李大龍，郭瀟雨,2，李鐵梅，王澤珉，宇航，張鵬,2，王佳明，楊國慧*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北地區(qū)園藝作物生物學與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，東北農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，哈爾濱 150030；2.青島黃海學院，山東 青島 266555；3.黑龍江工商學院，哈爾濱 150016）

樹莓（Raspberry）是薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（RubusL.）空心莓亞屬（Idaeobatus），為多年生落葉性灌木型果樹，別稱托盤、懸鉤子、馬林果、覆盆子等[1]。樹莓果實為聚合小漿果，香氣怡人，口感多為酸甜，含有豐富營養(yǎng)成分，如氨基酸、維生素、糖、有機酸、礦物元素等，藥用價值高，富含黃酮類化合物、鞣花酸、花青素等多種生理活性成分[2]。樹莓果實顏色較多，其中紅色最為常見，還有紫色、黑色和黃色等；按照結(jié)果習性，可分為夏果型和秋果型兩種。

果實品質(zhì)由多種因素組成，顏色、香氣、營養(yǎng)、甜度等是重要指標。果品香氣是決定果實品質(zhì)主要因素，直接影響消費者購買意向。國內(nèi)外學者已在樹莓中鑒定出200多種香氣成分，主要為酯類、醛類、萜烯類、醇類、酮類及其他揮發(fā)性物質(zhì)[3-4]。氣相色譜法（GC）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）是揮發(fā)性物質(zhì)主要測定手段[5]。Aprea等利用固相微萃取法提取樹莓果實香氣物質(zhì)，檢測到36種香氣物質(zhì)，其中酮類物質(zhì)、萜烯類物質(zhì)、酯類物質(zhì)等含量相對較高[6]；Honkanen等在樹莓果實中分離出75種揮發(fā)性物質(zhì)[7]。20世紀末，電子鼻技術(shù)出現(xiàn)，可無損快速檢測果實香氣，重復性良好，應用價值較高[8-9]。

目前，使用電子鼻檢測果實成熟度和果實腐爛情況相關(guān)報道較多[10-11]。羅楓等分析得出，電子鼻法可用于區(qū)分不同貨架期櫻桃[12]；Defilippi等研究表明，電子鼻法可分析杏果實揮發(fā)性物質(zhì)在不同成熟度和貯存期差異[13]；嚴娟等利用電子鼻法評價桃果實香氣種質(zhì)資源[14]。目前，采用電子鼻研究樹莓，僅有對其果實發(fā)酵產(chǎn)品和籽油揮發(fā)性物質(zhì)分析。師艷秋等研究紅樹莓發(fā)酵酒香氣成分，鑒定出54種化合物[15]；劉麗娜等采用電子鼻從紅樹莓籽精油中檢測出40種揮發(fā)性成分[16]。利用電子鼻法評價樹莓種質(zhì)資源香氣成分研究尚未見報道。

本研究利用電子鼻技術(shù)，測定樹莓不同品種及同一品種不同發(fā)育時期果實香氣成分，以期為樹莓果實香氣成分提供快速、便捷的檢測方法，為提高樹莓栽培技術(shù)措施提供指導，為培育香氣濃郁的樹莓品種選育提供數(shù)據(jù)資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料來自東北農(nóng)業(yè)大學向陽農(nóng)場樹莓種質(zhì)資源圃，共計36個品種，品種特性見表1，采集成熟期果實用于試驗。此外，選取品種‘卡羅琳’不同發(fā)育時期果實測定香氣成分。不同發(fā)育時期果實采摘標準參考文獻[17]：將同一天開花樹莓果實作標記，共標記60朵，每7 d對標記果實進行采樣，分別為綠果期1、綠果期2、白果期、轉(zhuǎn)色期、成熟期、過熟期。

表1 樹莓品種資源簡要特性Table 1 Brief characteristics of raspberry varieties

1.2 電子鼻檢測

試驗采用PEN 3.5型金屬氧化物傳感器型電子鼻，具有10個金屬氧化物氣體傳感器陣列，結(jié)果見表2。

表2 PEN 3.5電子鼻傳感器敏感物質(zhì)Table 2 Substances sensitive to electronic nose PEN 3.5 sensors

將10 g樹莓果實置于20 mL螺口頂空瓶中，于25℃靜置30 min測定數(shù)據(jù)，重復3次。電子鼻測定參數(shù)參考文獻[18]稍作修改。當電子鼻傳感器接觸到樹莓果實香氣物質(zhì)后，電導率G發(fā)生改變，相對電導率（G/G0或G0/G）也隨之變化。如果G/G0或G0/G接近1或等于1，表示果實中傳感器相對應香氣種類含量較低，反之，相對電導率值越偏離1，說明傳感器所對應香氣物質(zhì)含量越高。響應值一般在55~60 s趨于平緩，檢測數(shù)值較為準確，選擇此時段響應值進行統(tǒng)計分析[14]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用PEN 3.5自帶軟件WinMuster和IBM SPSS Statistics 22分析數(shù)據(jù)。分析方法為主成分分析（Principal components analysis，PCA）、線性判別分析（Linear discriminant Analysis，LDA）和傳感器區(qū)分貢獻率分析（Loadings，LO）。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹莓果實芳香特征電子鼻響應圖

對樹莓果實香氣物質(zhì)作電子鼻檢測分析，獲得10個傳感器響應圖（見圖1）。圖中曲線代表樹莓果實中香氣成分通過傳感器時，G/G0或G0/G隨檢測時間變化情況。由圖1可看出，檢測物質(zhì)還未進入傳感器時，相對電導率數(shù)值均在1附近，當香氣物質(zhì)進入電子鼻，隨被檢測氣體在傳感器表面積累，相對電導率數(shù)值不斷變化，最后達到平緩狀態(tài)。電子鼻中每一個傳感器均對樹莓香氣物質(zhì)成分響應明顯，但響應值有差異。對比36個樹莓品種果實香氣物質(zhì)響應圖可看出，W1S（烷類）、W2S（檢測醇，部分芳香族化合物）、W3C（氨，芳香分子）、W6S（氫化物）相對電導率值較其他傳感器響應值更高。

圖1 傳感器對樹莓品種‘卡羅琳’香氣響應Fig.1 Graph of sensor response to the aroma of raspberry variety‘Caroline’

2.2 樹莓品種資源香氣物質(zhì)PCA分析

圖2中每個圓形區(qū)域代表一種樹莓果實數(shù)據(jù)采集點。在PCA分析中，第一和第二主成分貢獻率分別為97.46%和1.34%，總貢獻率為98.80%。在電子鼻PCA分析中，重疊區(qū)域越大說明品種間香氣物質(zhì)越相似，從圖2可看出，除‘卡羅琳’和‘黑樹莓’兩品種重疊，‘菲爾杜德’和‘Метеор’區(qū)域間重疊較大外，其余品種間或重疊較小，或完全分開。

圖2 樹莓各個品種PCA分析Fig.2 PCA analysis for various varieties of raspberry

進一步分析得到每個品種與其他供試品種平均區(qū)分度值均在98%以上（見表3），說明不同品種在香氣物質(zhì)含量及組成之間存在較大差異。

表3 不同樹莓品種間香氣物質(zhì)平均區(qū)分度Table 3 Average discrimination of aroma substances among different raspberry varieties

2.3 不同類型品種、不同果實發(fā)育期樹莓香氣物質(zhì)LDA分析

LDA分析是在PCA分析基礎上對傳感器響應樹莓果實香氣成分的優(yōu)化，通過擴大差異更直觀表現(xiàn)不同類型品種、不同果實發(fā)育期樹莓香氣物質(zhì)區(qū)別。

圖3為不同顏色樹莓果實香氣物質(zhì)LDA分析圖，可看出第一和第二主成分貢獻率分別為33.35%和17.05%，總貢獻率為50.40%，僅解釋50%以上變異。根據(jù)第一和第二主成分貢獻率可看出，LDA可根據(jù)香氣物質(zhì)區(qū)分樹莓不同果實顏色。果實顏色與第一主成分貢獻率相關(guān)趨勢較好，隨第一主成分貢獻率延伸至遠端，集中分布于紫樹莓、黃樹莓、紅樹莓、黑樹莓4種果實顏色樹莓品種資源。

圖3 不同果實顏色樹莓品種LDA分析Fig.3 LDA analysis for raspberry with different colors'fruit

根據(jù)PCA分析，黑樹莓與紫樹莓香氣區(qū)分度在70%以上，黑樹莓與黃樹莓區(qū)分度在50%~60%，紅樹莓與紫樹莓、紅樹莓與黑樹莓區(qū)分度在40%~50%，黃樹莓與紫樹莓、黃樹莓與紅樹莓區(qū)分度在30%~40%，表明電子鼻可區(qū)分樹莓果實香氣。

圖4為夏果型和秋果型樹莓品種LDA分析，可看出第一和第二主成分貢獻率分別為79.17%和2.60%，總貢獻率為81.77%，可解釋80%以上變異，根據(jù)第一和第二主成分貢獻率可區(qū)分出不同結(jié)果類型樹莓果實。

圖4 不同結(jié)果類型樹莓品種LDA分析Fig.4 LDA analysis for raspberry of different fruiting types

基于樹莓品種‘卡羅琳’果實不同發(fā)育時期香氣成分LDA判別分析見圖5。

由圖5可看出第一和第二主成分貢獻率分別為64.16%和25.19%，總貢獻率為89.35%，可解釋80%以上變異，雖然白果期和轉(zhuǎn)色期、成熟期和過熟期區(qū)域有部分交叉，但LDA分析可區(qū)分出樹莓果實各發(fā)育時期香氣成分的差異。對不同發(fā)育時期果實傳感器響應值分析可看出，隨果實發(fā)育成熟，硫化合物（W1W）、芳烴化合物及硫有機化合物（W2W）變化小，氮氧化合物（W5S）表現(xiàn)逐漸減少趨勢；芳烴化合物（W1C）、氨及芳香分子（W3C）、氫化物（W6S）、烷類（W1S）、檢測醇及部分芳香族化合物（W2S）、烷類和脂肪族（W3S）表現(xiàn)為先降后升，其中W3C和W3S從綠果期1到白果期表現(xiàn)為下降，W1C、W6S、W1S、W2S從綠果期1到轉(zhuǎn)色期表現(xiàn)為下降，之后到成熟期表現(xiàn)為上升；烯烴及芳族和極性分子（W5C）從綠果期到過熟期逐漸升高（見表4）。

圖5 不同發(fā)育時期果實香氣物質(zhì)LDA分析Fig.5 LDA analysis for aroma substances in raspberry fruits at different development stages

表4 不同發(fā)育時期果實各傳感器響應值Table 4 Sensor response values of raspberry fruits at different development stages

2.4 LO分析傳感器貢獻率

LO分析反映各傳感器在區(qū)分樹莓果實香氣中貢獻大小，一般通過圖中各傳感器位置判斷。在坐標原點（0，0）附近傳感器對樹莓果實香氣分析發(fā)揮作用較小，反之表示作用越大。由圖6可看出，W1S傳感器（烷類）對第一主成分貢獻率最大，W5S傳感器（氮氧化物）對第二主成分貢獻率較大，W2S傳感器（檢測醇，部分芳香族化合物）對第一和第二主成分貢獻率均較大；W3C傳感器（氨，芳香分子）和W6S傳感器（氫化物）對第一主成分貢獻率作用次之，但因第一主成分貢獻率（97.46%）遠高于第二主成分（1.34%），因此認為傳感器貢獻率高低依次為傳感器W1S（烷類化合物）、W2S（檢測醇和部分芳香族化合物）、W3C（烷類和脂肪族）和W6S（氫化物），與36個品種傳感器響應結(jié)果相符合，因此可利用以上4個傳感器結(jié)果評價樹莓果實香氣。而傳感器W1W（硫化合物）、W1C（芳烴化合物）、W5C（烯烴，芳族，極性分子）、W3S（烷類和脂肪族）和W2W（芳烴化合物，硫的有機化合物）響應值在（0，0）附近，因此對香氣物質(zhì)貢獻率最小，對PCA、LDA分析發(fā)揮作用也較小。

圖6 不同品種樹莓LO分析Fig.6 Loadings analysis of different raspberry varieties

3 討論

3.1 電子鼻法評價樹莓果實香氣

電子鼻技術(shù)方便便捷，對香氣物質(zhì)品鑒重復性較好。目前，電子鼻技術(shù)在果實檢測應用主要集中在果實成熟度和采后貯藏品質(zhì)變化評估，例如，蔣鑫妹利用電子鼻有效識別歐李果實是否需要催熟[19]；馬蒙蒙等試驗表明，利用電子鼻可對貨架期蘋果果實香氣物質(zhì)變化情況進行分析，且對不同品種區(qū)分效果較好[20]；嚴娟等將其應用于桃果實香氣資源評價，結(jié)果表明桃果實生育期對香氣物質(zhì)影響顯著，不同肉質(zhì)顏色桃果實之間香氣物質(zhì)差異不顯著[14]。本研究利用電子鼻法評價不同樹莓品種果實香氣物質(zhì)，LDA分析可區(qū)分夏果型和秋果型不同結(jié)果類型樹莓品種資源以及不同發(fā)育時期果實香氣，可區(qū)分紅樹莓、黃樹莓、紫樹莓、黑樹莓不同顏色樹莓果實香氣，說明電子鼻法可用于判別不同成熟度樹莓果實香氣，也可初步評價樹莓種質(zhì)資源香氣成分。

3.2 關(guān)于不同類型樹莓品種資源香氣評價

夏果型樹莓品種約在2年生枝條上結(jié)果，黑龍江省結(jié)果時間一般在7月上中旬至8月上旬，秋果型品種約在1年生枝條上結(jié)果，結(jié)果時間一般為8月下旬至10月初。LDA分析可區(qū)分兩種結(jié)果類型品種資源香氣成分，可能與親緣關(guān)系有關(guān)，同種類型品種在雜交中可能利用相同或相近親本；也可能與果實發(fā)育時環(huán)境條件有關(guān)，由于生長環(huán)境有差異，兩種果實在不同季節(jié)成熟，奚昕琰等研究表明，葡萄成熟期受溫度影響較大，果實中香氣物質(zhì)變化規(guī)律存在明顯差異，說明溫度影響果實中香氣物質(zhì)形成[21]；席萬鵬等通過對桃果實進行套袋處理，發(fā)現(xiàn)不同處理后桃果實香氣物質(zhì)差異明顯，說明光照也可影響果實中香氣物質(zhì)形成[22]。LDA分析可區(qū)分不同顏色樹莓果實香氣，檢測發(fā)現(xiàn)黑樹莓和紫樹莓香氣成分區(qū)分度最大，達70%，紅樹莓和黃樹莓香氣物質(zhì)有部分交叉，區(qū)分度為30%~40%。紅樹莓品種主要來自于歐洲紅樹莓（R.idaeusL.），黃樹莓是其變種；黑樹莓來自于北美洲R.occidentalisL.，紫樹莓則來自于R.neglectusPeck.。紅樹莓、紫樹莓和黑樹莓分屬于不同種類，親緣關(guān)系較遠，香氣物質(zhì)差異較大，而黃樹莓是紅樹莓變種，二者果實香氣物質(zhì)相似度更高。

3.3 關(guān)于樹莓果實特征香氣物質(zhì)

果實中芳香物質(zhì)成分復雜，主要為酯類、醛類、萜類等，其次是醇類、酮類及其他揮發(fā)性物質(zhì)。樹莓果實中現(xiàn)已鑒定芳香成分有200多種，關(guān)于香氣種類有不同觀點。Sakai等和Lou等研究認為樹莓酮為決定樹莓香氣的主要成分[23-24]，竇泓喆則認為樹莓主要香氣成分為β-紫羅酮，占樹莓香氣成分80%~90%[25]。Ravid等認為樹莓果實中特征香氣物質(zhì)為α-紫羅酮和質(zhì)癸內(nèi)酯[26]；陳樂天則認為芳樟醇、α-紫羅酮、β-紫羅蘭酮3種物質(zhì)相對含量較高，可占總含量20%[27]。

樹莓果實發(fā)育期一般30~40 d，可分為綠果期、白果期、轉(zhuǎn)色期、成熟期和過熟期，從轉(zhuǎn)色期至成熟期變化明顯，果實迅速軟化著紅，表現(xiàn)出品種特有香氣。本研究結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)色期到成熟期，樹莓果實香氣物質(zhì)相對含量顯著增加，其中芳烴化合物、氨及芳香分子、烷類、檢測醇及部分芳香族化合物、烯烴及芳族和極性分子尤為明顯，推測成熟前增加這些香氣物質(zhì)對樹莓芳香特征具有更大決定作用。因此，在栽培管理方面，應加強對成熟期前樹莓管理，例如噴施葉面肥等，有利于促進果實生長發(fā)育，提高樹莓果實品質(zhì)，增加樹莓果實香氣程度。

電子鼻優(yōu)點簡單實用，但一般無法對物質(zhì)進行定性定量分析，需結(jié)合其他方法分析果實中香氣物質(zhì)，例如氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）等手段測定樹莓果實特征香氣物質(zhì)，明確不同類型樹莓品種香氣成分及果實香型，為樹莓栽培和加工產(chǎn)業(yè)中品種選擇提供依據(jù)，也為樹莓香氣育種提供數(shù)據(jù)資源。

4 結(jié)論

電子鼻對供試樹莓品種香氣成分均有響應，傳感器貢獻率高低為W1S（烷類化合物）、W2S（檢測醇和部分芳香族化合物）、W3C（氨，芳香分子）和W6S（氫化物）；PCA分析表明不同樹莓品種在香氣物質(zhì)含量及組成之間存在較大差異；LDA分析可區(qū)分不同結(jié)果類型樹莓品種、不同發(fā)育時期果實香氣，區(qū)分不同顏色樹莓果實香氣；果實成熟期前相對含量顯著增加，其中芳烴化合物、氨及芳香分子、烷類、檢測醇及部分芳香族化合物、烯烴及芳族和極性分子尤為明顯。