焦?jié)捎?，李瓊燕，郭敬瑋，李金璐，肖 倩，王興麗，張 敏，羅 瓊

(云南農(nóng)業(yè)大學(xué)，農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，省部共建云南生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650201)

水稻是全球重要的糧食作物，超過50%的人口以水稻為主食[1]。中國作為農(nóng)業(yè)大國，水稻是最主要的糧食作物之一，每年種植面積約占可耕地面積的1/4～1/3，水稻年產(chǎn)量占全國糧食總產(chǎn)的45%[2-4]。保證水稻產(chǎn)量和質(zhì)量對于糧食安全具有重要意義。近年來，水稻新病害時(shí)有發(fā)生，并有可能上升為主要病害，給水稻生產(chǎn)帶來巨大的潛在威脅[5]。目前僅中國正式記載的水稻病害就多達(dá)70 多種，可損害水稻的根、莖、葉、穗等部位[5-6]。稻瘟病、白葉枯病和紋枯病是目前水稻生產(chǎn)最嚴(yán)重的三大病害，嚴(yán)重威脅中國乃至世界的糧食安全[7-8]。稻瘟菌通過感染水稻的葉片、穗頸和穗引起水稻葉瘟、頸瘟和穗瘟，每年造成的水稻產(chǎn)量損失約10%～30%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)40%～50%[9-10]。由白葉枯病菌引起的水稻白葉枯病每年在亞洲灌溉足和多雨水地區(qū)造成極大的產(chǎn)量損失，如其在日本造成的水稻產(chǎn)量損失約為20%，在流行年份可高達(dá)50%，在熱帶地區(qū)則更為嚴(yán)重[11-12]。水稻紋枯病在中國的發(fā)生逐年加重，其發(fā)病時(shí)期可以橫跨秧苗期至穗期，抽穗期前后為發(fā)病盛期，主要危害葉鞘和葉片，導(dǎo)致每年產(chǎn)量損失10%～20%，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)超過30%[13-15]。

近年來，隨著氣候環(huán)境變化、農(nóng)業(yè)條件改變、水稻新品種推廣以及大量化肥和農(nóng)藥的使用，新的水稻病害發(fā)生增多并趨于嚴(yán)重[16]。2014年，浙江發(fā)生了一種類似水稻白葉枯病的水稻新病害，經(jīng)鑒定其病原為月狀旋孢腔菌(Cochliobolus lunatus)[17]；同年，黃微等[18]報(bào)道了一種由膝曲旋孢腔菌(C.geniculatus)引起的水稻葉鞘黑斑病，在湖南省花垣縣8 個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)約1 000 hm2的稻田內(nèi)發(fā)生；2020 年，安徽省潛山市報(bào)道了一種與稻瘟病癥狀相似的水稻葉片新病害，病斑呈橢圓形沿葉脈發(fā)展，外周黃色暈圈，內(nèi)部黑褐色，發(fā)病部位易折斷，且相繼在安徽潛山、巢湖、宣城、貴池、安慶和合肥等多地發(fā)生[19]。這些病害有可能上升為主要病害，給水稻生產(chǎn)帶來巨大的潛在威脅。然而，對引起這些病害的新病原研究目前還僅局限于發(fā)病癥狀和發(fā)生情況，其對目前生產(chǎn)上大面積推廣和利用的水稻種質(zhì)資源的致病性研究幾乎是空白。

海南是中國水稻育種單位的南繁聚集地，種植水稻材料遺傳多樣性豐富，對病原的進(jìn)化造成了很強(qiáng)的環(huán)境選擇壓力。2018 年，海南陵水南繁基地稻田大面積發(fā)生了一種葉斑病，導(dǎo)致成熟期水稻葉片枯死，嚴(yán)重影響水稻灌漿結(jié)實(shí)。其癥狀與稻瘟病相似，但田間觀察發(fā)現(xiàn)發(fā)病水稻穗頸和谷粒上并無典型的稻瘟病病斑，推測其可能是一種不同于稻瘟病的水稻新病害。為了正確認(rèn)識(shí)該病害，本研究通過單孢分離、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對病原進(jìn)行分類鑒定，對其侵染水稻引起的葉斑癥狀與稻瘟病葉瘟癥狀進(jìn)行比較觀察，并對水稻育種中廣泛研究和利用的抗稻瘟病水稻材料的致病性進(jìn)行鑒定，以期為水稻病害的正確識(shí)別、有效防治及對水稻抗病育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病樣：采自2018 年海南陵水發(fā)病稻田的成熟期水稻葉片病樣若干。

稻瘟菌菌株：GUY11，由福建農(nóng)林大學(xué)王莫教授提供；過表達(dá)綠色熒光蛋白標(biāo)記基因的Zhong-10-8-14，由中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所朱立煌研究員提供。

水稻材料：麗江新團(tuán)黑谷、江南香糯、子預(yù)44、中花11、地谷、谷梅4 號(hào)、豐優(yōu)香占、宜香優(yōu)2115、宜優(yōu)673、兩優(yōu)816、明兩優(yōu)527、明兩優(yōu)829 和楚粳27，均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)、番茄燕麥培養(yǎng)基(TOA)和水瓊脂培養(yǎng)基(WA)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌單孢分離與保存

(1) 病樣保濕培養(yǎng)：取田間采集的葉斑病病樣，病葉切成大小約1 cm×5 cm，于超凈臺(tái)內(nèi)使用75%酒精浸泡洗滌30 s 后再用無菌水清洗3 次，每次30 s，然后放在鋪有扇形濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，病樣表面產(chǎn)生霉層后在光學(xué)顯微鏡下挑取單孢[20]。

(2) 病原菌單孢分離與保存：基本操作參照郭敬瑋等[20]和張君成[21]的方法。于無菌操作臺(tái)內(nèi)使用直徑為1 mm 的無菌毛細(xì)管圓頭從病樣分生孢子梗上輕劃其頂端孢子，采用“Z”字劃線法涂抹在WA 培養(yǎng)基上，在光學(xué)顯微鏡下利用三點(diǎn)定位法確定單孢位置。用滅菌解剖針畫“口”字，挑取只有單孢的瓊脂塊放在添加抗生素的PDA 培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)約3 d，挑取無污染的菌落鋪在約為0.5 cm×0.5 cm 的濾紙片上生長10 d，在無菌超凈臺(tái)內(nèi)用鑷子收集濾紙片，置于滅菌紙袋內(nèi)，烘干后放于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 病原菌鑒定

(1) 形態(tài)鑒定：將分離的病原菌濾紙片活化4 d后接種到PDA 培養(yǎng)基上，生長3～4 d 后用打孔器打菌餅轉(zhuǎn)接到新的PDA 培養(yǎng)基上，于28 ℃黑暗培養(yǎng)5 d 后觀察菌落的培養(yǎng)性狀。用接種針摳取少量菌落外圈菌絲體于PDB 培養(yǎng)基，搖瓶培養(yǎng)4 d后用移液槍吸取1.4 mL 菌液于TOA 產(chǎn)孢培養(yǎng)基上，在28 ℃、12 h 光照/12 h 黑暗條件下交替培養(yǎng)4 d；使用滅菌刀片挑取分生孢子梗，用1 mL無菌水沖洗菌落后制片，在熒光顯微鏡(Olympus fluorescent microscope) 10×視野下觀察分生孢子的顏色、形態(tài)、隔膜和大小等特征，參考《農(nóng)業(yè)植物病理學(xué)》[3]對病原進(jìn)行初步鑒定。

(2) 分子鑒定：分離菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d 后，挑取菌落外圈轉(zhuǎn)至PDB 培養(yǎng)基，在28 ℃、180 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)3 d；于無菌操作臺(tái)過濾收集菌絲體，之后放入37 ℃烘箱烘干，將干燥后的樣品液氮研磨成粉末，采用CTAB法提取DNA[22]。采用真菌ITS 通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGT-GAACCTGCGG-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATT-GATATGC-3′)擴(kuò)增ITS 核酸片段。PCR 反應(yīng)體系20 μL，包括ddH2O 14.1 μL、10×Tag Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 1 μL、25 mmol/L ITS1 和ITS4 引物各0.5 μL、10 ng/μL DNA 模板1 μL 和5 U/μLTaqDNA 聚合酶0.4 μL。PCR 程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min，34 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用DNA 純化回收試劑盒回收目的片段，送生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序，將測序結(jié)果與GenBank 中已知序列進(jìn)行比對分析，利用MEGA 7.0 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[23]。

1.2.3 病原致病性的柯赫氏法則驗(yàn)證

按照1.2.2 節(jié)的方法培養(yǎng)病原菌孢子，用無菌水洗下孢子，濾布(Miracloth 475855)過濾后將菌液的孢子密度調(diào)至2×105個(gè)/mL，加入4%的明膠配成孢子懸浮液，將孢子懸浮液混勻后均勻噴灑于3 葉1 心期的水稻材料麗江新團(tuán)黑谷幼苗葉片上，直至葉片上掛滿細(xì)小菌滴。接種后的水稻材料在溫度為28 ℃、濕度為90%的培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培育24 h，之后保持溫度和濕度不變，正常光照(12 h 光照、12 h 黑暗)培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)4和6 d 后觀察水稻發(fā)病情況，并與田間病樣和稻瘟病葉瘟癥狀進(jìn)行比較，重新分離病菌進(jìn)行觀察。

1.2.4 病原菌致病性研究

按照1.2.3 節(jié)的方法，通過苗期噴霧接菌13 個(gè)水稻材料，鑒定其致病性。

1.2.5 病原菌生長特性研究

(1) 病原菌生長速率的測定：使用保存的濾紙片活化菌株于PDA 培養(yǎng)基，用直徑為6 mm的打孔器打菌餅轉(zhuǎn)接到新的PDA 培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)5 d，采用十字交叉法測量菌落直徑，每個(gè)菌株3 次生物學(xué)重復(fù)，結(jié)果取平均值。

(2) 病原菌產(chǎn)孢量的測定：按照1.2.2 節(jié)的方法獲得產(chǎn)病原菌孢子的TOA 培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基中加入5 mL 無菌水并用滅菌后的棉簽輕輕刮洗孢子，將菌液過濾得到分生孢子懸浮液；用10 μL移液槍吸取孢子液并滴于血球計(jì)數(shù)板上，用蓋玻片壓片后于顯微鏡下統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)量，3 次生物學(xué)重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.2.6 病原菌侵染特性研究

(1) 水稻葉鞘離體注射接菌：按照1.2.2 節(jié)的方法獲得病原菌孢子液，并將其孢子密度調(diào)至1×105個(gè)/mL，將混勻的病原菌孢子懸浮液通過移液槍沿著葉鞘底端緩慢注射進(jìn)水稻材料麗江新團(tuán)黑谷的葉鞘中，直至另一端有孢子液滲出，將其小心地放置在倒置的96 孔板凹面處，并在葉鞘下墊濾紙片，隨后將96 孔板放入塑料盆中，噴灑水至濾紙片濕潤，用保鮮膜將盆開口處密封，膜上戳出一些氣孔，覆蓋黑布黑暗培養(yǎng)1 d 后去除黑布，于自然光下進(jìn)行培養(yǎng)。

(2) 病原菌侵染觀察與統(tǒng)計(jì)：分別于接種后3、10、22、34 和48 h 用刀片切取離體葉鞘凸面的內(nèi)膜放在載玻片上，滴甘油后用蓋玻片蓋住，在顯微鏡下觀察孢子的萌發(fā)、附著胞形成和侵染水稻細(xì)胞的過程并拍照。統(tǒng)計(jì)30 個(gè)分生孢子的萌發(fā)、附著胞形成及侵染寄主細(xì)胞的情況，采用SPSS 20 進(jìn)行顯著性分析，采用Excel 2013 制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原鑒定

對發(fā)病田塊采集的葉片病樣(圖1a)進(jìn)行保濕培養(yǎng)和單孢分離，在熒光顯微鏡下觀察到：病原菌分生孢子梗分化明顯，多單生，生長直立，不分枝，呈淺色或半透明，頂部產(chǎn)孢(圖1b)。分生孢子多新月形或屈膝狀，深黑色或褐色，一般具有3 個(gè)隔膜4 個(gè)細(xì)胞，中間2 個(gè)細(xì)胞膨大，多彎曲且顏色較深，孢子大小為20～40 μm×9～17 μm(圖1c)。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，海南水稻葉斑病病原初步鑒定為子囊菌門(Ascomycota)座囊菌綱(Dothideomycetes)格孢腔菌目(Pleosporales)格孢腔菌科(Pleosporaceae)彎孢屬(Curvularia)真菌。

圖1 田間病樣及病原分生孢子梗和分生孢子形態(tài)Fig.1 Field samples and the morphology of pathogenic conidiophore and conidia

通過單孢分離獲得并保存有效單孢菌株30株，編號(hào)為YB1～30，且其菌落形態(tài)相同，即：菌落正面從外向內(nèi)依次為淺黃色、乳白色、淺灰色和褐色輪紋，邊緣整齊，氣生菌絲濃密，菌落背面均呈外圈淺黃色、中圈明黃色、內(nèi)圈黑褐色(圖2a)。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物分析表明：30 株單孢菌株均擴(kuò)增出預(yù)期大小的DNA 條帶(圖2b)。隨機(jī)對3 株菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收和測序，序列比對結(jié)果表明：3 株菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物均為572 bp的相同序列(圖2c)，與GenBank 中新月彎孢(Curvularia lunata，登錄號(hào)：MN180824.1)的序列一致性達(dá)99%，聚類于同一分支(圖3)。經(jīng)形態(tài)學(xué)結(jié)合分子鑒定，確定該水稻葉斑病病原為彎孢屬(Curvularia)真菌新月彎孢(C.lunata)。

圖2 病原菌的菌落形態(tài)和病原中ITS 序列的PCR 產(chǎn)物擴(kuò)增Fig.2 Colony morphology of pathogen and PCR amplification of ITS sequence

圖3 病原菌的ITS DNA 序列進(jìn)化分析Fig.3 Analysis of evolutionary of pathogen by ITS DNA sequences

2.2 病原致病性的柯赫氏法則驗(yàn)證及病害典型癥狀

噴霧接種單孢菌株YB28 的孢子懸浮液后，麗江新團(tuán)黑谷發(fā)病明顯，病斑近圓形或橢圓形，中央棕褐色，外周黃色，沿中脈上下擴(kuò)展，發(fā)病部位易折斷(圖4a)。利用接種后發(fā)病植株葉片進(jìn)行保濕培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)：病原分生孢子梗和分生孢子形態(tài)與海南田間病樣保濕培養(yǎng)的一致，發(fā)病癥狀與田間癥狀相似。上述結(jié)果表明：2018 年春季，海南田間葉斑病害是由新月彎孢菌(C.lunata)引起的。與新月彎孢葉斑病相比，稻瘟病的病斑呈梭形，病斑中央呈灰白色，邊緣褐色，有時(shí)小病斑可連片形成不規(guī)則大病斑(圖4b)。

圖4 接種新月彎孢YB28 和稻瘟菌GUY11 后的水稻葉片病斑Fig.4 Spot on rice leaf inoculated by Curvularia lunata YB28 and Magnaporthe oryzae GUY11

2.3 新月彎孢菌的致病性

新月彎孢菌株YB28 對接種的13 個(gè)水稻材料均表現(xiàn)出強(qiáng)致病性(圖5)，發(fā)病快，接種后2 d葉片上就能觀察到小型病斑，接種后4 d 病斑沿葉脈形成較大的褐色病斑，且發(fā)病部位易折斷。其中，地谷和谷梅4 號(hào)還是水稻育種中廣泛使用的廣譜持久抗稻瘟病水稻資源。

2.4 新月彎孢菌的生物學(xué)特性

2.4.1 生長特性

隨機(jī)選取3 株分離保存的單孢菌株YB8、YB17 和YB28，檢測其在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d的平均生長速率和產(chǎn)孢能力，結(jié)果(圖6)顯示：3 株菌株的生長和產(chǎn)孢能力無明顯差異。上述研究表明：目前田間新月彎孢菌株還沒有多樣性的分化。

圖6 新月彎孢菌的生長速率及產(chǎn)孢能力Fig.6 Growth rate and sporulation ability of C.lunata

2.4.2 侵染特性

由圖7 可知：接種病菌3 h 后，新月彎孢菌株YB28 的芽管萌發(fā)率為50.00%，顯著高于稻瘟菌株GUY11 和Zhong-10-8-14，一些新月彎孢菌分生孢子的芽管可從兩端細(xì)胞萌發(fā)，這與稻瘟菌芽管僅頂端細(xì)胞萌發(fā)長成芽管明顯不同；接種10 h后，YB28 有70.00%的分生孢子芽管頂端膨大形成附著胞，極顯著高于GUY11 和Zhong-10-8-14；接種病菌22 h 后，新月彎孢菌株YB28 形成的附著胞有90.00%穿過寄主表皮形成了初侵染菌絲，顯著高于GUY11和Zhong-10-8-14；接種病菌34 h 后，GUY11 和Zhong-10-8-14 僅分別有55.00%和50.00%初侵染細(xì)胞中的菌絲擴(kuò)展到鄰近細(xì)胞，顯著低于YB28 的75.00%；接種病菌48 h 后，YB28 菌絲已100%從初侵染細(xì)胞擴(kuò)展到多個(gè)細(xì)胞，并出現(xiàn)細(xì)胞死亡的黃褐色斑塊。以上結(jié)果表明：新月彎孢菌與稻瘟菌侵染水稻的方式極為相似，但新月彎孢菌的孢子萌發(fā)、附著胞形成和菌絲擴(kuò)展速率比稻瘟菌快，病程短。

圖7 新月彎孢菌株 (YB28) 和稻瘟菌株 (GUY11 和Zhong-10-8-14) 侵染水稻葉鞘的生物學(xué)過程Fig.7 The biological process of C.lunata (YB28) and M.oryzae (GUY11 and Zhong-10-8-14) infection in leaf sheath of rice

3 討論

彎孢屬真菌可引發(fā)多種植物病害，包括禾本科玉米[24]和稻谷[25]、芭蕉科香蕉[26]以及番木瓜科番木瓜[27]等植物。近年來，也有彎孢屬真菌引起水稻葉部病害的報(bào)道[17-18]。本研究表明：2018 年海南陵水水稻南繁基地水稻成熟期發(fā)生的一種水稻新葉斑病是由新月彎孢菌(C.lunata)所引起，其葉片病斑癥狀與稻瘟病極其相似。對該病原生物學(xué)特性的研究表明：其孢子萌發(fā)、附著胞形成和菌絲擴(kuò)展速率都比稻瘟菌快，病程短，當(dāng)環(huán)境條件適宜，一旦病害發(fā)生，很容易在短時(shí)間內(nèi)大面積暴發(fā)，對水稻生產(chǎn)的潛在威脅是不可估量的。因此，對該病害發(fā)生范圍、危害程度、流行趨勢和潛在威脅進(jìn)行全國范圍內(nèi)的全面系統(tǒng)調(diào)查已勢在必行。此外，由新月彎孢菌引起的水稻葉片病害癥狀與稻瘟病極度相似，兩者極易混淆，影響病害的正確防治，為此，本研究對新月彎孢菌和稻瘟菌侵染水稻的生物學(xué)特性和葉部病害癥狀進(jìn)行了系統(tǒng)的比較研究，明確了區(qū)別稻瘟病和由新月彎孢菌引起的水稻葉斑病的典型癥狀，研究結(jié)果對水稻病害的識(shí)別和防治具有重要意義。

由于彎孢屬引起水稻葉片病害，近幾年才有少量報(bào)道，其潛在危害并未引起重視，目前水稻育種目標(biāo)也沒有把該病害列入考慮。本研究對新月彎孢菌致病性的初步研究表明：新月彎孢菌對接種的13 種水稻材料(包括水稻生產(chǎn)上大面積推廣種植的品種以及水稻育種中廣泛使用的高抗稻瘟病和白葉枯病的親本材料)都有較強(qiáng)的致病性，是否存在該病害的抗性水稻資源還有待進(jìn)一步的資源抗性鑒定研究。

目前，水稻生產(chǎn)上最具威脅的稻瘟病多由培養(yǎng)特性不同、遺傳基礎(chǔ)存在差異的菌株復(fù)合侵染引起[20]。本研究表明：相較于稻瘟病，由新月彎孢菌引起的水稻新病害病程周期更短，發(fā)生發(fā)展更快，預(yù)防難度更大。然而，從2018 年海南采集的不同田間病樣上分離的30 株單孢菌株具有相似的培養(yǎng)特性，暗示目前田間新月彎孢菌株遺傳組成較單一，相關(guān)抗性水稻資源鑒定及育種應(yīng)用對該病害的預(yù)防將非常經(jīng)濟(jì)有效。為此，加強(qiáng)抗性資源的鑒定和應(yīng)用研究，對有效預(yù)防新月彎孢菌引起水稻新病害的流行、減輕對水稻生產(chǎn)的潛在威脅非常重要。

4 結(jié)論

2018 年海南南繁基地稻田發(fā)生水稻葉斑病的病原為子囊菌門(Ascomycota)座囊菌綱(Dothideomycetes)格孢腔菌目(Pleosporales)格孢腔菌科(Pleosporaceae)彎孢屬(Curvularia)新月彎孢(C.lunata)。其典型癥狀是在水稻葉片上形成較大的近圓形或橢圓形褐色病斑，病斑分2 層，中央為褐色。對鑒定的13 個(gè)水稻品種均有較強(qiáng)的致病性。侵染水稻的生物學(xué)過程與稻瘟病菌相似，但從分生孢子萌發(fā)到菌絲擴(kuò)展過程所用的時(shí)間更短。