郭 爽，王 欣,2，龐琳琳，張俊杰，李宗杰，李蓓蓓，劉 珂，邵東華，邱亞峰，馬志永，魏建超

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.長江大學(xué)，荊州 434000）

流行性乙型腦炎（Japanese encephalitis, JE）是由日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）引起的一種自然疫源性人獸共患病，多在夏秋季節(jié)流行，吸血蚊蟲是其主要的傳播媒介，豬是主要的擴(kuò)增宿主。該病可導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)，胎兒多為死胎或木乃伊胎[1]。引起公豬睪丸炎，常有一側(cè)或兩側(cè)睪丸腫脹，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]。該病可通過蚊蟲叮咬傳染給人，引起腦炎，造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，給公共安全帶來威脅。

JEV屬于黃病毒科、黃病毒屬成員，是一種有囊膜的單鏈正義RNA病毒，全長約11 kb，共編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白與7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白，依次為5'UTR-CPrM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3'UTR[3]。其中E蛋白是病毒顆粒表面最重要的成分之一，與病毒嗜性和毒力密切相關(guān)，對(duì)產(chǎn)生中和抗體中發(fā)揮重要作用[4]。JEV有1種血清型，基于E蛋白基因的核苷酸序列，可將其分為5種基因型（GIGⅤ型）[5]。2001年之前GⅢ JEV是的主要基因型，近年來分離到GI JEV概率顯著增加，在在遼寧省、四川省、河南省、山東省、貴州省和上海市等地被頻繁檢測(cè)到[6]。研究表明，我國JEV的優(yōu)勢(shì)基因型正在發(fā)生轉(zhuǎn)變，GI/III JEV的共同流行正變得普遍，GI JEV已經(jīng)取代了GIII JEV，成為許多地區(qū)的主要基因型[7-8]。

本研究對(duì)2015年采集自上海市奉賢區(qū)豬場(chǎng)的疑似感染JEV的豬病料樣品進(jìn)行檢測(cè)，從流產(chǎn)胎兒腦組織中成功分離得到1株JEV，命名為SD12株（GenBank登錄號(hào)：MH753127）。為了解該分離株的生物學(xué)特征和分子進(jìn)化情況，對(duì)其全基因構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，為上海地區(qū)豬JEV的防控與疫苗研發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 乳倉鼠腎細(xì)胞BHK-21和弱毒株SA14-14-2由本實(shí)驗(yàn)室保存。Trizol Reagent購自Invitrogen公司；QIAamp?Virus RNA Mini Kit購自QIAQEN公司；PrimeScript RT Master Mix購自Takara公司；DNA marker購自寶生物工程（大連）有限公司；10%中性福爾馬林固定液購自北京索萊寶科技有限公司；Q5?High-Fidelity DNA Polymerase購自NEB（北京）有限公司；鼠源抗JEV NS3蛋白多克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備保存，熒光素標(biāo)記兔抗鼠抗體（FITC-IgG）購自Sigma公司；C57BL/6小鼠購自上海捷斯捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 鑒于我國目前是GI/GⅢ JEV共同流行趨勢(shì)，合成檢測(cè)GI/GⅢ JEVE基因的通用檢測(cè)引物JE-F/R[9]，設(shè)計(jì)分段擴(kuò)增引物F1-F8，均由派森諾生物科技有限公司合成（表1）。

表1 本研究使用引物Table 1 Primers used in this study

1.3 病料的處理與病毒的分離培養(yǎng) 采集的樣品經(jīng)研磨后反復(fù)凍融，取200 μL研磨液用TRIZol提取組織RNA，用于RT-PCR檢測(cè)。PCR檢測(cè)陽性樣品的剩余研磨液使用0.22 um無菌濾膜過濾后，接種于BHK-21細(xì)胞盲傳3代，同時(shí)設(shè)毒株SA14-14-2對(duì)照組和正常細(xì)胞對(duì)照組。觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，若出現(xiàn)細(xì)胞病變達(dá)約70%時(shí)收獲細(xì)胞上清液凍存?zhèn)溆?。利用QIAamp? Virus RNA Mini Kit，按說明書操作提取病變細(xì)胞總RNA用于RT-PCR分段擴(kuò)增病毒基因。

1.4 RT-PCR檢測(cè)及全基因分段擴(kuò)增 參照PrimeScript RT Master Mix說明書，獲得cDNA。取2 μL cDNA為模板，加入上、下游引物各2.5 μL，0.5 μL Q5?High-Fidelity DNA Polymerase，ddH2O補(bǔ)足至50 μL，混勻后置于PCR儀中擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，陽性產(chǎn)物送至派森諾生物科技有限公司測(cè)序。

1.5 間接免疫熒光鑒定 BHK-21細(xì)胞感染0.01 MOI病毒。24 h后細(xì)胞用冰冷的丙酮固定，分別孵育一抗和二抗。最后使用熒光顯微鏡檢測(cè)陽性細(xì)胞[10]。

1.6 病毒噬斑和病毒滴度測(cè)定 將噬斑純化后的毒株10倍梯度稀釋，依次接種BHK-21單層細(xì)胞的96孔板，測(cè)定病毒滴度[11]，在6孔板進(jìn)行噬斑測(cè)定，同時(shí)分別通過腦內(nèi)和腹腔感染小鼠，每日觀察細(xì)胞病變情況與小鼠發(fā)病及死亡情況，按Reed-Muench法計(jì)算LD50。感染致死小鼠和正常小鼠的腦組織用于制作病理組織切片，顯微鏡觀察病理結(jié)果。

1.7 序列分析 在NCBI中下載JEV參考毒株的基因序列，使用MegAlign軟件完成核苷酸相似性和氨基酸同源性分析，并使用MEGA繪制基于Neighborjoining（NJ）法的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR鑒定 分別以檢測(cè)引物和分段引物擴(kuò)增cDNA，結(jié)果顯示目的片段大小與預(yù)期大小相符合（表1），表明檢測(cè)樣本中還有JEV的全部基因組，將擴(kuò)增產(chǎn)物送派森諾生物科技有限公司測(cè)序（圖1）。

圖1 JEV SD12 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The PCR results of JEV SD12 isolate

2.2 細(xì)胞病變的觀察 純化的病毒經(jīng)連續(xù)傳代，細(xì)胞病變時(shí)間穩(wěn)定。與正常的BHK-21細(xì)胞相比較，接種SD12株的細(xì)胞在感染48 h左右開始出現(xiàn)圓縮并逐漸脫落，感染60 h大部分細(xì)胞漂浮并逐漸死亡，接種SA14-14-2株的細(xì)胞出現(xiàn)類似的病變情況（圖2）。

圖2 接種細(xì)胞觀察（100×）Fig.2 Observation of inoculated cells (100×)

2.3 間接免疫熒光染色試驗(yàn) 感染SD12株的BHK-21細(xì)胞的胞漿呈現(xiàn)特異的綠色熒光信號(hào)，未接毒細(xì)胞沒有熒光信號(hào)，由此可進(jìn)一步鑒定SD12株為JEV陽性，細(xì)胞的病變是由JEV引起的（圖3）。

圖3 熒光染色結(jié)果（400×）Fig.3 Fluorescent staining results (400×)

2.4 病毒噬斑與病毒滴度 經(jīng)BHK-21細(xì)胞噬斑測(cè)定，SD12株的病毒滴度為1.25×106PFU/100μL。按Reed-Muench法計(jì)算LD50，接毒C57BL/6小鼠12 h后開始出現(xiàn)離群、抽搐、震顫等癥狀，大多數(shù)小鼠在72 h內(nèi)死亡。腦內(nèi)感染小鼠的LD50為102.70PFU，經(jīng)腹腔感染小鼠的LD50為102.70PFU，表明分離株具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒力。解剖對(duì)照組和死亡小鼠發(fā)現(xiàn)腦組織出現(xiàn)充血和水腫，觀察腦組織病理切片可見神經(jīng)元壞死，神經(jīng)細(xì)胞周圍間隙增寬，部分腦血管周圍有較多淋巴細(xì)胞浸潤（圖4）。

圖4 腦組織病理學(xué)觀察（200×）Fig.4 Brain tissue pathological observation (200×)

2.5 序列分析 采用MegAlign將SD12株同NCBI種32株JEV毒株進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果顯示，SD12株與HEN0701株的核苷酸同源性最高99.7%，氨基酸同源性99.8%，與SA14-14-2的核苷酸同源性88.6%，氨基酸同源性97.4%。此外，SD12同部分毒株E蛋白氨基酸相比較差異如表2所示。

表2 分離株E蛋白氨基酸序列位點(diǎn)與其他毒株的差異Table2 Comparison of the E protein amino acid sites of isolate with other strains

2.6 進(jìn)化樹分析 參考Chen等[12]建立的JEV基因分型方法，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，33株病毒被分成5大簇，分離株SD12與HEN0701在進(jìn)化樹上形成一個(gè)小分支，并且與Ishikawa和Mie這些經(jīng)典基因I型毒株位于同一大簇中，根據(jù)基因分型方法，可判定分離株SD12屬于GI JEV（圖5）。

圖5 JEV基因遺傳進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on JEV gene

3 討論

2001年首次從上海豬場(chǎng)采集的蚊蟲中分離到多株GI JEV[13]。2003年孫泉云等[14]調(diào)查發(fā)現(xiàn)崇明、奉賢和閔行三區(qū)的母豬陽性率為5.55%～40%。2010年張麗穎[15]在上海豬群檢測(cè)到JEV抗體的陽性率高達(dá)68.69%，但無法區(qū)分是由疫苗或野毒感染導(dǎo)致。研究主要集中在檢測(cè)血清陽性率，沒有從上海豬體內(nèi)分離株的相關(guān)報(bào)道。近年來，生豬集約化養(yǎng)殖加快，導(dǎo)致豬群感染JEV的概率增加，但同時(shí)豬群和人群的預(yù)防接種等綜合防控措施的施行，全國乙腦發(fā)病率呈下降趨勢(shì)[16]。

JEV E蛋白是重要的結(jié)構(gòu)蛋白[17]，由三個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，結(jié)構(gòu)域I中有糖基化位點(diǎn)與具有血清學(xué)及生物活性的抗原表位；結(jié)構(gòu)域Ⅱ中含有中和表位和具有血凝活性的抗原表位；結(jié)構(gòu)域Ⅲ在含有形成免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為與形成受體結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)[18]。SD12株與SA14-14-2株E蛋白共有14個(gè)氨基酸差異，其中E138、E176、E177位于結(jié)構(gòu)域I，E107、E129、E222、E244、E264和E279位于結(jié)構(gòu)域Ⅱ，E315、E327和E366位于結(jié)構(gòu)域Ⅲ，E439和E447位于結(jié)構(gòu)域之外。Yang等[19]通過反向遺傳證明E107和E138位決定JEV神經(jīng)毒力，E138位更加關(guān)鍵，E176/177位突變顯著中和E107和E138位的功能，E279突變會(huì)影響病毒噬斑大小。Zheng等[20]通過反向遺傳進(jìn)一步證明E138位點(diǎn)酸堿性決定JEV神經(jīng)毒力。SD12株E138位為酸性氨基酸谷氨酸，表明SD12株具有強(qiáng)毒特征。Wu等[21]研究的三個(gè)中和表位（E337～E345、E377～E382、E397～E403）在SD12種沒發(fā)生變化，氨基酸的同源性較高（97.2%），理論上當(dāng)前我國使用的疫苗能夠預(yù)防該毒株的感染。但SA14-14-2株為我國70年前分離的毒株與新流行的毒株屬不同的基因型，E基因核苷酸差異較明顯（87.5%），且不同毒株之間的毒力差異大，因此需要評(píng)價(jià)SA14-14-2株對(duì)新流行毒株的中和能力。Ye等[22]通過反向遺傳證明A222S和S327T突變不改變病毒復(fù)制，但會(huì)降低SA14-14-2疫苗株誘導(dǎo)中和抗體水平，說明E222和E327是潛在的基因型相關(guān)中和決定簇，突變SA14-14-2的這兩個(gè)位點(diǎn)可增加其對(duì)GI JEV的中和抗體水平，SD12株存在上述位點(diǎn)差異，推測(cè)致弱SD12株能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生更高水平的中和抗體。Wei等[23]通過交叉保護(hù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，SA14-14-2疫苗株對(duì)GI JEV感染的小鼠不能提供完全保護(hù)，暗示有進(jìn)一步研發(fā)GI JEV疫苗的必要。

本研究首次在上海豬群中分離到1株GI JEV，命名為SD12，上傳基因組序列至NCBI（GenBank登錄號(hào)：MH753127）。表明上海豬群中存在GI JEV流行，通過分析氨基酸差異發(fā)現(xiàn)本毒株關(guān)鍵毒力位點(diǎn)突變后能夠成為GI疫苗候選株，為豬JEV的防控與疫苗研發(fā)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。