個(gè)片段組成，共編碼5種蛋白，分別是VP1蛋白、VP2蛋白、VP3蛋白、VP4蛋白和VP5蛋白[4]。其中VP2蛋白是構(gòu)成IBDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，也是主要的保護(hù)性抗原，可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。目前IBD亞單位疫苗研發(fā)大部分都以VP2蛋白作為主要抗原[5-6]。原核表達(dá)因其具有產(chǎn)量高、生產(chǎn)周期短、易于操作、成本低等特點(diǎn)，而成為重組蛋白表達(dá)的首選[7]，但原核表達(dá)的蛋白在大腸桿菌中往往以包涵體形式存在，需復(fù)性才能成為具有生物活性的可溶性蛋白[8-9]。本研究利用2019年分離的IBDV超強(qiáng)毒株的VP2基因?yàn)槟０?，?gòu)建了重組表達(dá)載體pET-30a-VP2，并將其轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株BL21中進(jìn)行原核表達(dá)，旨在制備可溶性VP2蛋白并分析其免疫原性，為IBDV亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及菌毒株 原核表達(dá)載體pET-30a購(gòu)自索萊寶科技有限公司；E.coliDH5α及E.coliBL21購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；IBDV超強(qiáng)毒株SD株由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究與防控綜合實(shí)驗(yàn)室提供；IBDV BC6/85株、IBD標(biāo)準(zhǔn)抗原及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 主要試劑 病毒RNA提取試劑盒、超薄瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、HRP標(biāo)記的兔抗雞IgY、增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；HiScript?Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR及ClonExpress?Ⅱ One Step Cloning Kit購(gòu)自Vazyme公司；DNA marker及LATaq購(gòu)自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶HindⅢ及NcoI購(gòu)自NEB公司；考馬斯亮藍(lán)R-250、4×SDS PAGE上樣緩沖液及卡那霉素及IPTG購(gòu)自索萊寶科技有限公司；蛋白質(zhì)marker購(gòu)自Thermo公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 利用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)擴(kuò)增IBDV VP2基因的引物，見表1，擴(kuò)增目的片段大小為1356 bp。由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.4 IBDV VP2基因片段擴(kuò)增 根據(jù)病毒RNA提取試劑盒說明書，提取IBDV SD株的RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，擴(kuò)增VP2基因，反應(yīng)體系如下：LATaq25 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA模板1 μL，補(bǔ)加ddH2O至50 μL，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性15 s，54℃退火30 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并回收目的片段。

1.5 pET-30a-VP2菌株的構(gòu)建 用HindⅢ和NcoI雙酶切pET-30a質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物與回收的IBDV-VP2片段進(jìn)行連接，并轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α中，篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行PCR鑒定，鑒定正確的送生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.6 重組VP2蛋白的表達(dá)與驗(yàn)證 將重組質(zhì)粒pET-30a-VP2轉(zhuǎn)化至E.coliBL21中，并用終濃度為1 mmol/L的IPTG在28℃進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后超聲破碎，利用SDS-PAGE凝膠電泳驗(yàn)證VP2蛋白的表達(dá)。將表達(dá)的VP2蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉，以1∶1000倍稀釋的IBD陽(yáng)性雞血清為一抗，以HRP標(biāo)記的兔抗雞IgY作為二抗，進(jìn)行Western blot鑒定。

1.7 重組VP2蛋白誘導(dǎo)條件優(yōu)化 分別利用0.1、0.2、0.5 mmol/L和1 mmol/L濃度的IPTG對(duì)pET-30a-VP2菌株進(jìn)行誘導(dǎo)，以確定IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度。在IPTG濃度為0.2 mmol/L時(shí)，在16℃、28℃、30℃和37℃分別對(duì)pET-30a-VP2菌株進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以確定最佳誘導(dǎo)溫度。超聲破碎上述不同誘導(dǎo)條件的菌液，取上清液，用IBD標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清測(cè)定蛋白的AGP效價(jià)，AGP效價(jià)最高者確定為最佳表達(dá)條件。

1.8 重組VP2蛋白的純化和鑒定 重組菌按優(yōu)化好的條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后，離心收集菌體，超聲波裂解菌體，收集上清液過Ni-NTA柱進(jìn)行純化，應(yīng)用SDS-PAGE和Western blot鑒定純化后的VP2蛋白。

1.9 重組VP2蛋白的免疫原性分析

1.9.1 配苗及免疫 將AGP效價(jià)為1∶4、1∶8、1∶16的VP2蛋白分別與吐溫-80配制成水相，再與2倍體積的油相乳化制苗。取60只30日齡SPF雞，隨機(jī)分為3組，20只/組，分別頸部皮下注射上述不同AGP效價(jià)的VP2蛋白疫苗，0.3 mL/只，另取15只同日齡SPF雞不免疫做對(duì)照，分別于隔離器中飼養(yǎng)。

1.9.2 抗體測(cè)定及攻毒 于免疫后21 d，在免疫組及對(duì)照組種分別隨機(jī)抽取10只雞，采血分離血清，使用IBD標(biāo)準(zhǔn)抗原測(cè)定血清中的AGP抗體效價(jià)。于免疫后21 d，將各免疫組隨機(jī)分為2個(gè)亞組，10只/組，分別用IBDV BC6/85株及SD株進(jìn)行點(diǎn)眼攻毒，每只0.1 mL（含100 BID），同時(shí)，將對(duì)照組隨機(jī)分為3個(gè)亞組，5只/組，其中2組作為IBDV BC6/85株及SD株的攻毒對(duì)照組，另1組不攻毒作為空白對(duì)照。每天觀察發(fā)病及死亡情況，攻毒后72 h，剖檢各組雞，以法氏囊出現(xiàn)發(fā)黃、明顯腫大、出血、內(nèi)有膠凍樣分泌物等任一項(xiàng)則判為病變，計(jì)算VP2蛋白苗的攻毒保護(hù)率。

2 結(jié)果

2.1 IBDV VP2基因片段擴(kuò)增 IBDV進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)1條約1356 bp的條帶，與預(yù)期目的片段大小相符（圖1）。

2.2 pET-30a-VP2原核表達(dá)載體的構(gòu)建 菌落進(jìn)行PCR鑒定，可擴(kuò)增出1356 bp大小的特異性片段（圖2）。將鑒定正確的重組質(zhì)粒測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，成功構(gòu)建了pET-30a-VP2重組質(zhì)粒。

圖2 菌落PCR鑒定Fig.2 Bacterial colony PCR identification

2.3 重組VP2蛋白的表達(dá)與驗(yàn)證 表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDSPAGE，由圖3可知，上清液和沉淀中在37 kDa處都出現(xiàn)與預(yù)期大小一致的蛋白條帶，且空載體無(wú)條帶，說明表達(dá)的蛋白大部分為可溶性蛋白表達(dá)，少部分以包涵體形式存在。Western blot顯示在37 kDa出現(xiàn)特異性條帶（圖4），表明成功構(gòu)建了表達(dá)可溶性VP2蛋白的BL21-VP2菌株。

圖3 VP2蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of VP2 protein

圖4 VP2蛋白的Western blot分析Fig.4 Western blot analysis of VP2 protein

2.4 重組VP2蛋白誘導(dǎo)條件優(yōu)化 不同濃度的IPTG對(duì)pET-30a-VP2進(jìn)行誘導(dǎo)，IPTG濃度為0.1 mmol/L時(shí)，VP2蛋白AGP效價(jià)為1∶2；IPTG濃度為0.2、0.5、1.0 mmol/L時(shí)，VP2蛋白AGP效價(jià)均為1∶4，不隨IPTG濃度升高而升高。所以選擇IPTG的誘導(dǎo)濃度為0.2 mmol/L。以不同溫度對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，16℃、28℃、37℃誘導(dǎo)時(shí)，AGP效價(jià)分別為1∶1、1∶4、1∶4，30℃誘導(dǎo)時(shí)，AGP效價(jià)最高，為1∶16，確定最佳誘導(dǎo)溫度為30℃。

2.5 重組VP2蛋白的純化和鑒定 純化后的VP2蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，在37 kDa處得到單一的條帶，與預(yù)期大小相符。進(jìn)行Western blot鑒定，蛋白能被雞傳染性法氏囊病陽(yáng)性血清特異性識(shí)別，表明純化的VP2蛋白具有良好的反應(yīng)原性（圖5）。

圖5 純化VP2蛋白的SDS-PAGE（A）和Western blot分析（B）Fig.5 SDS-PAGE (A) and Western blot analysis (B) of purified VP2 protein

2.6 重組VP2蛋白免疫原性分析

2.6.1 抗體效價(jià)測(cè)定 VP2蛋白含量不同的疫苗免疫SPF雞21 d，免疫組AGP抗體效價(jià)隨著VP2蛋白含量增加而增加（表2），說明VP2可溶性蛋白具有良好的免疫原性，可有效刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的抗體。

表2 不同VP2蛋白含量的疫苗免疫SPF雞21 d血清AGP效價(jià)檢測(cè)結(jié)果Table 2 Serum AGP titer of vaccine-immunized SPF chickens at 21-day with different VP2 protein content

2.6.2 攻毒試驗(yàn) 各組雞攻毒72 h后進(jìn)行剖檢，空白對(duì)照組法氏囊無(wú)病變，2株強(qiáng)毒攻毒對(duì)照組均5/5病變，VP2蛋白AGP效價(jià)1∶8和1∶16的免疫組對(duì)2株強(qiáng)毒的攻毒保護(hù)率均為10/10，無(wú)法氏囊病變。VP2蛋白AGP效價(jià)1∶4的免疫組剖檢結(jié)果如圖5，攻毒BC6/85株的剖檢后有3個(gè)法氏囊明顯的腫大，BC6/85株的保護(hù)率為7/10，攻毒SD株的剖檢后有2個(gè)法氏囊明顯的腫大，SD株的保護(hù)率為8/10，結(jié)果詳見表3。以上結(jié)果表明，AGP效價(jià)不低于1∶8的VP2蛋白疫苗能有效抵抗IBDV超強(qiáng)毒株及經(jīng)典強(qiáng)毒的攻擊。

表3 不同VP2蛋白含量的疫苗免疫SPF雞21日的攻毒保護(hù)結(jié)果Table 3 The results of 21-day challenge protection of SPF chickens immunized with vaccine with different VP2 protein content

3 討論

VP2蛋白是IBDV最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，占病毒蛋白總量的51%，與病毒的毒力、致病性、抗原的漂移等密切相關(guān)，且能產(chǎn)生中和抗體，所以VP2蛋白成為近年來疫苗研究的熱點(diǎn)[10]。Francois等[11]構(gòu)建了表達(dá)感染性IBDV宿主保護(hù)抗原VP2的CELO病毒。結(jié)果表明，基于CELO的載體能安全誘導(dǎo)雞對(duì)vvIBDV產(chǎn)生較強(qiáng)的保護(hù)性免疫。Kim等[12]構(gòu)建了表達(dá)VP2蛋白的pcDNA-VP2疫苗和表達(dá)VP2、VP4和VP3蛋白的pcDNA-VP243疫苗，兩種質(zhì)粒DNA疫苗都能對(duì)vvIBDV有較高的保護(hù)性免疫。李賽賽等[13]在大腸桿菌中表達(dá)了VP2-LS3重組蛋白籠納米顆粒，而且表達(dá)的VP2-LS3蛋白具有較好的免疫原性。

圖6 VP2蛋白AGP效價(jià)1∶4的免疫組的剖檢結(jié)果Fig.6 Results of autopsy of VP2 protein with AGP titer of 1∶4

IBDV毒株主要包括了經(jīng)典株、變異株和超強(qiáng)株[14]。IBDV易變異，對(duì)環(huán)境有較強(qiáng)的抵抗力，新毒株不斷被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致IBD的發(fā)生和流行，目前傳統(tǒng)的疫苗免疫保護(hù)效果不再理想，IBD的防控面臨著挑戰(zhàn)[15-16]。本研究利用IBDV超強(qiáng)毒株SD株作為模板，擴(kuò)增與克隆VP2基因，構(gòu)建了原核表達(dá)的重組質(zhì)粒pET-30a-VP2，在大腸桿菌中成功表達(dá)，且表達(dá)的VP2蛋白大部分都是以可溶性蛋白的形式存在。SD毒株為2019年分離的IBDV流行毒株，如能制備成為疫苗能夠?qū)δ壳癐BDV防控做出巨大的貢獻(xiàn)，且本研究的VP2蛋白為大腸桿菌表達(dá)的可溶性蛋白，易于生產(chǎn)，蛋白不需要經(jīng)過變性復(fù)性等步驟，為蛋白后期的純化節(jié)約了大量的時(shí)間，減少了工作量和成本。AGP試驗(yàn)是檢測(cè)IBDV的經(jīng)典方法，該重組VP2蛋白未純化上清液AGP效價(jià)能達(dá)到1∶16。將不同AGP效價(jià)的VP2蛋白制備成油乳劑疫苗，免疫接種30日齡SPF雞，免后28 d，免疫雞血清中AGP抗體效價(jià)隨蛋白含量增加而增加，說明該蛋白具有良好的免疫原性。對(duì)免疫雞進(jìn)行超強(qiáng)毒株與經(jīng)典強(qiáng)毒株攻毒，AGP效價(jià)不低于1∶8的VP2蛋白疫苗能有效的抵抗2株強(qiáng)毒的攻擊，攻毒保護(hù)率為10/10，為IBD VP2蛋白亞單位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。