邢珍聞，師改霞，張新宇，畢潤澤，王佳晨，王慧芳，宋永波

（太原工業(yè)學(xué)院化學(xué)與化工系，山西 太原 030008）

引言

黃酮類化合物是一類在自然界廣泛分布的多酚類物質(zhì)，是強抗氧化劑，具有清除自由基、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、抗病毒和調(diào)節(jié)免疫等功能，因此具有很廣泛的應(yīng)用前景[1-3]。艾葉燃燒后產(chǎn)生的灰燼（即艾灰），在治療腳氣、祛痘、止血、除味、消炎殺菌等方面有極大的功效[4-5]。實驗結(jié)果表明，艾絨經(jīng)不完全燃燒后，雖大部分有機物都被分解，但其中仍含有部分黃酮[6]，因此，艾灰的提取物還有抗氧化和清除自由基的作用，可抗癌、抗衰老，對艾灰抗氧化活性物質(zhì)的研究和利用是有待開發(fā)的課題。本文通過研究不同發(fā)酵工藝對艾灰中黃酮含量的影響，以提高艾灸產(chǎn)物的利用率。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

數(shù)控超聲波清洗器，KQ-1OODE 型，昆山市超聲儀器有限公司；循環(huán)水真空泵，SHZ-DⅢ型，鞏義市予華儀器有限公司；752 紫外可見分光光度儀，上海菁華科技儀器有限公司；電子天平，F(xiàn)A2104 型，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；壓力蒸汽滅菌鍋，上海力振科技；恒溫振蕩器，HZQ-X100A 型。

艾灰；無水乙醇；牛肉膏；蛋白胨；氯化鈉；酵母菌。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酮標準曲線的繪制

本實驗根據(jù)董雨卓、趙馨怡等在文獻[7]中的方法，用亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法測定，得到黃酮標準曲線方程[見式（1）]，線性范圍：0 mg/mL～0.04 mg/mL，R2=0.992 8。

1.2.2 黃酮的提取

用電子天平準確稱量1.0 g 過篩后的艾灰粉末，倒入50 mL 圓底燒瓶，加入體積分數(shù)為30%的乙醇53 mL，超聲30 min 后再在90 ℃水浴中加熱1 h，趁熱過濾，棄去濾渣，溶液轉(zhuǎn)移到100 mL 容量瓶中定容。

1.2.3 發(fā)酵

取40 mL 黃銅提取液和40 mL 營養(yǎng)肉湯于250 mL錐形瓶中調(diào)節(jié)pH=5，塞上棉花包上報紙放在高溫滅菌鍋里滅菌1 h 后取出，然后冷卻至室溫，用移液槍取1.5 mg 酵母菌菌液進行接種，最后放在37℃的恒溫培養(yǎng)箱中培育3 d。

1.2.4 黃酮含量測定方法

取1 mL 提取液于50 mL 容量瓶中，向其中加入50%的乙醇10 mL，加入5%的亞硝酸鈉溶液1.0 mL，靜置5 min 后，再加入10%的硝酸鋁溶液1.0 mL，靜置5 min，最后加入4.0 mL 10%的氫氧化鈉溶液，用50%的乙醇定容至刻度線處。同時配置除了提取液之外的試劑作空白對照，在510 nm 下測吸光度，由方程計算黃酮得率，再計算出黃酮含量[見式（2）]。

式中：C 為測定樣品液的質(zhì)量濃度，g/mL；V 為測定樣品液的體積，mL；Q 為待測液的稀釋倍數(shù)；W 為艾灰粉末的質(zhì)量，g。

1.2.5 單因素實驗

接種量：準確稱取1 g 艾灰，進行黃酮的提取，后在提取液中加入15 mL 無菌水，用5%的HCl 將其pH調(diào)節(jié)到5，準備5 份。隨后用移液槍分別加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg 不同接種量的酵母菌培養(yǎng)菌液在37 ℃的條件下進行培養(yǎng)，發(fā)酵3 d 后將其取出并進行測量，并計算黃酮含量。

溫度：準確稱取1 g 艾灰后，進行黃酮的提取，后在提取液中加入15 mL 無菌水，用5%的HCl 將其pH 調(diào)節(jié)到5，準備5 份。隨后用移液槍加入分別在20、25、30、35、40 ℃的條件下進行培養(yǎng)，發(fā)酵3 d 后將其取出并進行測量，并計算黃酮含量。

發(fā)酵天數(shù)：準確稱取1 g 艾灰后，進行黃酮的提取，后在提取液中加入15 mL 無菌水，用5 %的HCl將其pH 調(diào)節(jié)到5，準備5 份。隨后用移液槍加入前面確定的最佳酵母菌接種量，在前面確定的最佳溫度條件下進行培養(yǎng)，分別發(fā)酵1、2、3、4、5 d 后將其取出并進行測量，并計算黃酮含量。

料液比：用天平稱取1 g 艾灰后，進行黃酮的提取，準備5 份后分別在提取液中加入10、15、20、25、30 mL 的無菌水，用5%的HCl 將其pH 調(diào)節(jié)到5。隨后用移液槍加入前面確定的最佳酵母菌接種量，在前面確定的最佳酵母菌接種量、發(fā)酵溫度和天數(shù)條件下培養(yǎng)，并計算黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量對黃酮含量的影響

由圖1 看出，當接種量小于1 mg 時，隨著接種量的增大，含量也隨之增大，當接種量大于1 mg 時，含量明顯降低，是由于酵母菌數(shù)量逐漸增多而達到過飽和狀態(tài)，從而將黃酮分解利用，降低了其抑制率與含量[8]。故接種量以1 mg 為宜。

圖1 接種量對艾灰黃酮含量的影響

2.2 溫度對黃酮含量的影響

由圖2 看出，當溫度小25 ℃時，隨著溫度的升高，含量也隨之增大，當溫度大于25 ℃時，含量明顯降低，原因是酵母菌在此溫度下時的活性最高，但在高于或低于此溫度下，酵母菌的生長會受到影響從而導(dǎo)致黃酮含量與其抑制率的降低[9]。故溫度以25 ℃為宜。

圖2 溫度對艾灰黃酮含量的影響

2.3 發(fā)酵天數(shù)對黃酮含量的影響

據(jù)圖3 可以看出，在發(fā)酵天數(shù)小于3 d 時，抑制率和黃酮含量穩(wěn)步增加，但到第4 天開始出現(xiàn)明顯的下降，原因是由于發(fā)酵天數(shù)太長導(dǎo)致微生物數(shù)量出現(xiàn)過飽和狀態(tài)，黃酮被分解利用，從而降低了黃酮含量。從而使發(fā)酵時間對抑制率的影響出現(xiàn)了降低的趨勢。因此發(fā)酵天數(shù)為3 d。

圖3 發(fā)酵天數(shù)對艾灰黃酮含量的影響

2.4 料液比對黃酮含量的影響

據(jù)圖4 可以看出，當料液比小于1∶15 時，隨著料液比的升高，含量也隨之增大，當料液比大于1∶15 時，含量明顯降低，說明隨著溶劑量的逐漸增大，溶劑的浸潤作用使得黃酮類化合物溶出量增大，但當溶劑量超過原料15 倍以后過量的溶劑會使其他雜質(zhì)溶出[9]，故料液比以1∶15 為宜。

圖4 料液比對艾灰黃酮質(zhì)量分數(shù)的影響

3 結(jié)論

本文通過單因素實驗，確定的艾灰黃酮提取液適宜發(fā)酵條件為：發(fā)酵天數(shù)3 d、接種量1.0 mg、溫度25 ℃、料液比1∶15，其中的黃酮含量最高可達48.8%。實驗證明，發(fā)酵對提高提取液中的黃酮含量具有重要作用，經(jīng)發(fā)酵后艾灰中的黃酮含量得到了顯著提高，其活性也明顯增強，因此，研究其抗氧化等活性將是下一步需要做的工作。