巫 艷，周云瑩，朱璽燊，張力敏，SAUBANMUSA Jibril，楊志兵，王 一，李成云

(云南農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院，云南生物資源保護與利用國家重點實驗室，云南 昆明 650201)

植物是地球上有機物最主要的初級生產(chǎn)者，其葉際和根際為多種微生物(包括細菌、真菌、古菌、原生生物、線蟲和病毒)的生長和繁殖提供了全球分布最廣和十分獨特的棲息地[1]。這些微生物可與植物形成結(jié)構(gòu)和組成復雜并處于動態(tài)變化的功能共生體(pholobiont)[2]。與人類腸道中的微生物組類似，植物微生物組對植物的生長、繁殖和健康發(fā)揮著重要作用，被看作植物的第二基因組或延伸的基因組[3]。植物微生物組包括植物表面微生物(epiphyte)和內(nèi)生菌(endophytes)，其中植物內(nèi)生菌作為植物微生物組居住在植物組織內(nèi)的子集，與植物的相互依賴性更為密切?？膳囵B(yǎng)性的內(nèi)生菌可用于評價其活體內(nèi)外的代謝和功能，也可用于直接評價微生物組成員之間的互作及其對寄主功能的影響，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)藥領域都備受關注。

植物內(nèi)生菌能夠在所有可接觸到的植物組織中定植，一些成員能夠通過氣孔和水孔直接浸染植物組織內(nèi)部，一些則從受傷組織(包括刺吸式昆蟲傳播)進入植物維管組織并形成生物被膜黏附在植物的木質(zhì)部和韌皮部等不同部位[4]，但這些生活于健康植物各種組織和器官內(nèi)的微生物無論是生活史的某一階段或全部階段均不會對植物產(chǎn)生明顯的負面影響[5]。起初主要采用可培養(yǎng)法研究內(nèi)生菌，隨著高效低成本的第二代DNA 測序技術(next-generation sequencing，NGS)的進步，結(jié)合多組學技術和生物信息學的發(fā)展，各種生境的微生物“暗物質(zhì)”被逐步揭示，并通過不斷提高的時空分辨率揭示微生物組的結(jié)構(gòu)和功能多樣性[6]。截至目前，能夠分離并進行可培養(yǎng)的微生物僅占環(huán)境微生物的0.1%～1.0%[7]，隨著培養(yǎng)組學技術的不斷進步，可培養(yǎng)的微生物數(shù)量將快速更新。本研究對單、雙子葉植物內(nèi)生菌已有文獻進行統(tǒng)計整理，分析單、雙子葉植物內(nèi)生菌的多樣性，并概括植物微生物組在病害防治中的應用，以期為植物內(nèi)生菌的深入研究提供理論參考。

1 單、雙子葉植物內(nèi)生菌的多樣性

1.1 單、雙子葉植物內(nèi)生菌的群落組成

已有研究顯示：所有植物中都存在內(nèi)生菌，且在植物的根、莖、葉、花、果實、種子等各種器官中都有分布[8]。早期對雙子葉植物內(nèi)生菌的研究更多地集中在經(jīng)濟或藥用植物，而對單子葉植物內(nèi)生菌的研究主要集中于禾本科作物和草地植物。宏基因組學研究的結(jié)果表明：植物微生物組的多樣性遠超預期，推測其總數(shù)達到數(shù)百萬種[6]。CITLALI 等[9]、ZARRAONAINDIA 等[10]和HAMONTS 等[11]對仙人掌科植物、葡萄和甘蔗等不同類型植物的研究發(fā)現(xiàn)：植物內(nèi)生細菌群落主要以變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)為主，二者合計占比高達60%以上[1]。

對雙子葉植物內(nèi)生菌的文獻進行檢索、統(tǒng)計和分析，結(jié)果顯示：有124 種雙子葉植物通過可培養(yǎng)法分離內(nèi)生細菌，其內(nèi)生細菌群落主要以變形菌門、放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門為主，擬桿菌門(Bacteroidetes)占比較小(圖1a)；有65 種，單子葉植物通過可培養(yǎng)法分離內(nèi)生細菌，且主要以放線菌門和變形菌門為主，而擬桿菌門和厚壁菌門占比較小(圖1b)。通過可培養(yǎng)法分離內(nèi)生真菌的雙子葉植物有65 種，單子葉植物有40 種，且均以子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)及半知菌亞門(Deuteromycotina)為主(圖1c 和圖1d)。

圖1 雙子葉植物和單子葉植物的內(nèi)生菌進化樹Fig.1 Evolutionary tree of endophytes in dicotyledons and monocotyledons

1.2 單、雙子葉植物內(nèi)生菌種類的分布特點

對檢索到的單子葉植物和雙子葉植物內(nèi)生菌相關文獻進行進一步分析發(fā)現(xiàn)：門水平上，細菌以變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門為主，真菌以子囊菌門和擔子菌門為主。屬水平上，單子葉植物和雙子葉植物共有的內(nèi)生細菌有221 屬，其中，假單胞菌屬(Pseudomonas)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、泛菌屬(Pantoea)、腸桿菌屬(Enterobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和類諾卡氏菌屬(Nocardioides)的分離頻率較高；單子葉植物和雙子葉植物共有的內(nèi)生真菌有75 屬，其中，鏈格孢屬(Alternaria)、鐮刀菌屬(Fusarium)、曲霉屬(Aspergillus)、絲核菌屬(Rhizoctonia)、青霉屬(Penicillium)和木霉屬(Trichoderma)的分離頻率較高。從統(tǒng)計結(jié)果來看，雙子葉植物有細菌345 屬、真菌229 屬，單子葉植物有細菌536 屬、真菌270 屬，單子葉植物中的內(nèi)生菌種類較多。

本研究統(tǒng)計得到單子葉和雙子葉植物的內(nèi)生菌共計細菌495 種(分屬175 屬)、真菌273 種(分屬199 屬)。由表1 可知：單子葉植物特有內(nèi)生細菌的寄主主要是禾本科作物，如水稻、玉米和香蕉等；雙子葉植物特有內(nèi)生細菌的寄主多集中于草本植物，如苜蓿、大車前和月見草等。單子葉和雙子葉植物共有的內(nèi)生細菌寄主分布范圍最廣的前10 屬內(nèi)生細菌分別是鞘氨醇單胞菌屬、鏈霉菌屬、黃單胞菌屬、根瘤菌屬、假單胞菌屬、泛菌屬、類諾卡氏菌屬、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、歐文氏菌屬(Erwinia)和芽孢桿菌屬，其中鞘氨醇單胞菌屬分布于30 多種植物，鏈霉菌屬分布于80 多種植物，假單胞菌屬分布于30 多種植物，這些內(nèi)生細菌廣泛分布于禾本科植物以及一些藥用植物，表明這些種類能夠適應多種植物形成的生態(tài)位。隨著研究的深入，其寄主植物的種類可能會增加。

表1 單子葉植物和雙子葉植物特有的寄主范圍分布最廣的前10 屬內(nèi)生細菌Tab.1 Top 10 endophytic bacteria genus with the widest host range distribution specific to monocotyledons and dicotyledons

由表2 可知：單子葉植物特有的內(nèi)生真菌主要分布于禾本科和蘭科植物，如剪股穎和小麥等；雙子葉植物特有的內(nèi)生真菌主要分布于一些藥用草本植物，如桃兒七、小連翹和重陽木等。單子葉和雙子葉植物共有寄主分布較廣的前10屬內(nèi)生真菌為鏈格孢屬、青霉屬、曲霉屬、出芽短梗霉屬(Aureobasidium)、被孢霉屬(Mortierella)、擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)、絲核菌屬、擬莖點霉屬(Phomopsis)和隱球菌屬(Cryptococcus)，其中，青霉屬、鏈格孢屬和曲霉屬的寄主植物達20 多種，包括禾本科植物和喬木等。

表2 單子葉和雙子葉植物特有的寄主范圍分布最廣的前10 屬內(nèi)生真菌Tab.2 Top 10 endophytic fungal genus with the widest host range distribution specific to monocotyledons and dicotyledons

1.3 單、雙子葉植物中不同部位的內(nèi)生菌差異

植物的不同部位(根、莖、葉和種子)都能分離得到內(nèi)生菌，且不同部位的內(nèi)生菌在結(jié)構(gòu)與數(shù)量上存在差異。內(nèi)生菌主要從植物的根部向地上部分運輸，因此，根部的內(nèi)生菌數(shù)量最多，莖、葉中的內(nèi)生菌數(shù)量較少[12]。通過對可培養(yǎng)法和免培養(yǎng)法獲得的雙子葉植物內(nèi)生菌在各個部位的分布情況進行分析發(fā)現(xiàn)，各部位的內(nèi)生菌在門水平上主要以變形菌門、放線菌門和厚壁菌門為主(圖2)。在屬水平上，根部有內(nèi)生細菌271 屬，莖部有258 屬，葉部有227 屬，種子有123 屬；根部有內(nèi)生真菌143 屬，莖部有140 屬，葉部有126 屬，種子有16 屬。根、莖、葉和種子共有的內(nèi)生細菌和內(nèi)生真菌分別為66 和12 屬，表明能適應不同生態(tài)位的內(nèi)生細菌更多一些。

圖2 雙子葉植物中內(nèi)生菌在各部位的分布情況Fig.2 Distribution of endophytes in dicotyledons at various sites

由圖3 可知：單子葉植物根、莖、葉和種子的內(nèi)生細菌主要為變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門。在屬水平上，根部有內(nèi)生細菌285 屬，莖部有349 屬，葉部有119 屬，種子有69 屬；根、莖、葉和種子中的內(nèi)生真菌分別有125、139、56 和46 屬。根、莖、葉和種子共有的內(nèi)生細菌和內(nèi)生真菌分別為32 和8 屬。真菌和細菌在不同部位的分布特點與雙子葉植物相似。

圖3 單子葉植物中內(nèi)生菌在各部位的分布情況Fig.3 Distribution of endophytes in monocotyledons at various sites

已有研究表明：多數(shù)內(nèi)生菌具有宿主專一性和組織專一性，可能是由于不同的內(nèi)生菌具有利用不同基質(zhì)的能力，從而決定內(nèi)生菌具有不同的生活方式[13]。同時，在不同宿主植物中內(nèi)生菌的種類也不同，且同一宿主植物內(nèi)生菌的數(shù)量和種類會隨植物發(fā)育的齡期及植株不同部位而變化[14]。在單子葉和雙子葉植物中，不同部位微生物的分離頻率不同，如芽孢桿菌屬、假單胞菌屬和鞘氨醇單胞菌屬等在根中的分離頻率高于莖、葉及種子，且數(shù)量最多，這些微生物以提高植物的生物和非生物逆境抗性為主要特點，通過抑制病原微生物的生長而促進植物健康生長，減輕作物的干旱、熱和鹽脅迫等[11]。在花生的不同器官中發(fā)現(xiàn)：其根部內(nèi)生菌的多樣性最高，其次是莖和葉，而花部所含的內(nèi)生細菌種類最少[15]。一些

植物共有內(nèi)生菌如芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬和鞘氨醇單胞菌屬等數(shù)量相對較多，這些菌存在于植物的不同部位，說明其能適應植物的不同生態(tài)位。通過可培養(yǎng)法和免培養(yǎng)法獲得的內(nèi)生細菌和內(nèi)生真菌，從其不同部位分布情況來看，不同類群在不同部位的占比有所差異，這是由于不同部位有其獨特的生態(tài)位，不同的生態(tài)位會選擇性地過濾或招募特定的微生物類群，從而與寄主植物互作形成穩(wěn)定的共存群落[16]。

通過上述分析發(fā)現(xiàn)：不同內(nèi)生菌在不同寄主中存在一定差異，一些內(nèi)生菌能夠適應多種寄主植物，特別是青霉屬、鏈格孢屬、曲霉屬、鞘氨醇單胞菌屬、鏈霉菌屬和黃單胞菌屬等內(nèi)生菌能夠跨界適應單子葉和雙子葉植物，這類內(nèi)生菌是今后建立植物與微生物互作模型的優(yōu)選物種，可通過這些物種更好地分析內(nèi)生與外生的轉(zhuǎn)換機制以及內(nèi)生菌與附生菌的互作及其對寄主植物的影響，也可以更好地揭示寄主植物對內(nèi)生菌和附生菌的調(diào)控機制。

2 植物內(nèi)生微生物組在病害防治中的應用

與植物病害發(fā)生關系一直是植物內(nèi)生微生物組研究的熱點問題之一。植物病害的發(fā)生無疑會影響植物內(nèi)生微生物組的變化，使患病植株與健康植株的微生物組存在顯著差別。GAO 等[17]通過對健康與患病辣椒(Capsicum annuumL.)各個部位微生物群落開展系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)：健康與患病植物的群落組成、構(gòu)建、共現(xiàn)網(wǎng)絡以及功能都存在差異。

2.1 植物內(nèi)生微生物組與植物病害的關系

將番茄抗青枯病菌(Ralstonia solanacearum)品種與感病品種相比，抗病品種根際中含有更豐富的黃桿菌(Flavobacterium)基因組；與感病菜豆品種相比，抗尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)的菜豆品種微生物組中假單胞菌(Pseudomonadaceae)和芽孢桿菌(Bacillaceae)的豐度較高，其根際的抗真菌活性明顯增高。這些研究結(jié)果表明根際微生物是寄主抗病性的重要組成部分。一些植物還會在受到脅迫后向微生物“呼救”[18]，快速招募有益微生物對抗有害生物。植物也可以通過改變其基因表達模式，在其根際分泌有益于微生物的次生代謝產(chǎn)物，如擬南芥可通過提高根特異的轉(zhuǎn)錄因子MYP72 和β-葡萄糖苷酶編碼基因PGLU42的表達水平，調(diào)節(jié)合成并分泌香豆素抑制病原菌，促進根際細菌繁殖，同時提高寄主的誘導系統(tǒng)抗性。內(nèi)生微生物組成員之間還會通過聯(lián)合行動共同抵御病原菌，如當擬南芥受到白粉病菌(Hyaloperonospora arabidopsidis)侵染后，黃單胞菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)和微桿菌屬(Microbacterium)的細菌豐度會同時顯著增加，將這些微生物的復合物活體接種到擬南芥中，可促進擬南芥抗病。

微生物之間的互作分析可進一步揭示內(nèi)生微生物組的變化與病害發(fā)生的直接關系。受粉狀白粉菌(Erysiphe alphitoides)感染的橡樹(Quercus robur)微生物組中，白粉病菌與許多微生物，尤其是與細菌之間都呈相互抑制或競爭的對立關系[19]，這反映出病原菌侵染會打破植物體內(nèi)微生物群的穩(wěn)態(tài)，使微生物之間的互作關系發(fā)生改變，也暗示適時地強化與病原菌有強烈抑制作用的微生物種群能夠有效抑制病原菌生長和繁殖的潛力。DURAN 等[20]研究證明：植物微生物組內(nèi)細菌與真菌之間的跨界互作可以達到顯著抑制病原真菌和卵菌種群的數(shù)量，并減輕由后者引發(fā)的植物病害，進一步證明寄主植物可通過調(diào)控微生物之間的關系提高免疫能力，該機制是今后應用微生物進行植物健康管理的關鍵。

2.2 內(nèi)生微生物對抗病原菌的防治機制

內(nèi)生微生物對病原菌的生物防治涉及多種機制，如競爭排斥、抗菌和誘導寄主免疫反應等。其中，誘導寄主對病原菌入侵免疫的機制近年來取得不少新突破，如通過釋放群體猝滅分子誘導寄主產(chǎn)生免疫能力[21]。在大多數(shù)病原菌中，致病性由群體感應的微生物細胞間信號調(diào)節(jié)[22]，如?；呓z氨酸內(nèi)酯(acyl-homoserine lactone，AHL)分子存在于許多革蘭氏陰性細菌和陽性細菌中，主要用于2 種細菌間的信息交流[23]。此外，具有群體淬滅活性的葉際微生物可通過降解廣泛的群體感應信號分子抑制病原菌毒力基因表達，從而抑制病害發(fā)展[24]，如煙草內(nèi)生微生物中發(fā)現(xiàn)的不動桿菌屬、芽孢桿菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysnibacillus)、類香味菌屬(Myroides)、假單胞菌屬和沙雷氏菌屬(Serratia)等[25]就屬于具有群體淬滅能力的細菌屬。

一些微生物產(chǎn)生的揮發(fā)性有機化合物(volatile organic compounds，VOC)能夠幫助寄主提高對病原菌的防御能力。這類植物微生物組成員釋放的VOC 既可以直接抑制植物病原菌，也可啟動植物抗病反應的信號。已證明VOC 中的一些萜類化合物對植物抵御病原菌具有重要的防御作用[26-27]，如出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)菌株L1 和L8 在活體外和活體內(nèi)均可抑制灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatum)和青霉屬等多種病原菌[28]，其潛力值得挖掘。

一些微生物可通過改變抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、過氧化物酶(catalase，POD)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)[29]等抗氧化酶的水平維持寄主植物的系統(tǒng)抗性，如通過加速防御相關酶(β-1,3-葡聚糖酶和POD)的活性促進花生(Arachis hypogaea) IAA 介導針對腐爛病原菌——黑曲霉(Aspergillus niger)的防御反應[30]。

有些微生物具有產(chǎn)生無毒基因產(chǎn)物(如細菌病原菌的III 型分泌物)的代謝能力，而一些微生物則通過產(chǎn)生麥角甾醇、β-葡聚糖和幾丁質(zhì)片段等信號物質(zhì)誘導和增強寄主植物對病原菌的防御能力[31]?？梢?，植物內(nèi)生微生物組中的微生物誘導植物局部和系統(tǒng)反應的機制還包括對特定防御途徑的重編程，如VOC 的產(chǎn)生、群體淬滅、植物抗氧化狀態(tài)的激活和無毒基因產(chǎn)物的產(chǎn)生等。

微生物組內(nèi)的一些成員通過與病原微生物競爭生存空間和營養(yǎng)也能控制植物病害的發(fā)生[32-33]。INNEREBNER 等[33]研究表明：擬南芥植株中的鞘氨醇單胞菌可與丁香假單胞菌競爭果糖、葡萄糖和蔗糖等糖類物質(zhì)，從而限制病原菌生長，但甲基桿菌不能通過利用這些糖類物質(zhì)而達到抑制病原菌生長的目的，這表明對一些病原菌的競爭性驅(qū)逐取決于植物內(nèi)生微生物組中是否存在高度?；母偁幷?。可見，系統(tǒng)分析植物內(nèi)生微生物組對抗病原菌的快速響應機制能夠有效抑制病原菌的侵染和繁殖，進而減少病害的發(fā)生和危害。

3 展望

植物內(nèi)生微生物組是一類應用前景廣闊的資源微生物，植物與植物微生物組的互作研究也將是未來探索物種間互作機制的重要領域。在與宿主植物共生過程中，植物內(nèi)生微生物組對促進植物的生長、提高植物的抗逆能力等表現(xiàn)出巨大潛力，且在醫(yī)藥方面也具有很高的開發(fā)價值。隨著培養(yǎng)組學技術的進步，可培養(yǎng)微生物的種類和比例不斷提高，將為微生物組和植物功能共生體的種群結(jié)構(gòu)、動態(tài)演替和功能研究提供便利。未來研究的重點將聚焦于：結(jié)合可培養(yǎng)與免培養(yǎng)技術，利用可培養(yǎng)的物種建立模型以便于更有效地揭示不可培養(yǎng)微生物的功能；開發(fā)內(nèi)生菌高靈敏度分子標記，精確分析其內(nèi)生與外生的轉(zhuǎn)換開關；內(nèi)生菌與附生菌物質(zhì)流、信息流和能量流及其對寄主植物的影響以及寄主植物對這些微生物種群結(jié)構(gòu)的調(diào)控機制等。

展望未來，在充分揭示功能共生體的基礎上，借助機器學習、人工智能和信息技術探索不同微生物之間互作的多級營養(yǎng)關系以及復雜的互作網(wǎng)絡對寄主的影響，以期在農(nóng)作物育種計劃中設計整體功能協(xié)調(diào)、促進植物健康生長、資源利用效率更高的功能共生體，從而充分發(fā)揮其微生物功能，減少化學品投入和溫室氣體排放，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，這也是研究植物微生物組的主要目標。